LAS INTERACCIONES ENTRE CARBOHIDRATOS Y PROTEÍNAS 1 Enlaces de hidrogeno

Los carbohidratos son moléculas polihidroxiladas y, por tanto, tienen una gran potencialidad para establecer enlaces de hidrógeno tanto como donadores o aceptores. De hecho, los enlaces de hidrogeno son elementos esenciales en la interacción entre proteínas y carbohidratos [26-27]. El oxígeno de los grupos hidroxilo (-OH), con hibridación sp3_{, tiene una disposición aproximadamente tetraédrica de dos pares de} electrones y un protón. Los OHs, por lo tanto, pueden actuar como un receptor de dos enlaces de hidrógeno, y como donante de uno solo [28-29]. Adicionalmente, hay que mencionar que el enlace de hidrógeno cooperativo, donde el grupo hidroxilo (OH) actúa simultáneamente como donador y aceptor de enlace de hidrógeno, es característico de la interacción de las lectinas y otras proteínas que se unen a los hidroxilos de azúcares [26]. En general, las cadenas laterales ácidas en proteínas pueden actuar como aceptores de enlaces de hidrógeno, a partir de uno o dos OHs del azúcar. Los donantes de enlaces de hidrógeno provienen principalmente de los grupos amida de la cadena principal o del grupo amida de cadenas laterales de asparagina y, menos frecuentemente, de glutamina. También, aunque es menos común, los OHs de las cadenas laterales de tirosina, serina y treonina participan como donantes o aceptores de enlaces de hidrógeno con los OHs del

azúcar [30]. De este modo, el esquema de unión del hidrógeno más común relacionado con los OHs del azúcar es de tipo cooperativo, donde el grupo hidroxilo (OH) actúa simultáneamente como donador y aceptor de enlace de hidrogeno: (NH)n  OH  O = C; donde el NH es el grupo donador del enlace de hidrógeno, O = C es el carbonilo aceptor de la cadena principal de grupos carboxilato o carboxiamida, OH es un hidroxilo del azúcar, y n puede valer 1 o 2. La geometría del enlace de hidrógeno entre aceptores y donadores es fija, mientras que un OH tiene la libertad de torsión en la ubicación del protón y los pares no enlazantes. Presumiblemente, la libertad de rotación permite la optimización de los enlaces de hidrógeno entre el grupo OH y sus grupos vecinos, aunque con cierto coste entrópico, debido a los rotámeros preferentes del los grupos OH.

El átomo de oxígeno del anillo de azúcar también tiene hibridación sp3 y tiene dos pares de electrones en la geometría tetraédrica que pueden actuar como aceptores de enlaces de hidrógeno. Sin embargo, no puede participar en los enlaces cooperativos de hidrogeno. En general, este oxígeno es común en todos los azucares y, por tanto, no puede utilizarse para distinguir entre ellos. La presencia de otros grupos funcionales en carbohidratos como grupos carboxilo, acetamido y sulfato, amplía la diversidad de tipos de puentes de hidrógeno que pueden formar los carbohidratos en sus interacciones con proteínas. Los grupos acetamido de N-acetilglucosamina (GlcNAc), N- acetilgalactosamina (GalNAc), y N-Acetilneuramínico (NeuNAc) son un factor determinante para la selectividad en el reconocimiento de estos carbohidratos. Al contrario del grupo hidroxilo, el grupo amida y el oxigeno carbonílico del sustituyente acetamido tienen una geometría fija y plana. El grupo amida actúa como donador de enlaces de hidrógeno al carbonilo planar o a los oxígenos del carboxilato en todos los casos observados hasta la fecha, mientras que el oxigeno acetamido acepta con frecuencia los enlaces de hidrógeno por parte de la serina.

Desde el punto de vista termodinámico, hay que tener en cuenta que los enlaces de hidrógeno que se forman en la interacción carbohidrato-receptor deben, por un lado, compensar energéticamente la ruptura de los correspondientes enlaces de hidrógenos del carbohidrato con el agua del medio y, por otro, introducir los elementos de selectividad en el reconocimiento de unos carbohidratos y no de otros. En general, las funcionalidades del azúcar que forman enlaces de hidrógeno con las lectinas son las necesarias para el reconocimiento especifico y la discriminación, mientras que aquellas

posiciones que no se utilizan como elementos de reconocimiento tienden a estar más expuestas al disolvente, aunque pueden formar contactos indirectos con la proteína, por ejemplo, a través de moléculas de agua (Figura 1.9).

Figura 1.9 Representación de los diferentes enlaces de hidrogeno con sus correspondientes distancias en

Å de la -galactosa en el sitio de unión 2 de la cadena B de la viscumina (código PDB: 1PUM).

Los enlaces de hidrógeno entre las lectinas y los determinantes esenciales del reconocimiento del azúcar están habitualmente más protegidos del disolvente, lo que significa que están en un entorno dieléctrico bajo por los que sus entalpías de unión son previsiblemente más fuertes que las formados con el agua [31-32] Además, el uso de donadores y aceptores de enlaces de hidrógeno con geometría fija puede ser importante para la especificidad y para minimizar costes entrópicos. Por otro lado, un grupo con gran libertad de giro, como el OH de la serina, tiene cierta plasticidad/adaptabilidad para formar enlaces de hidrógeno con el azúcar [30, 33]. En este sentido, puede que no sea capaz de discriminar entre grupos hidroxilo epímeros de dos azucares distintos.

1.3.2 Interacciones CH-p

Ya se ha mencionado que los carbohidratos son moléculas polihidroxiladas. No obstante, además hay que decir que presentan superficies no polares, que contienen enlaces C-H. Por ello, tienen un carácter anfifílico y, en función de su naturaleza química, pueden mostrar superficies no polares capaces de interaccionar con residuos hidrófobos complementarios de Tyr, Phe y Trp. De este modo, los enlaces C-H

localizados en la misma cara del carbohidrato, próximos en el espacio, pueden participar en interacciones CH- con las nubes de las cadenas laterales de los aminoácidos aromáticos [34-35]. Las interacciones CH- son muy comunes en los sitios de reconocimiento de las proteínas que reconocen los carbohidratos tales como las galectinas [36] o los dominios de heveína. Este tipo de interacciones con residuos aromáticos se ha investigado ampliamente en nuestro laboratorio [37-41]. La fuerza de esta interacción es relativamente débil, ya que una única interacción CH- es del orden de 1 kcal/mol [38, 42-43]. Además de la cara más apolar del anillo de azúcar, el grupo metilo de acetamidas en GlcNAc y NeuNAc interacciona a menudo con el anillo aromático en lectinas, como la WGA [30, 33, 44]. El uso frecuente de las cadenas laterales aromáticas en las interacciones con azucares [45] indica que la interacción con la nube de electrones deslocalizados del anillo aromático es energéticamente significativa, más allá de proporcionar simplemente una superficie apolar geométricamente complementaria. En el caso de la galactosa, siempre se encuentran cadenas laterales aromáticas interaccionando. Sin embargo, esta situación apenas se da con manosa. Estas observaciones pueden reflejar el hecho de que la disposición del grupo 4-OH axial en Gal crea una superficie apolar continua y muy amplia.

1.3.3 Las interacciones olares

Aparte de las interacciones por puente de hidrogeno ya mencionadas, también se encuentran casos de interacciones polares como la coordinación con iónes metálicos (por ejemplo en el caso de las C-lectinas, ver más adelante figura 1.14) o interacciones electrostáticas entre residuos cargados de la proteína y oligosacáridos modificados con grupos ionizables, como por ejemplo en el caso del reconocimiento de glicosaminoglicanos donde residuos de arginina y lisina establecen interacciones electrostáticas con los grupos carboxilo y sulfato de los oligosacáridos[46-48].

1.3.4 El a el del agua

Teniendo en cuenta el carácter polihidroxilado de los carbohidratos, es evidente que sus interacciones con el medio acuoso fisiológico debe jugar un papel esencial en el balance global energético de las interacciones con sus receptores. Es necesario tener en cuenta todos los procesos de solvatación-desolvatación que tienen lugar en la formación de los

complejos carbohidrato-receptor [49]. Adicionalmente, también se ha observado que las moléculas de agua pueden jugar un papel específico al mediar en enlaces de hidrógeno entre el azúcar y la proteína, según se ha determinado en diversas estructuras tridimensionales de complejos carbohidrato-lectina [32]. Estudios de los inhibidores de glucógeno fosforilasa han demostrado que los enlaces de hidrogeno mediados por agua entre el azúcar y la proteína pueden ser tan fuertes como los enlaces de hidrógeno directos entre la proteína y el carbohidrato [50]. La comparación de una serie de azúcares unidos a una lectina dada, o una serie de lectinas unidas a un azúcar dado, revela, a veces ,moléculas comunes de agua que se pueden presumir que sean elementos importantes en el reconocimiento. Por ejemplo, se ha observado que tres moléculas de agua median una misma interacción entre galactosa (Gal) con una enterotoxina (“heat- labile”) y con la toxina del cólera[51-52], así como entre la lactosa y otros receptores LT [52-53]. Además, la comparación del sitio de unión entre los estados libre y asociado muestra que algunas moléculas de agua unidas a la proteína en el estado libre de azúcar permanecen en presencia del azúcar y forman enlaces de hidrógeno con él. En este caso, las moléculas de agua actúan como elementos estructurales fijos y, por lo tanto, se pueden considerar como parte de la arquitectura del sitio de unión[54].