Los métodos de fraccionamiento se emplean cada vez con mayor amplitud en el Laboratorio Clínico, tan- to en el trabajo asistencial como en la investigación. En general, se aprovechan determinados fenómenos físi- cos para separar distintos componentes presentes en las muestras: la migración en un campo eléctrico, en el caso de la electroforesis; la adsorción o diferencia de afinidad, en el caso de la cromatografía; y la fuerza de la gravedad, en el de la centrifugación.
ELECTROFORESIS
Se entiende por electroforesis, la migración de una partícula cargada, en un medio a través del cual circula una fuerza electromotriz. En el caso de las proteínas, es necesario tener en cuenta el pH del medio, pues a deter- minado valor de este, no tiene lugar la migración. Este valor de pH recibe el nombre de punto isoeléctrico y varía de una proteína a otra. La intensidad de la fuerza electromotriz es otro factor crítico a tener en cuenta; la
Capítulo 5. Análisis instrumental
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Capítulo 5. Análisis instrumental
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corriente debe ser directa (no alterna) y se puede traba- jar a un voltaje o amperaje constantes. El equipo em- pleado para lograr la conversión de corriente alterna en corriente continua tiene como elementos fundamentales un rectificador de germanio o selenio, un miliamperímetro, un reóstato transformador y una impedancia, y recibe el nombre de fuente rectificadora o fuente de poder. El factor tiempo, es decir, la duración de la corrida electro- forética se estandariza en dependencia de la técnica y del equipo empleado.
La electroforesis que más se emplea en el labora- torio clínico (conocida como electroforesis de zona) tiene lugar en una cubeta que contiene una solución tampón, y se emplean diversos soportes como el papel de filtro, el acetato de celulosa, los geles de agar, de almidón y de poliacrilamida. El papel de filtro fue en otros tiem- pos el más difundido, pero se reveló insuficiente para un fraccionamiento más fino del conglomerado proteico, por lo que debió ser sustituido por sistemas físico-químicos como los geles, que actúan cual filtros moleculares. Además, la migración en papel se encuentra sometida a factores tales como: evaporación, capilaridad, elec- troendósmosis, acción del potencial, trama y calidad del papel. Casi todos estos factores se obvian con el empleo del acetato de celulosa, mientras que los geles permiten lograr fraccionamientos con una excelente resolución y separación en un tiempo muy corto, ade- más del ya mencionado efecto de tamiz molecular. La electroforesis en gel de poliacrilamida permite aumen- tar el fraccionamiento de mezclas proteicas y combi- nar el fenómeno de la migración con el de ultrafiltración molecular, al poder obtener geles sintéticos con trama de poro efectivo que puede ser ajustada a voluntad. La corrida se efectúa en tubos o placas de gel, ubicados de manera vertical. La muestra se introduce en la zona de poro grande, se concentra en la zona intermedia y se separa en la zona de poro fino, por la acción del tamiz molecular. En la preparación de la solución tam- pón, se diferencian un ion rápido (con movilidad mayor que la de cualquier proteína) y un ion de arrastre (con movilidad inferior a cualquiera de estas); con ello se logra un gradiente de voltaje y uno de pH.
La valoración de la intensidad de color sobre la tira del proteinograma, sin destrucción de este, se logra em- pleando el densitómetro, que mide por transparencia o por reflexión la intensidad de la zona coloreada. El apa- rato está constituido por una fotocelda a la que llega un haz de luz proveniente de una fuente luminosa, la cual es delimitada antes por un colimador. Su paso a través
de la tira determina la absorción de luz en relación pro- porcional con la cantidad de colorante fijado a la proteí- na, lo cual se expresa de manera gráfica en una curva. En la actualidad, se cuenta con densitómetros de rayos láser, acoplados a microprocesadores o a una computadora con programas de aplicación específicos.
CROMATOGRAFÍA
En 1903, el botánico ruso Tswett logró separar los pigmentos de plantas, empleando una columna de vidrio rellena con carbonato de cal y fluyendo los pig- mentos ya separados con éter de petróleo. El proce- dimiento recibió el nombre de cromatografía y se define como un método físico de separación de los compo- nentes de una mezcla, en el que las sustancias que se van a separar se distribuyen entre dos fases: una móvil (líquida o gaseosa) y una estacionaria (sólida o líqui- da) de acuerdo con un proceso de equilibrio. Uno de los componentes de la mezcla se retiene con más fuer- za por la fase estacionaria que los otros, y se desplaza, por tanto, con más lentitud; es decir, la separación se lleva a cabo por la diferencia entre los distintos tiem- pos de retención en el lecho cromatográfico.
La fase móvil es una corriente líquida o gaseosa que fluye, de modo continuo, a través de la fase esta- cionaria, que permanece fija durante el proceso y que puede aplicarse en forma de placa o lámina (croma- tografía planar), o utilizarse para rellenar una columna de plástico, vidrio o metal (cromatografía de columna). En este último caso, puede emplearse un adsorbente poroso (cromatografía de adsorción) o un gel con de- terminada distribución de poro (cromatografía de afini- dad), partículas sólidas activadas o inertes, recubiertas de residuos polihidrocarbonados (fase reversa) o de grupos iónicos (intercambio iónico). Estas tres últimas variantes reciben, en conjunto, el nombre de croma- tografía de reparto.
Cromatografía planar. Tiene dos modalidades, la
de capa fina (aparecida en 1930) y la de papel (1944). En ambas, la fase estacionaria es una lámina más o menos delgada, a través de la cual la fase móvil se mueve y asciende por capilaridad. En el caso de la capa fina (TLC), se trata de una película de silica gel, que se aplica sobre una placa de vidrio; en cuanto a la otra variante, se trata de un papel de filtro de tipo cromatográfico. La muestra se “siembra” a escasa dis- tancia del borde inferior de la lámina y se deja arras- trar por el flujo ascendente de la fase móvil. Cuando termina la corrida, se deja secar y se efectúa el revelado.