Discusión La regeneración es un proceso complejo

que requiere la activación y el funcionamiento coordinado de distintos mecanismos moleculares, cuya regulación ha de estar finamente controlada. En este trabajo nos hemos centrado en el análisis del perfil de expresión génica durante la regeneración del corazón y de la aleta en el pez cebra, con el fin de identificar y estudiar la función de nuevos genes implicados en ambos procesos.

a

1.

.

Al comenzar este trabajo en el laboratorio no teníamos ninguna experiencia previa con el pez cebra. Tampoco habíamos trabajado anteriormente en el campo de la regeneración. Por ello, una parte importante del tiempo empleado en la realización de esta tesis se dedicó a poner a punto los modelos de regeneración de la aleta y del corazón en el pez cebra, así como las técnicas experimentales utilizadas. El modelo de regeneración de la aleta caudal había sido descrito con anterioridad, era fácilmente reproducible y existían varios trabajos al respecto. Sin embargo, al comienzo de esta tesis únicamente se habían publicado dos trabajos relativos a la regeneración del corazón en pez cebra (Poss et al., 2002b; Raya et al., 2003). Hemos sido capaces de establecer los modelos de amputación de la aleta y del ápice del ventrículo del corazón. Hemos utilizado estos modelos para analizar los perfiles de expresión génica durante la regeneración del corazón y de la aleta, con objeto de identificar nuevos genes que pudieran jugar un papel relevante en estos procesos.

La regeneración de la aleta se completa en un plazo de 7-10 días, y su última fase es el crecimiento regenerativo, que comienza en torno a las 36-48 hpa (Poss et al., 2003). Hemos analizado el perfil de transcripción a 12, 24, 48

y 72 hpa porque examinando estos tiempos nos centrábamos en las fases iniciales del proceso, a la vez que abarcamos las 3 fases en las que se divide la regeneración de la aleta (Poss et al., 2003). De los 4 puntos analizados, únicamente el último correspondía claramente a la fase de crecimiento regenerativo.

Por la misma razón, hemos elegido 12 hpa, 1, 3 y 7 dpa para analizar el transcriptoma de la regeneración del corazón. En este tejido, el proceso se completa en 30 días y se ha observado una fase de proliferación máxima en torno a los 14 dpa (Poss et al., 2002b). En nuestro análisis, al igual que para el caso de las aletas, nos estábamos centrando en las primeras fases porque pensamos que es cuando tiene lugar la señalización encargada de detectar el daño y disparar el proceso. Creemos que los tiempos analizados en el caso del corazón se corresponden aproximadamente con los de la regeneración de la aleta. En las primeras 24 horas tiene lugar la detección del daño y la activación de los mecanismos regenerativos. Cabe la posibilidad de que al igual que ocurre en el primordio de la aleta de las larvas (Niethammer et al., 2009; Rieger and Sagasti, 2011), exista un mecanismo dependiente de peróxido de hidrógeno, si bien es cierto que no hemos abordado esta cuestión en nuestro estudio. Al respecto sólo podemos decir que la oxidasa dual, una de las enzimas requeridas y responsables del establecimiento del gradiente de H₂O₂ (Niethammer et al., 2009; Rieger and Sagasti, 2011), no estaba entre los genes representados en el microarray. Por otro lado, estaba y hemos identificado en el microarray uno de los genes propuesto como candidato a disparar el proceso a través de la señalización por ácido retinoico,

raldh2 (Kikuchi et al., 2011b). Hemos visto que raldh2 se expresaba muy tempranamente tanto

en la regeneración del corazón como de la aleta, y hemos validado su implicación funcional mediante el uso de inhibidores farmacológicos y de un MO, durante la regeneración de la aleta. El papel de raldh2 será discutido más adelante en esta misma sección.

Discusión

1.1

Análisis

conjunto

de

las

regeneraciones del corazón y de la

aleta.

Hemos identificado en el análisis de los resultados del microarray 308 transcritos que estaban presentes en todos los tiempos (incluidos los controles), que cambiaban en el menos 3 de los cuatro tiempos en cada proceso regenerativo y que fuera al menos en uno de ellos ≥+1 o ≤-1 en base logarítmica 2. Somos conscientes que de esta manera podemos no haber detectado gran cantidad de genes que comunes a los dos procesos de regeneración, pero que sólo cambien en uno o dos de los puntos analizados. Sin embargo, también podemos argüir que la identificación de genes cuya expresión solo cambiase en 1 ó 2 puntos de los 4 era a priori, menos interesante. Es cierto que no creemos que nuestros criterios de búsqueda sean los más adecuados para identificar genes específicos de una única fase de la regeneración ( utilizando las fases de la aleta, ya que para el corazón aunque sea un proceso similar, no se han descrito ”fases”). Creemos que la gran mayoría de genes identificados están implicados en al menos dos de las fases de la regeneración de la aleta.

Cabe señalar el hecho de que al hacer el análisis ontológico de los 308 genes identificados y compartidos entre ambos procesos, hayamos encontrado una gran cantidad de genes de la matriz extracelular y de respuesta a estrés. En el caso de estos últimos, todos estaban aumentados en todos los tiempos en el microarray. Parece obvio que los genes de respuesta a estrés estén inducidos tras sufrir una amputación, ya sea de la aleta o del ápice del ventrículo. Con respecto a los genes relacionados con la matriz extracelular, podemos decir que ésta juega un papel muy importante durante los dos procesos. Se sabe que la matriz extracelular no es únicamente importante para el establecimiento de un armazón sobre el que migren o crezcan los distintos tipos celulares, si no que también tiene un papel señalizador que regula el proceso de reparación de heridas y de cicatrización (Schultz et al.; Widgerow, 2011; Yates et al.).

Hemos visto que los 308 genes pueden agruparse en cuatro grandes grupos atendiendo a su patrón temporal de expresión. El grupo más numeroso era el formado por genes cuya expresión aumentaba durante ambos procesos. Esto indicaba que se requiere su acción durante el proceso y que estarían desempeñando funciones parecidas en ambos. Es por eso que los genes que hemos validado se encuentran en su mayoría en este grupo. De los grupos restantes uno estaba formado por genes cuya expresión estaba disminuida tanto en la regeneración de la aleta como la del corazón. Esto sugiere que los genes incluidos en él no son requeridos durante el proceso. También pudiera ser que se necesite que no estén actuando para que la regeneración tenga lugar. Los otros dos grupos estaban formados por genes que se comportaban de manera distinta en la regeneración de la aleta y del corazón. En uno de ellos sus niveles de transcripción estaban aumentados en la regeneración del corazón y disminuidos en la de la aleta. En el otro ocurría exactamente lo contrario. En cualquier caso esto nos sugería que los genes estarían desempeñando funciones antagónicas.

1.2 Análisis in silico del transcriptoma

obtenido para la regeneración del

corazón.

Hemos analizado independientemente el perfil de expresión durante la regeneración del corazón y hemos identificado 818 genes presentes en todos los tiempos, cuya expresión cambia en al menos tres y que el cambio en base logarítmica 2 con respecto al control es al menos en uno de los 4 tiempos ≥1 ó ≤–1. De esta manera, hemos identificado 510 genes más que no habíamos identificado previamente en el análisis conjunto. Hay que destacar la presencia de numerosos genes pertenecientes a la homeostasis y al desarrollo del corazón, cuya transcripción disminuye durante el proceso. Estos resultados son compatibles con la observación de que los cardiomiocitos se desdiferencien durante el proceso para entrar en ciclo, proliferar y finalmente volver

Discusión