INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES

Las plantas sintetizan una amplia gama de proteínas capaces de unirse reversiblemente a matrices compuestas por quitina y otros oligosacáridos estructuralmente relacionados a los lipoquitooligosacáridos. Los dominios heveína contienen un motivo estructural común de 30-43 aminoácidos con varias cisteínas y glicinas en posiciones altamente conservadas (Figura 3.3). Este motivo se reconoce como un dominio de unión a quitina con capacidad de mantener uniones reversibles. Aunque el término “proteínas de unión a quitina” indica la familia de proteínas que contienen uno o más dominios de unión a quitina. No obstante, la especificidad de unión de estas proteínas no se limita a la quitina, sino que puede extenderse a otros glicoconjugados complejos que contienen GlcNAc, NeuNAc o el peptidoglicano.

Los dominios de heveína están presentes en varias lectinas de manera aislada, como en la propia heveína y en su variante natural, la pseudoheveína. También se encuentran aislados en péptidos antimicrobianos (Ejemplo del péptido antimicrobiano Ac-AMP de

Amaranthus caudatus), pero también se pueden encontrar en forma de repeticiones

múltiples como en la WGA, con 4 repeticiones de un dominio heveína (Figura 3.2), o la

urtica dioica agglutinin (UDA) con dos repeticiones. Este motivo de unión a quitina

también se puede encontrar formando parte de proteínas con otras funcionalidades como las enzimas quitinasas de la clase I [10].

El dominio de heveína se ha convertido en una poderosa herramienta en varios campos de la investigación biológica y sus propiedades de lectina se han estudiado extensivamente en el campo de glicobiología [11]. Su actividad como proteína de defensa de plantas ha sido el enfoque de interés en biología vegetal [9][12]. Sus posibles aplicaciones en biotecnología se han enfocado a incrementar la resistencia hacia los

hongos, transformando las plantas con genes que codifican el dominio heveína [13-14] y en biomedicina como un agente antimicrobiano [15].

La proteína de unión a quitina con múltiples dominios heveína mejor caracterizada es la WGA presente en las semillas del trigo que reconoce oligosacáridos derivados de GlcNAc y residuos de NeuNAc en el extremo no reductor. Se han descrito sus propiedades antimicrobianas, ya que es capaz de inhibir el crecimiento de hongos a través de la interacción con los componentes de sus paredes celulares [5, 16-18]. Por otro lado, también es capaz de aglutinar células transformadas in vitro [19]. La WGA forma un homodímero de 36 kDa estable con un doble eje de simetría [20-22]. Cada cadena polipeptídica se presenta por cuatro dominios de heveína de 43 (A-D) en posiciones altamente conservadas y organizadas alrededor de un núcleo de cuatro enlaces disulfuro (Figura 3.2). Mediante cristalografía de rayos X y RMN se han caracterizado los sitios de unión a carbohidratos de complejos con la sialillactosa (Neu5Ac-(2,3)-Gal-(1,4)-Glc) [23] y sialoglicopéptidos [24] y otros disacáridos relacionados con la N-Acetilglucosamina, N,N¢-diacetil quitobiosa (GlcNAc-(1,4)- GlcNAc) [21, 25], GlcNAc-(1,6)-Gal y GlcNAc-(1,6)-Gal-(1,4)-Glc [26]. Recientemente, mediante el uso de ligandos divalentes ha sido posible demostrar la funcionalidad simultanea de los ocho sitios de unión del dímero de WGA (cuatro sitios en cada monómero debido al eje de simetría doble) [27]. Desde el punto de vista del carbohidrato, en nuestro grupo de trabajo, se ha demostrado que las cadenas N- glicánicas de glicoproteínas pueden ser reconocidas por los dominios heveína, no solo por su extremo no reductor, sino también por las N-acetilglucosaminas del “core” de las cadenas de N-glicano [28].

Figura 3.2 Imagen estructural del heterodimero de la proteína WGA en complejo con GlcNAc (código

Los anteriores estudios cristalográficos juntos con estudios estructurales por RMN de diversos dominios heveína en complejos con oligosacáridos de quitina han permitido determinar que, en estos dominios, los residuos aromáticos en las posiciones relativas (numeración según la secuencia de la heveína) 21, 23 y 30 se conservan en todos los dominios heveína (Figura 3.3) y juegan un papel clave en la unión con los carbohidratos. De hecho, permiten la estabilización del complejo a través de apilamientos carbohidrato-aromático, interacciones de van der Waals y enlaces de hidrógeno, como se muestra en la figura 3.4 [11]. El grupo hidroxilo de la serina 19 forma un enlace de hidrogeno con el carbonilo del grupo acetamido de una unidad de GlcNAc, y al mismo tiempo, el grupo metilo de este acetamido interactúa con el anillos aromático de la cadena lateral del residuo 30. También existe un enlace de hidrogeno entre el grupo hidroxilo de la Tyr 30 de la heveína con el OH-3 de la misma unidad de azúcar mencionada anteriormente.

Figura 3.3 Alineación de las secuencias de amino ácidos de la Heveína, Pseudoheveína, WGA dominio B

y UDA dominio A. En negrita se indican los a.a que participan en el sitio de unión.

Figura 3.4 Interacciones proteína-carbohidrato que regulan el reconocimiento de la quitobiosa por la

Heveína, tal como se determina por RMN. Las líneas discontinuas representan enlaces de hidrógeno que se establecen entre el azúcar y los residuos polares de la proteína (S19 y Y30). Las líneas continuas indican las interacciones CH- .

Estudios previos [11, 18, 29-30] propusieron un sitio de unión extendido en el dominio heveína, capaz de alojar varias unidades de GlcNAc, permitiendo dos modos de unión para el triacetil quitotriosa (GlcNAc)3.

Hay un primer modo de unión en el que se coloca el residuo GlcNAc terminal no reductor en el llamado subsitio +1, interaccionando con el Tyr 23 (CH- ), con la Ser 19 (enlace de hidrógeno) y con la Tyr 30 (CH3-CH- y enlace de hidrógeno). El residuo intermedio se encuentra en el subsitio +2, interaccionando con el Tyr 21 (CH- ), mientras que el residuo GlcNAc reducido proporciona muy pocos contactos con la lectina, en el subsitio +3 (Figura 3.5-a) [11].

En la segunda orientación, el residuo del extremo reductor se coloca en el subsitio +2, interaccionando con el Tyr 21, el residuo intermedio se coloca en el subsitio +1, interaccionando con el Tyr 23 (CH- ), Ser. 19 (enlace de hidrógeno) y con la Tyr 30 (CH- y enlaces de hidrógeno), mientras que el extremo terminal no reductor muestra algunos contactos con la lectina en el llamado subsitio -1 (Figura 3.5-b) [5, 29].

Figura 3.5 Representación estereoscópica de los dos modos de unión de la quitotriosa en el dominio B

de la WGA descritos por Espinosa y col. [30] y determinados por RMN. El ligando se presenta en color verde numerándose los residuos desde el extremo reductor mientras que los anillos aromáticos de la proteína que participan en la interacción se presentan en color rojo numerándose tres subsitios de unión como -1, +1, +2.

Debido al hecho de que la quitina es el componente principal en la pared celular de los hongos y los exoesqueletos de los invertebrados, la función de defensa de las plantas y de las actividades antifúngicas de este tipo de péptidos se ha asociado con su carácter lectina como ligando de quitina [31]. Sin embargo, la descripción de las actividades antimicrobianas frente a otros microorganismos que no contienen quitina obliga a encontrar y caracterizar otros mecanismos de acción [31-32]. De hecho, en algunos casos, la actividad antimicrobiana se ha asociado al carácter policatiónico de algunos de estos péptidos [33]. Curiosamente, aunque el componente polisacárido del peptidoglicano bacteriano está muy relacionado con la quitina, hay escasos estudios que muestran la interacción directa entre oligosacáridos derivados de peptidoglicanos y proteínas con dominio heveína [6, 34] y no se han descrito datos de tipo estructural. Algunos ejemplos poco concluyentes han postulado una posible interacción. Por ejemplo, Lotan y col. [6] dedujeron que oligosacáridos complejos (di, tetra), derivados del peptidoglicano eran capaces de inhibir la hemaglutinación. Otros autores, como Ayouba y col. [4] mostraron otras evidencias de interacción en el caso de la aglutinina con dos dominios heveina extraída de la ortiga ("Urtica Dioica Agglutinin", UDA) A pesar de esta escasez de información, hay que decir que la WGA se comercializa como un reactivo para histoquímica con aplicación para teñir bacterias gram-positivas (por ejemplo reactivo Alexa Fluor® 488 conjugate of WGA en MolecularProbes [35]), ya que muestra capacidad de reconocimiento del peptidoglicano bacteriano.