Procesamiento de la biopsia para criopreservación

La biopsia muscular o de piel se cortó a su vez en trozos más pequeños de unos 0,25 cm2 y dependiendo del protocolo de análisis a utilizar a posteriori se aplicó un tratamiento previo a la criopreservación o fueron directamente criopreservadas.

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En caso de tratarlas previamente, las muestras se pre-fijaron en solución fijadora de Histofix® o de PFA 4% ON a 4○

C y en agitación. Transcurrido este tiempo y después de lavar las muestras en PBS 1X tres veces, estas fueron sumergidas en una solución al 5% de sacarosa donde se dejaron durante 5 horas a 4○_{C y en agitación, para después sumergirlas en una solución al 20% de sacarosa}

dejándolas otra vez ON a 4○

C y en agitación, finalizando así el tratamiento previo de las muestras. Para la criopreservación, cada muestra de manera individual se colocó en un soporte de corcho embebida en O.C.T. y seguidamente se congeló sumergiéndola de manera súbita en isopentano previamente enfriado en nitrógeno líquido, asegurándose así la congelación uniforme y simultánea de toda la muestra. Las muestras criopreservadas se guardaron a -80○

C.

5.7.3.4.1 Preparación de muestras histológicas criopreservadas y su análisis

Para poder analizar las muestras criopreservadas, estas se cortaron en secciones de 7 o 10 micras de grosor en un criostato CM 1950 (Leica) y fueron depositadas sobre portas Superfrost™ Plus. Las muestras procesadas previamente para la detección de la β-galactosidasa o de la fosfatasa alcalina se cortaron en secciones de 60 micras y se montaron con glicerol para facilitar la detección de los compuestos. Dependiendo del objetivo del experimento se realizaron cortes transversales o longitudinales del tejido. En algunos casos en los que era necesario analizar la biopsia por completo o gran parte de ella se siguió un método esquematizado a la hora de realizar los cortes para facilitar el análisis de las muestras y para que el tejido o la biopsia estuvieran representados de forma sintetizada y accesible en un solo porta. A modo de ejemplo, en el caso de realizar secciones de una biopsia por completo, se comenzó por establecer el número de portas a utilizar y su distribución por filas y columnas para luego realizar cortes seriados. Se empezó por distribuirlos a lo largo de la primera fila y al término de esta primera serie de secciones se desgastaron unas 50 o 100 micras de la muestra y se volvió a repetir el proceso colocando la segunda serie de secciones. Se repitió este procedimiento sucesivamente colocando no más de 6 series de secciones por porta y completando todas las filas de portas hasta cortar toda la biopsia (Figura 5.1).

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Figura 5.1. Ejemplo del esquema de portas y la distribución de los cortes seriados para el estudio de una biopsia

completa.

Mediante este esquema de distribución de los cortes de una muestra, el resultado del análisis de un solo porta, o más bien de una columna entera, sería representativo de gran parte de la biopsia, obteniendo así más información de un único análisis. A su vez, este esquema facilitó la búsqueda de zonas de interés dentro de la biopsia, comenzando a analizar la muestra por columnas hasta encontrar la zona de interés, y una vez localizada se prosiguió analizando esa zona (o adyacentes a esa misma zona) a lo largo de la fila seleccionada, ya que esa área se mantendría en los siguientes cortes de los portas de la misma fila, pudiendo realizar diferentes ensayos a cada uno de los portas (Figura 5.2).

Figura 5.2. Ejemplo del procedimiento de análisis de las muestras. Del análisis de la columna A (recuadro amarillo) se

selecciona el porta de interés (A3, círculo) y se prosigue con el estudio de los portas de esa misma fila para obtener los resultados finales (3, recuadro sombreado amarillo).

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Específicamente, las muestras se analizaron de la siguiente forma:

(I) En el experimento de la contribución de las células derivadas de la médula ósea al PC se obtuvo una biopsia de piel de cada ratón que se procesó tal y como se ha descrito dejando una diferencia de aproximadamente 100 μm entre corte y corte de un mismo porta. Para el recuento de las fibras totales de la biopsia de piel se analizó 1 corte aleatorio de cada porta de una misma columna de 6 portas en total y se realizó un promedio de los valores obtenidos, y para el recuento de las fibras positivas para la incorporación de las células trasplantadas se examinaron todos los cortes de entre 3 y 5 columnas aleatorias calculando también un promedio de los recuentos realizados. Finalmente se realizó el promedio de estos valores finales obtenidos de los 3 ratones para obtener el porcentaje final de la incorporación celular.

(II) En el caso del estudio del papel fisiológico del PC en homeostásis y en respuesta a herida se escogió una muestra aleatoriamente de las 6 muestras disponibles de cada condición y de cada ratón, y se procesó de manera similar a la descrita, pero sin llegar a procesar toda la muestra por completo. Para las cuantificaciones de la intensidad de la fluorescencia se escogió un porta adyacente a los portas utilizados para otros análisis y se examinaron todos los cortes calculando el promedio de los valores obtenidos para obtener el valor final correspondiente a cada ratón para luego representar el promedio de esos valores finales obtenidos de los 3 ratones de cada grupo de estudio.

(III) En el ensayo in vivo para estudiar el potencial regenerativo de las células de ratón trasplantadas se procesó el TA entero de cada ratón tal y como se ha explicado, de manera que se analizó una columna entera con el fin de encontrar las fibras regeneradas por las células trasplantadas. A la hora de cuantificar esta contribución, para evitar contar una misma fibra repetidas veces debido a su extensión, se consideró como valor final de la contribución el número máximo de fibras positivas contadas en un solo corte. También se calculó el porcentaje que suponían estas fibras positivas respecto a las fibras totales de ese corte para tener una idea de la extensión de esta contribución.

(IV) En el ensayo in vivo para testar el potencial regenerativo de las células humanas trasplantadas se procesó igualmente el TA entero de cada ratón y se realizaron distintos análisis por columnas para estudiar su contribución. En este caso se cuantificó el número de células humanas

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incorporadas y que habían sobrevivido calculando el promedio entre dos valores resultantes cada uno de ellos de la suma de los valores obtenidos al cuantificar todos los cortes de una columna entera. Se calculó a su vez cuántas de las células humanas presentaban características de células madre, calculando el porcentaje correspondiente entre la suma total de células humanas y la suma total de aquellas con características de células madre cuantificadas en una columna entera. Por último se cuantificó la contribución de estas células humanas a la regeneración de las fibras considerando como valor final el número máximo de fibras positivas contadas en un solo corte, evitando así contar una misma fibra repetidas veces.

5.7.3.5 Estudio de las muestras histológicas criopreservadas