Formación de miotubos in vitro a partir de células derivadas del PC

En el cultivo en adhesión se confirmó la capacidad y la identidad miogénica de las células trazadas EYFP o EGFP positivas de los diferentes linajes en estudio a través de la inmuno- colocalización de estas proteínas fluorescentes con la proteína miogénica estructural MYHC (Figura 6.32 A-D). A pesar de que los trazados de linaje no eran completamente puros en el sentido de que se detectaron diferentes tipos celulares positivos para algunas de las proteínas reportero fluorescentes, se observó en todos los casos una contribución de estas células marcadas a la formación de los miotubos, y de manera destacable no se observaron miotubos MYHC positivos que fueran negativos para las proteínas reportero fluorescentes EYFP o EGFP, indicando que todos los miotubos provenían de células derivadas del PC. Este fenómeno de la contribución miogénica por parte de las células EGFP+ detectadas en las esferas del linaje de Pax7CreER2/+; ROSAmTmG se

analizó en detalle a través del estudio de un mismo cultivo en adhesión a distintos días, y se observó cómo a lo largo del cultivo el porcentaje de células EGFP+ mononucleadas disminuía de manera significativa con el aumento del porcentaje de las células EGFP+ multinucleadas (Figura 6.32 D).

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Figura 6.32. Análisis de los trazados de linaje a nivel de cultivo celular en adhesión. (A-D) Detección de las proteínas

fluorescentes EYFP y EGFP (verde) y de la proteína miogénica estructural MYHC (todas las isoformas) (rojo) por inmunofluorescencia en cultivos de 7 días procedentes de los ratones transgénicos Myf5CreSOR; R26YFP (A), B195APCre; R26YFP (B), Pax3Cre/+; ROSAmTmG (C) y Pax7CreER2/+; ROSAmTmG (D). (E) Representación gráfica del porcentaje de

células mono y multinucleadas positivas para EGFP por inmunofluorescencia a los días 1, 3 y 7 de un mismo cultivo, donde se representan las medianas y la desviación estándar de los valores obtenidos de 3 ratones Pax7CreER2/+; ROSAmTmG en un experimento. Los asteriscos representan el valor de p según p < 0,05 *. En los paneles A, B, C y D los

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Para confirmar la contribución de las células trazadas derivadas del PC a la formación de los miotubos se estudió el potencial miogénico de las poblaciones celulares positiva y negativa. Las muestras se separaron por citometría de flujo en base a la fluorescencia emitida en las fracciones positiva y negativa para EYFP o EGFP dependiendo del constructo utilizado, y se cultivaron en condiciones adherentes durante 7 días (Figura 6.33). La capacidad para formar miotubos estriados se limitaba principalmente a la fracción positiva de los trazados de linaje estudiados, fracción celular derivada de aquellas células que habían expresado los genes Myf5 (Figura 6.33 A, C) o Pax7 (Figura 6.33 F), donde se detectaron por inmunofluorescencia miotubos MYHC positivos (Figura 6.33 A, C, F). Sólo unos pocos miotubos MYHC positivos se llegaron a formar en las fracciones negativas, diferenciación no representativa del cultivo obtenido en esas fracciones (Figura 6.33 D-E y G-H).

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Figura 6.33. Contribución a la diferenciación miogénica de las fracciones celulares linaje+ y linaje- separadas

por citometría de flujo. Cultivos en adhesión a los 7 días de las fracciones celulares positiva (A, C, E) y negativa (B, D, F) de los trazados de Myf5CreSOR; R26YFP (A-B), B195APCre; R26YFP (C-D) y Pax7CreER2/+; ROSAmTmG (E-F) analizadas por

inmunofluorescencia detectando las proteínas fluorescentes EYFP y EGFP (verde) y la proteína miogénica estructural MYHC (todas las isoformas) (rojo). Los recuadros E y H simbolizan una diferenciación minoritaria del cultivo. Los núcleos fueron teñidos con Hoechst (azul) y las barras de tamaño representan 100 μm en todos los paneles.

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La confirmación de que los miotubos derivaban de los linajes Myf5, Pax3 y Pax7 no eliminó la posibilidad de que hubiera otras poblaciones celulares que también dieran lugar a los miotubos. Fue preciso analizar otras opciones para establecer las células precursoras presentes en el cultivo celular y para poder entender las capacidades que poseían (Figura 6.34).

En este sentido, la participación de las células perivasculares de la dermis o del propio PC en la miogénesis observada in vitro se estudió a través del trazado de linaje del gen Cspg4 que codifica la proteína sarcoglicano condroitín sulfato 4, también conocida como NG2, y es expresado por células progenitoras oligodendrocíticas y pericitos entre otros tipos celulares (Ampofo et al., 2017). Mediante este constructo se trazaron las células intersticiales localizadas dentro del PC (Figura 6.34 A, flechas blancas) que tras el cultivo celular no daban lugar a los miotubos identificados por la expresión de la proteína MYHC (Figura 6.34 B), descartando una contribución por parte de las células Cspg4+ y su progenie a la diferenciación miogénica in vitro.

Por otro lado, se estudió la contribución de las células precursoras dérmicas, aquellas identificadas por la baja expresión in situ del gen Pax3 (Djian-Zaouche et al., 2012). Como ya se ha mostrado previamente, el PC se originaba a partir de precursores celulares que habían expresado el gen Pax3 durante el desarrollo embrionario. Así pues, para diferenciar las dos poblaciones, las células fueron distinguidas por su expresión in situ del gen Pax3 a través de la expresión de GFP. Las células GFP positivas se localizaron en su nicho adyacente a la papila dérmica del folículo piloso, y no se detectó ninguna en la zona del PC (Figura 6.34 C). Luego del periodo de cultivo, estas células no participaron en la formación de los miotubos (Figura 6.34 D). Además, para reforzar este resultado se separaron las tres fracciones descritas en el artículo referenciado por medio de citometría de flujo, de modo que los melanocitos se delimitaron dentro de la fracción GFP positiva alta correspondiente al 1,2 ± 0,4% de la población, las células precursoras dérmicas en la fracción GFP positiva baja siendo el 0,5 ± 0,1% de la población, y el resto en la fracción GFP negativa (Figura 6.34 E). En la fracción GFP positiva alta sólo se observaron células fusiformes (Figura 6.34 H) y cierto es que se observó una leve formación de miotubos en la fracción GFP negativa donde se agrupaban aquellas células que no expresaban Pax3, pero también en la fracción GFP positiva baja que representaba a algunas poblaciones de precursoras dérmicas (Figura 6.34 F-G), indicando que alguna población celular de la piel con una baja expresión del gen Pax3 albergaba un leve potencial miogénico, aunque no llegaba a formar un cultivo mayoritario de miotubos.

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Figura 6.34. Contribución a la generación de los miotubos por parte de otras poblaciones celulares no-miogénicas per se. (A-B) Trazado de linaje de Cspg4Cre; R26YFP localizando las células trazadas EYFP positivas (verde) por

inmunofluorescencia en una sección histológica de la piel dorsal indicadas con flechas blancas (A) y analizando la expresión proteica de EYFP (verde) y MYHC (todas las isoformas) (rojo) por inmunofluorescencia en el cultivo en adhesión a los 7 días (B). (C-H) Estudio de las células de la piel que expresan el gen Pax3 in situ con el uso de la cepa transgénica Pax3GFP/+ no siendo este un trazado de linaje. Localización in situ de las células que expresan este gen a través de la detección por inmunofluorescencia de la proteína reportero GFP (verde) en un corte histológico donde se delimita el PC con una línea de puntos (C) y en el posterior cultivo en adhesión de 7 días junto con la detección de la proteína miogénica MYHC (todas las isoformas) (rojo) (D). (E-H) Análisis y separación por citometría de flujo donde se muestran las tres fracciones bien diferenciadas; la GFP positiva alta, la GFP positiva baja y la GFP negativa (E), para cultivarlas por separado en condiciones adherentes durante 7 días, detectando por inmunofluorescencia la proteína reportero GFP (verde) y la proteína miogénica MYHC (todas las isoformas) (rojo) (F-H). Los datos de la citometría de flujo se representan como las medias ± desviación estándar de los valores obtenidos en experimentos replicados de manera independiente según se especifica por N = ratones y n = experimentos. En los paneles A, B, C, D, F, G y H los núcleos fueron teñidos con Hoechst (azul) y las barras de tamaño representan 100 μm.

6.4.3 Análisis de expresión de marcadores de superficie y