matriz extracelular. En mamíferos existen 18 subunidades αy 8 subunidades β que pueden dimerizar, formando hasta 24 heterodímeros distintos (Hynes, 2002). La unión de ligandos a integrina dispara señales desde el exterior al interior celular y viceversa, y regula distintos procesos dependientes de anclaje incluyendo migración, proliferación, diferenciación y supervivencia celular (Hynes, 2002; Takada et al., 2007). Integrina αV se puede unir a cinco subunidades β distintas (β1, β3, β5, β6 o β8) y reconocen ligandos que contienen Arg-Gly-Asp como fibronectina, vitronectina y osteopontina (Hynes, 2002; Takada et al., 2007). Itgα5 se une a fn1 y ambas están implicadas en el cierre de heridas (Bass et al., 2011). En el pez cebra se ha demostrado que durante el desarrollo itgα5 es necesaria para el mantenimiento de los límites entre somitos (Koshida et al., 2005) así como para el ensamblaje de la matriz extracelular en los límites entre tejidos a lo largo del cuerpo (Julich et al., 2009), y en la gastrulación para regular la asimetría corporal (Ablooglu et al., 2010). Además, en ajolote se ha visto que durante la regeneración de la extremidad se induce su expresión (Tsonis et al., 1997). También en pez cebra se ha visto que se induce su expresión durante la regeneración del nervio óptico (McCurley and Callard, 2010) y que se requiere para la remodelación de la vasculatura durante el desarrollo (van der Flier et al., 2010).
Validamos los resultados del análisis de microarrays mediante PCR cuantitativa y vimos que eran muy similares (Figura 16A y Figura 16B). Mediante ISH obtuvimos el patrón de expresión de itgα5 durante la regeneración de la aleta y del corazón ( Figura 16C y Figura16D). En el primer caso encontramos, tal y como nos indicaban tanto los resultados de los microarrays como los de PCR cuantitativa, que la expresión de itgα5 aumentaba a 12 hpa y se mantenía al menos hasta las 72 hpa. A 12 hpa se expresaba por toda la epidermis de la herida. A 24 hpa al igual que fn1b, itgα5 se expresaba a lo largo de la zona distal al plano de amputación así como en el espacio interradial subyacente (Figura 16C). A partir de las 24 horas y hasta las 72 hpa, itga5 se expresaba tanto en la zona que da lugar al
blastema, como en la zona más adyacente a los radios esqueléticos en formación/regeneración. En el corazón vimos que itgα5 se expresaba a 1dpa en los márgenes de la zona amputada en el miocardio compacto y en el límite o la unión entre el coágulo sanguíneo y el epicardio. También se transcribía en algunas células aisladas del miocardio y del endocardio en el interior del ventrículo. El patrón de expresión en el miocardio compacto no era ni uniforme ni continuo y aparecía como puntos o áreas aisladas entre sí (Figura 16D). Este patrón nos recordó mucho al que hemos descrito anteriormente para n1b. A 3dpa se mantenía este mismo patrón aunque se restringía en el endocardio y miocardio a los márgenes de la zona de la herida mientras. En el epicardio sin embargo se mantenía la expresión a lo largo de todo el órgano de manera punteada (Figura 16D). Posteriormente, a 7dpa y 14dpa, disminuía el dominio de expresión de itgα5 y quedaba restringida la expresión al límite entre el ventrículo sano y el ventrículo en regeneración(Figura 16D). En cualquier caso era un patrón punteado y no continuo y muy similar al de el de fn1b (Figura 15D).
Otro de los genes relacionados con la ECM que identificamos en el microarray fue
periostin. La expresión de periostin estaba
alterados en todos los tiempos a lo largo de la regeneración, tanto del corazón como de la aleta (Figura 6A). Nos llamó la atención que para los dos primeros tiempos analizados en cada proceso regenerativo, la expresión de periostin disminuía frente al control para después aumentar en los 2 siguientes puntos. Es decir, veíamos una represión de la expresión en los dos primeros tiempos para después, en los dos siguientes, ver una inducción.
Periostin es una proteína secretada de
90kDa implicada en adhesión y que se expresa en el periosteum del hueso, el ligamento peridontal, en células metastáticas de cáncer, en vasos dañados, y en células que están en transición epitelio-mesénquima (TEM) (Snider et al., 2009). Como proteína de la ECM que se asocia a áreas de fibrogénesis,
Resultados
ya sea ésta patológica o no, puede interactuar directamente con otras proteínas de la ECM como fibronectina, Tenascin-C, colágeno I/V y heparina. Además, puede servir de ligando para algunas integrinas y afectar a la capacidad migratoria de células cancerígenas y de hacer TEM (Snider et al., 2009). En mamíferos se ha observado que periostin induce la re-entrada en ciclo de cardiomiocitos diferenciados a través de la unión a integrinas y la señalización por PI3K y tras un infarto, mejora sensiblemente la remodelación ventricular, y hay una mayor angiogénesis (Dobaczewski et al., 2010; Kuhn et al., 2007; Snider et al., 2009). Recientemente, se ha observado que su expresión aumenta tras infarto de miocardio tanto en seres humanos como en ratones y que los ratones deficientes en
periostin tienen dañada la respuesta reparadora
(Shimazaki et al., 2008). Estos ratones mutantes muestran ruptura cardíaca como consecuencia
de una menor rigidez miocárdica. Este menor rigidez se debe a un menor número de células positivas para alfa actina de músculo liso, la formación deficiente de fibras de colágeno y a una reducida fosforilación de FAK (Shimazaki et al., 2008). En pez cebra, periostin se ha implicado en adhesión y diferenciación de fibras musculares (Kudo et al., 2004). También se ha visto en estudios parecidos al nuestro, que su transcripción aumenta durante la regeneración de la aleta (Padhi et al., 2004) y el corazón (Padhi et al., 2004; Sleep et al., 2010).
Hemos analizado mediante ISH el patrón de expresión de periostin durante la regeneración de la aleta y el corazón. Durante la regeneración de la aleta no detectábamos periostin hasta las 48hpa (Figura 17B), cuando se observaba en la zona del blastema por encima de los radios esqueléticos. A 3dpa se expresaba en el blastema distal, así como en el borde o frontera que limita
Figura 17. Periostin se expresa durante la regeneración de la aleta y del corazón. (A) Cuadro donde se muestran los resultados del análisis de los microarrays. La transcripción de periostin está disminuida en los dos primeros tiempos y aumentada en los dos últimos. Los cambios están expresados en base logarítmica. En todas los agrupamientos la escala colorimétrica empleada es la misma que en la Figura 12. (B) Patrón de expresión de periostin durante la regeneración de la aleta a 2 y 3 dpa. (C) Patrón de expresión de periostin durante la regeneración del corazón a 3 , 7 y 14 dpa (c=coagulo sanguíneo).