Estudio de interacción de la N,N´,N´´triacetilquitotriosa con la WGA

En primer lugar, se estudió la interacción de WGA con quitotriosa, ligando conocido de lectinas con domino heveína en general [11] y de la WGA en particular [21], como control positivo de la aproximación experimental basada en experimentos de STD. Para ello se preparó una solución stock de quitotriosa 15 mM en agua deuterada.

La quitotriosa, con el extremo reductor libre, está presente en solución acuosa en equilibrio entre ambos anómeros  y  en proporción 60:40 a favor del anómero . Se adquirieron los correspondientes espectros de referencia de una muestra de quitotriosa libre (2mM) para comprobar la no existencia de señales de STD inespecíficas en ausencia de proteína. Los espectros se registraron a dos frecuencias de saturación: 100 ppm (frecuencia off- resonance) y 7 ppm (frecuencia on-resonance en la zona aromática donde el ligando no presenta ningún protón no intercambiable). Se preparó otra muestra de quitotriosa (1mM) en presencia de WGA (en relación molar

100:1) y se registraron los correspondientes espectros off-resonance y on-resonance con las mismas frecuencias de irradiación (Figura 3.7).

Figura 3.71_{H RMN (500MHz a 25ºC pH=6 en D}

2O) de los experimentos STD para la interacción de la

proteína WGA con la quitotriosa.

Analizando los resultados desde el punto de vista del ligando, se observaron cambios en las intensidades de las señales de los metilos cuando se irradiaban los protones de la proteína que tienen un desplazamiento químico en la zona aromática (cadena laterales de los residuos aromáticos). La tabla 3.1 se muestran los valores de STD obtenidos para cada protón, principalmente en la zona de desplazamiento químico de alrededor de 2 ppm, correspondiente a los metilos del triacetilquitotriosa (Figura 3.7).

Tabla 3.1 Desplazamientos químicos de los diferentes protones de la N,N’,N’’-Tri-acetilquitotriosa en un

espectro 1H de RMN a 25ºC en 500MHz junto con sus valores correspondientes de STD en presencia de la WGA.

Protón (residuo) Desplazamiento Químico Intensidad de STD Porcentaje Normalizado H1(2) ,H1(3) 4.52 ppm 5.8 60% H2, H2(2), H2(3), H3, H5, H6 3.75-3.88 ppm 4.5 46% H2, H3, H3(2),H6 3.75-3.65 ppm 8.6 89%

H3(3),H4, H4, H4(2), H5, H5(2) 3.55-3.65 ppm 5 52%

H4(3), H5(3) 3.55-3.35 ppm 7 72%

CH3(2), CH3(3) 1.99-2.02 ppm 5.7-9.7 59%-100%

CH3(1)  y  1.95-1.99 ppm 1 10%

En base a los espectros ROESY y TOCSY del ligando disuelto en agua (con 10% D2O) adquiridos a 600MHz (Figura 3.8), fue posible diferenciar, gracias a las correlaciones con los HN de los grupos acetamido, las señales correspondientes a los metilos de dichos grupos de los residuos 2 y 3 (1,89-1,92 ppm) de las señales correspondientes al residuo del extremo reductor (tanto del anómero alfa como beta que solapaban a 1,875 ppm). Sin embargo, no fue posible diferenciar inequívocamente las señales de los metilos de los residuos 2 y 3 a pesar de que se diferenciaban ligeramente en el espectro monodimensional (Figura 3.7).

Figura 3.8 Superposición del espectro 1_{H RMN de una muestra de quitotriosa en H}

2O/10% D2O con su

correspondiente espectro Roesy registrados a 25ºC en un campo de 600MHz. En negro se muestran los picos de correlación ROESY HN-CH3 y en rojo los picos diagonales correspondientes a los grupos metilo.

A partir de los resultados de transferencia de saturación de la WGA a los protones de la quitotriosa se pueden proponer las zonas del ligando que están más cerca de de la proteína (epítopo) [36]. Los grados de saturación se calculan mediante la resta de las intensidades de las señales en el espectro de on-resonance del espectro de referencia off- resonance (espectro diferencia, STD). Cada señal del espectro de diferencia se compara con el espectro de referencia off-resonance y se normaliza, dando el 100% a la señal que

recibe la máxima saturación. En la figura 3.9 se representan en forma de mapa cualitativo los valores normalizados de la saturación transferida.

Figura 3.9 Representación del grado relativo de saturación de cada protón de la estructura de la

quitotriosa, abajo anómero arriba anómero El color rojo indica un porcentaje superior o igual al 70%, mientras que el rojo transparente indica un porcentaje entre el 50 y el 70% y el amarillo un porcentaje por debajo del 50%.

El análisis de los epítopos obtenidos de los experimentos de STD de la quitotriosa en presencia de la WGA muestra que la mayoría de los protones de los residuos de GlcNAc 3 y 2 del extremo no reductor de la quitotriosa reciben una saturación significativamente superior al residuo de GlcNAc del extremo reductor. Este hecho se observa inequívocamente en los grupos metilo de los residuos 2 y 3 (entre 6-10%), respecto del metilo del residuo del extremo reductor 1 (1%). De hecho, a la vista de los

dos modos de unión de la figura 3.5 se observa que en el modo A, el metilo del grupo acetamido del residuo 3, situado sobre el subsitio +1, queda encajado dentro del sitio de unión, estableciendo interacciones de tipo CH-pi con el residuo aromático en posición 30. En el caso del modo B, es ahora el metilo del residuo 2 el que queda encajado frente al anillo aromático 30. Sin embargo, en ambos modos, el metilo del extremo reductor 1 queda alejado de la superficie de la proteína. Adicionalmente, también se observan diferencias en la distribución de las intensidades relativas de saturación entre los protones de los dos anómeros  y . El trisacárido con configuración  recibe claramente menos saturación en los protones H-2, H-3 y H-5 del anillo de piranosa que el correspondiente trisacárido en configuración Este resultado sugiere que la interacción del residuo de la quitotriosa con la WGA puede ser distinta dependiendo de la conformación del anómero, siendo desfavorecida la configuración . Por lo general, se había supuesto que los dominios de heveína interaccionan preferentemente con el extremo no reductor de los oligómeros de la quitina [25, 37]. Sin embargo, resultados de nuestro grupo indican que el reconocimiento de la quitina por heveína implica un sitio de unión más extendido en el que oligómeros de más de dos residuos pueden adoptar distintos modos de unión por desplazamiento de las unidades de GlcNAc (Figura 3.5) [5]. Estudios cristalográficos [20, 26-27] y de RMN [5, 11, 29, 38-41] han mostrado que la unidad de GlcNAc del extremo reductor en la posición +2 contribuye a la estabilidad del complejo mediante una interacción CH-pi entre el azúcar y el anillo aromático en posición 21 (numeración relativa a la heveína, figura 3.3). Esta interacción se ve favorecida en el caso de la conformación anomérica beta, como se muestra en los estudios de reconocimiento de oligosacáridos cortos (GlcNAc)2-3, tanto libres o con la posición anomérica bloqueada [29, 40], lo que es esperable para el polisacárido de quitina, que tiene todas sus uniones beta. Sin embargo, si el residuo de la posición +2 se presenta en configuración alfa, el hidroxilo de la posición anomérica apunta sobre el anillo aromático de la posición 21 y ejerce un efecto desestabilizador en la interacción.