Proceso de regeneración del músculo esquelético

El músculo esquelético presenta una gran capacidad para mantener la homeostasis y para regenerar el propio tejido, ya sea debido a microtraumatismos derivados de la actividad física o a daños más graves debidos a diversas causas como traumatismos o defectos genéticos (Yin, Price and Rudnicki, 2013). La reparación del músculo esquelético adulto es un proceso complejo y altamente sincronizado que comienza con la necrosis de las fibras dañadas y termina con la formación de nuevas fibras musculares funcionales, además de un fragmento de tejido cicatricial en el caso de que el daño haya causado una pérdida volumétrica considerable (Turner and Badylak, 2012). Durante este proceso convergen varias respuestas celulares y moleculares que podrían dividirse en dos fases interdependientes: la degeneración y la regeneración (Figura 3.4). Es crucial que se mantenga un equilibrio apropiado entre estas fases para conseguir un resultado óptimo beneficioso, esto es, la sustitución de las fibras musculares dañadas por las sanas y la reconstrucción funcional del aparato contráctil, frente a la presencia de una inflamación persistente y la formación de tejido cicatricial (Douglas et al., 2002; Prisk and Huard, 2003; Chargé and Rudnicki, 2004; Mourkioti and Rosenthal, 2005).

Figura 3.4. Esquema donde se resúmen los procesos biológicos que se desencadenan tras un daño en el músculo

esquelético para recuperar la funcionalidad del tejido.

La primera fase de degeneración comienza con una rápida necrosis de las fibras dañadas en las que el sarcolema pierde su integridad aumentando la permeabilidad de la fibra y liberando compuestos citosólicos como la creatina quinasa y el miR133-a al plasma (Angelini, Di Mauro and Margreth, 1968; Zatz et al., 1991; Sorichter et al., 2001; Laterza et al., 2009). A su vez, se da un incremento de la salida de calcio del RS relacionado con la proteólisis dependiente de calcio

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(Alderton and Steinhardt, 2000), la rotura de las proteínas contráctiles y la degradación de los orgánulos celulares. Todo ello conducirá a la activación de la cascada del complemento y de una respuesta inflamatoria (Orimo et al., 1991; Musarò, 2014). Los neutrófilos son las primeras células inflamatorias atraídas por quimiotaxis a la zona muscular dañada seguidas de los monocitos y de la infiltración secuencial predominante de dos subpoblaciones de macrófagos, aunque es probable que estos subtipos reflejen diferentes estados celulares de una misma población celular (Fielding et

al., 1993; Tidball, 1995, 2005, Chazaud et al., 2003, 2009; Martinez and Gordon, 2014). El primer

subtipo llamado M1 y caracterizado por la expresión del marcador CD68, es responsable de la fagocitosis de los restos celulares y secreta citoquinas pro-inflamatorias, mientras que el segundo y más tardío subtipo llamado M2 caracterizado por el marcador CD163 está relacionado con la supresión de la respuesta inmune, secreta citoquinas anti-inflamatorias y además, activa y promueve la proliferación de las células satélite, dando paso así a la segunda fase de regeneración (St Pierre and Tidball, 1994; Lescaudron et al., 1999; Merly et al., 1999; Cantini et al., 2002; Mantonavi et al., 2004; Sonnet et al., 2006).

El peso de la regeneración muscular recae en las células satélite, activadas por la señalización precedente, que inician el programa miogénico para la reconstrucción del tejido muscular, recapitulando parcialmente el programa miogénico embrionario del desarrollo muscular (Tajbakhsh et al., 1997; Hawke and Garry, 2001; Chargé and Rudnicki, 2004). Las células satélite quiescentes se caracterizan por la expresión del factor de transcripción Pax7 y las de determinados músculos por el factor de transcripción Pax3, factores que cumplen con una importante función regulando la entrada de las células satélite a la miogénesis actuando por encima de los MRFs (Relaix

et al., 2006; Buckingham and Relaix, 2007). La expresión de los MRFs es secuencial, pero de manera

que se solapan entre ellos (Smith, Janney and Allen, 1994), de modo que dictan la progresión de las células satélite hacia la proliferación, la diferenciación o la auto-renovación (Figura 3.5). Inicialmente, las células satélite activadas entran en el ciclo celular y proliferan expandiendo la población miogénica. Estas células proliferativas, conocidas como mioblastos, expresan los factores miogénicos Myf5 y MyoD1. La transición a la diferenciación implica la disminución de la expresión de genes proliferativos y de los factores Pax3 y Pax7 para dar paso a la expresión de factores miogénicos relacionados con la fusión de los mioblastos, ya sea entre sí o con las fibras preexistentes, tales como Mrf4 y Miogenina (Yablonka-Reuveni and Rivera, 1994; Yablonka-Reuveni

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Por último, las fibras nuevamente formadas sufren un proceso de crecimiento y maduración, primero expresando formas embrionarias o neonatales de MyHC y expresando más tarde las formas adultas lenta y/o rápida de esta proteína estructural y culminando con la migración de los núcleos hacia la periferia de las fibras (Sartore, Gorza and Schiaffino, 1982; Whalen et al., 1990).

Figura 3.5. Papel de la célula satélite durante la regeneración del músculo esquelético centrándose en la regulación

molécular que rige las transformaciones que sufre.

Mientras que la mayoría de las células satélite activadas se diferencian tras una fase proliferativa, una pequeña población de células renueva la población original de células madre musculares, manteniendo una población reserva de células madre para hacer frente a futuros desequilibrios del tejido. Este proceso de repoblación puede producirse a través diferentes mecanismos (Kuang, Gillespie and Rudnicki, 2008). Por un lado, se podrían generar directamente células madre o células destinadas a diferenciarse mediante divisiones simétricas de estas dos poblaciones (Le Grand et al., 2009). También podrían darse divisiones asimétricas dando lugar a una célula de cada tipo. En este sentido, se han descrito dos subpoblaciones dentro de la población de las células satélite que expresan Pax7: aquellas que han expresado Myf5 y están destinadas a diferenciarse (Pax7+ Myf5+), y otras que se caracterizan por no haber expresado Myf5 en ningún momento (Pax7+ Myf5-), células que presentan un fenotipo de célula madre y dan lugar a células de las dos características (madre y especificada) tras dividirse de manera asimétrica (Kuang et al., 2007). Por último, otro mecanismo establecería el restablecimiento de la población de células madre, bien inhibiendo la vía de la diferenciación en las células destinadas a ello mediante la disminución de la expresión de MyoD1, o bien impidiendo la proliferación de las células activando la expresión de factores importantes para inducir la quiescencia celular (Olguin and Olwin, 2004; Shea et al., 2010; Gopinath et al., 2014).

La regeneración muscular se considera bien definida en términos celulares y puede resumirse en esta secuencia: de célula satélite a → mioblasto → miotubo → miofibra. No obstante,

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se han descrito varias poblaciones celulares residentes en el músculo esquelético distintas a las células satélite, que pueden experimentar una diferenciación miogénica in vitro y contribuir a la regeneración muscular in vivo (Tedesco, Moyle and Perdiguero, 2017). Entre ellas se incluyen: los mesangioblastos y pericitos, que expresan algunos marcadores en común como, Cspg4, PDGFRβ y AP, y que han sido utilizadas para mejorar la fisiopatología de músculos afectados por distrofias musculares mediante su trasplante al músculo dañado (Sampaolesi et al., 2006; Dellavalle et al., 2007, 2011; Díaz-Manera et al., 2010; Armulik, Genové and Betsholtz, 2011), aunque su plasticidad

in vivo como células multipotentes y su postulada relación con las células madre mesenquimales

han sido cuestionadas y reducidas recientemente (Guimarães-Camboa et al., 2017). También entran en este grupo las PICs, caracterizadas por la expresión de marcadores Sca-1 y CD34, que requieren de la expresión de Pax7 para su especificación miogénica y que presentan características de célula madre pudiendo generar células satélite (Mitchell et al., 2010; Pannerec et al., 2013) o la llamada side population, población heterogénea de células madre intersticiales aisladas en base a su baja tinción con Hoechst 33342, positivas para el marcador Sca-1 y algunas para CD45, que presentan el potencial de generar miotubos y células satélite tras ser trasplantadas in vivo o en condiciones de co-cultivo con mioblastos in vitro (Gussoni et al., 1999; Asakura et al., 2002), y que están relacionadas a su vez con las células residentes CD45 positivas con capacidades miogénicas en condiciones regenerativas (Polesskaya, Seale and Rudnicki, 2003). Asimismo, también se han descrito la población CD133 positiva residente en el intersticio del músculo que es capaz de mejorar la morfología y función de los músculos esqueléticos de ratones mdx (modelo de la distrofia muscular de Duchenne (DMD)) (Benchaouir et al., 2007) y los recientemente descritos progenitores del linaje del gen Twist2, que parecen ser una subpoblación de precursores mesenquimales involucrados en el crecimiento postnatal y en la regeneración muscular, generando específicamente fibras de tipo IIb/x (Liu et al., 2017). Teniendo en cuenta que el potencial miogénico in vivo de todos estos tipos celulares se ha evaluado generalmente a través de experimentos de trasplante en un contexto de daño o de enfermedad o en condiciones in vitro de interacción inductiva, se desconoce cuál es su implicación durante el crecimiento muscular y la regeneración en condiciones fisiológicas, exceptuando a los progenitores del linaje del gen Twist2, que parecen tener una función más determinante incluso en condiciones fisiológicas (Liu et al., 2017). En todo caso, la participación de todos estos tipos celulares en el proceso de regeneración muscular natural parece ser poco relevante en comparación con el papel preponderante e

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indispensable de las células satélite (Lepper, Partridge and Fan, 2011; Murphy et al., 2011; Sambasivan et al., 2011).

Por otro lado, en el tejido muscular adulto se encuentran precursores y células no miogénicas que juegan un papel relevante promoviendo la regeneración, pero que son también responsables de la generación de grasa y de tejido fibrótico cuando hay un desequilibrio y la señalización predominante es la de degeneración fibroadiposa del tejido muscular, como sucede en numerosas distrofias musculares y en el envejecimiento muscular (sarcopenia). Entre ellas se encuentran: los precursores mesenquimales, o bien los FAPs, que expresan los marcadores Sca-1, CD34 y PDGFRα, que originan la grasa y el tejido fibroso, pero que también favorecen la regeneración y la homeostasis muscular (Joe et al., 2010; Uezumi et al., 2010; Mozzetta et al., 2013; Uezumi, Ikemoto-Uezumi and Tsuchida, 2014); los fibroblastos, clásicamente considerados como responsables del remodelamiento de la ECM y de la formación de fibrosis, aunque también interactúan con las células satélite y pueden promover la miogénesis en determinadas condiciones (Murphy et al., 2011); las PICs, donde se diferencia un subtipo con potencial adipogénico en base a la expresión del PDGFRα (Pannerec et al., 2013); y los pericitos de tipo I, que no expresan Nestina y que participan en la generación de tejido fibroso en animales viejos (Birbrair et al., 2013).

En conclusión, se han descrito numerosas poblaciones precursoras residentes en músculo, pero la interrelación entre las mismas no está clara.

Además de la regeneración de las fibras musculares, en esta última fase también sucede una remodelación del tejido conectivo y una restauración de los vasos sanguíneos y de los nervios para asegurar la funcionalidad del tejido. Generalmente las células satélite se encuentran posicionadas cerca de los capilares e interaccionan con células endoteliales a fin de coordinar los procesos de angiogénesis y miogénesis de forma adecuada (Christov et al., 2007). A su vez, aumenta la producción de proteínas de la ECM que ensamblan el tejido y funcionan como soporte para la formación de las fibras y las uniones neuromusculares (Mutsaers et al., 1997; Grounds, 2008; Lluri

et al., 2010). En respuesta a una breve denervación, las neuronas motoras restantes pueden

alargarse o agrandarse y re-inervar fibras próximas, y las células satélite regulan este fenómeno a través de los niveles de secreción de semaforina 3A (Tatsumi et al., 2009). Sin embargo, si la invervación del músculo no se restaura rápidamente, el músculo deja de recibir las señales

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neuronales necesarias para mantenerse y comenzará a atrofiarse hasta degenerarse por completo (Musarò, 2014; Hall, 2016).