Materiales y Métodos

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m

,

1.

opeRacionesen elpezcebRa

Los peces cebra (Danio rerio) se han criado y mantenido bajo condiciones estándar: a 28º C y con ciclos de luz de 12 horas de duración. Todos los experimentos se llevaron a cabo con peces de entre 6 y 18 meses de edad. Las operaciones de amputación se hicieron según está descrito, tanto para el caso de los corazones (Poss et al.,2002a; Raya et al., 2003) como en el de las aletas (Poss y al., 2000a). Los crioinfartos se hicieron siguiendo el protocolo descrito en (Chablais et al., 2011; Gonzalez-Rosa et al., 2011; Schnabel et al., 2011) utilizando una sonda de cobre enfriada en nitrógeno líquido. En el caso de la regeneración de las aletas se pusieron los peces inmediatamente después de la operación en agua a 33º C donde se mantuvieron para que regeneraran durante 12, 24, 48 y 72 horas. Los peces a los que se les había amputado parcialmente el corazón o se les había infartado se mantuvieron en condiciones estándar. Pasado el tiempo de regeneración se sacrificaron y se extirparon las aletas y/o los corazones.

R

2.

extRacción de

Rna

Para obtener ARN de corazones y aletas en regeneración a diferentes tiempos, se sacrificaron los animales y se disecaron las aletas o los corazones. Las operaciones de recolección de los corazones y las aletas fueron realizadas en PBS limpio de RNAsas y a 4ºC. En el caso de los corazones se les quitó la zona más distal al plano de amputación así como el bulbo arterial y la aurícula. En el caso de las aletas cortamos 1 ó 2 segmentos esqueléticos por debajo del plano de corte. Para cada punto se utilizaron entre 12 y17 corazones y 8 -12 aletas. El material se congeló rápidamente en TRIzol (Invitrogen) y se guardo a –80ºC hasta el momento de hacer la extracción de ARN total. Esta se hizo siguiendo el protocolo del fabricante (Invitrogen) y a continuación se purificó el RNA total utilizando Rneasy Mini

Kit (Quiagen). Determinamos la cantidad y la calidad del RNA por absorbancia a 260nm y 280nm y con el Bioanalyzer 2100 de Agilent.

H

3.

micRoaRRays

La hibridación de los microarrays fue realizada por el servicio de Genómica del Centro Nacional de Biotecnología (CNB). El cRNA biotinilado fue sintetizado a partir de RNA total con el kit “ 3´ Amplification One-cycle Target labeling” (Affymetrix, Santa Clara, CA) y fue utilizado para la hibridación de los Zebrafish arrays de Affymetrix (Affymetrix, Santa Clara, CA). Se utilizaron 2 mg de ARN total por punto. La distribución de tamaños del cRNA se determino con el Bioanalyzer 2100 de Agilent. Posteriormente el cRNA fue fragmentado a 95ºC durante 35 minutos para obtener cadenas de 35 a 200 pb que se hibridaron con Affymetrix Zebrafish microarrays (Affymetrix, Santa Clara, CA) a 45ºC durante 16 horas. Cada microarray fue lavado y teido usando el Affymetrix Fluidics Station 450 y siguiendo los protocolos diseñados por Affymetrix. Finalmente se escanearon los microarrays en el Affymetrix GeneChip® Scanner 3000 7G.

El análisis se realizó utilizando el algoritmo MAS5 de Affymetrix. En el análisis conjunto de la regeneración de la aleta y el corazón se seleccionaron aquellos genes que estaban presentes en todos los tiempos, que aparecían aumentados o disminuidos también en todos los tiempos (4 tiempos) con respecto al control, y donde el cambio era en al menos uno de ellos con un ratio (log2) mayor o igual a 1 ó menor o igual -1.

En el análisis independiente de la regeneración del corazón se seleccionaron aquellos genes que estaban presentes en todos los tiempos, aparecían aumentados o disminuidos en al menos 3 de los 4 tiempos con respecto al control y con un ratio (log2) mayor o igual a 1 ó menor o igual -1 para la menos uno de ellos.

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En el análisis independiente de la regeneración de la aleta se siguieron los mismos criterios de selección que en el caso anterior (análisis independiente de la regeneración del corazón).

El análisis por clustering jerárquico se realizó con el Multiexperimental Viewer (TIGR) y con Spotfire®. El análisis funcional y de Ontología se realizó con DAVID (http://niaid. abcc.ncifcrf.gov/)y GeneOntology mining tool (Affymetrix).

pcR

4.

Se recolectaron corazones y aletas y se extrajo el ARN total de la manera que hicimos para la hibridación de microarrays (ver más arriba). Sintetizamos cDNA a partir de RNA total de corazones y/o aletas utilizando First Strand Síntesis Kit (GE Healthcare) siguiendo el protocolo del fabricante y usando los oligos “random” (oligos de 6 bases de longitud y secuencias al azar) que proporciona el fabricante. La cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR)

Fibronectin -1a Directo AGAGGGATCACCTGCCATC

Fibronectin -1a Reverso GTGGTGCCCACATCAGAGA

Fibronectin -1a Directo CGCAATACATCCTGAAGTGG

Fibronectin -1b Reverso GTTGATGTGGCCAGGAATG

Integrina alfa 5 Directo GTGGCGATTCTAGCTGGTCT

Integrina alfa 5 Reverso CCGTATGGAGTTCGCTTGA

CTGF Directo GTCTCGCCTTTGCATGGT

CTGF Reverso GATGCATTTTTCCCTTTCCT

Keratina 18 Directo GCCAATCGTTGATGAGCTG

Keratina 18 Rverso AGCACTAGGCGAGCATTGTT

JunB Directo CGCTGAAACTGGCCTCTC

JunB reverso ATGACGCCGTTAACCGTTCT

JunB-like Directo GCGACGGGACTTTCACTAAA

JunB-like Reverso CGTTCAGTTGTCGAACAAACA

Hyuo1 Directo TTTAGCAGTCAACAGGAACCAA

Hyuo1 Reverso TGACAGCTTTTCCCTCATTGT

Midkine-a Directo TGGAGAAGAGTGAACACAGCA

Midkine-a Reverso ACGAGGAGGGTGGAAACA

Caveolina-1 Directo TCATCTGATCGCACTTCAGG

Caveolina-1 Reverso TAAACGGCGAGTGAGCGTAT

Pescadillo Directo GAACTTACTATCTGCTGAAAGACATCC

Pescadillo Reverso GCAGCTTCCGGACAAAGAT

Sal-like1 Directo CCTAGCCGAGCACAATGG

Sal-like1 Reverso TGGTGTTGTTCAAGATCCGATA

Sox11a Directo TCCAGGGAATCTCTCCCTCT

Sox11a Reverso GCTGCCCTCGCTAAAAGAC

Sox11b Directo CATTGCGCATCTTCAGGTTA

Sox11b Reverso CCGTCTAAACCGGGACAAC

GADPH Directo ACACTCACCCAAGTGTCAGGA

GADPH REverso CGACCGAATCCGTTAATACC

Beta Actina 1 Directo GATCTTCACTCCCCTTGTTCA

Beta actina 1 Reverso GGCAGCGATTTCCTCATC

Tabla 1. Secuencia de los oligonucleótidos usados en la qPCR.

La temperatura de anillamiento utilizada en todos ellos fue de 60ºC y el tamaño del amplicón varíaba entre los 75 y 115 nucleótidos.

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