Generación de anticuerpos

La generación de anticuerpos se llevó a cabo según el protocolo descrito por Romero y colaboradores (Romero et al., 2014). El esquema del proceso es el siguiente: los esplenocitos de un ratón Balb/c inmunizado con el antígeno de interés son fusionados con células de mieloma de ratón NS1, incapaces de crecer en medio HAT. Tras ello, las células son seleccionadas en medio HAT de manera que sólo crecen las células fusionadas. Por último, se realiza el screening de las clonas, subclonaje y expansión de los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno deseado.

4.2.4.1. Inmunización de ratones

Ratones de la cepa Balb/c de entre 8 y 10 semanas fueron inmunizados mediante inyección intraperitoneal con el antígeno frente al que se quería generar un anticuerpo. Los antígenos empleados en el transcurso de este trabajo fueron de dos tipos: células 300.19 que expresaban establemente el antígeno en la superficie celular o proteínas de fusión solubles purificadas con el antígeno unido a la región Fc de la IgG1 humana. Las administraciones fueron realizadas en intervalos de 2 semanas. Para la inmunización con células 300.19, estas fueron contadas de manera que se empelaron 30 millones de células cada vez, fueron lavadas con PBS y resuspendidas finalmente en 500 µl de PBS para su administración. Las inmunizaciones realizadas fueron cuatro y, 3 días después de la última se procedió con la fusión de los esplenocitos extraídos del ratón con células NS1, tal y como se describe en el siguiente apartado.

En el caso de las proteínas de fusión Fc se emplearon 50 µgr totales en cada inmunización y se siguió el siguiente protocolo: para la primera inmunización se preparó una emulsión del antígeno o proteína Fc con adyuvante completo de Freund (Sigma, F5881) en una proporción 1:1. Las siguientes administraciones salvo la última, fueron preparadas de similar forma pero con adyuvante incompleto de Freund (Sigma, F5506). Ambos adyuvantes de Freund consisten en aceite mineral y un agente dispersante que permiten que la liberación del antígeno se produzca lentamente. Además, el adyuvante completo contiene Mycobacterium inactivados por calor, lo que provoca la activación de los macrófagos en el sitio de la inyección

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aumentando de esta manera la respuesta inmunitaria. Tres días después de cada inmunización con adyuvante incompleto, se extrajeron unos 20 µL de sangre de la vena de la cola del ratón para analizar mediante ELISA el título del anticuerpo dirigido contra el antígeno. Para ello se utilizó el suero, el cual fue obtenido centrifugando la sangre a 3000rpm durante 10 minutos a 4ºC. Mientras el título fuera inferior a 1/40000 se realizaron sucesivas inmunizaciones con adyuvante incompleto. En el momento en el que el título resultó superior a 1/40000, se realizó una última inmunización del antígeno sin adyuvante y a los 3 días, se procedió a realizar la fusión.

4.2.4.2. Fusión celular

Este proceso consistió en la fusión de un linfocito B productor de anticuerpos con una célula de mieloma de ratón NS1. El resultado fue la generación de un hibridoma, una línea celular inmortal capaz de producir el anticuerpo monoclonal dirigido contra el antígeno de interés. La técnica es una modificación de la descrita por Georges Köhler y Cesar Milstein (Köhler y Milstein, 1975).

En primer lugar, se extrajo el bazo del ratón y se disgregó obteniendo los esplenocitos. La suspensión que contenía las células fue transferida a un tubo y seguidamente se realizaron 3 lavados con RPMI sin suero mediante centrifugaciones a 450 g durante 5 minutos, buscando eliminar las impurezas lipídicas y todos los agregados que estuvieran presentes. Las células NS1 fueron lavadas 1 vez y ambos tipos celulares fueron resuspendidos y mezclados en 20 mL de medio a una proporción de 4 esplenocitos por cada célula NS1. Tras ello, la suspensión de células fue centrifugada a 200 g durante 10 minutos, se retiró el sobrenadante y el tubo conteniendo las células se colocó en un recipiente con agua a 37ºC. La fusión fue realizada con agitación suave constante. En primer lugar se añadió 1 mL de polietilenglicol (Sigma, P7181) gota a gota durante 1 minuto, se incubó 1 minuto la mezcla y a continuación se fueron añadiendo consecutivamente gota a gota y durante 1 minuto cada vez volúmenes crecientes de medio RPMI, 1 mL, 2 mL, 5 mL y 10 mL. Finalmente se completó con RPMI hasta un volumen final de 50 mL y las células fusionadas fueron centrifugadas a 200 g durante 10 minutos y resuspendidas en 225 mL de medio especial para fusiones. A continuación, las células fueron distribuidas en placas de cultivo de 96 pocillos para intentar obtener clonas individuales y mantenidas en cultivo durante aproximadamente 10 días.

El medio especial empleado está compuesto por medio RPMI con 20% de FBS específico para fusiones, HCFS y HAT. El HCFS es un suplemento de crecimiento para hibridomas recién fusionados, mientras que la presencia de HAT (100 µM hipoxantina, 16 µM timidina y 0,4 µM aminopterina), permite únicamente el crecimiento de las células fusionadas debido a que las células NS1 no presentan los genes funcionales necesarios para la síntesis de ADN en este medio de selección. Además, los esplenocitos no crecen de manera indefinida,

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por lo que estos proporcionan a las células fusionadas los genes necesarios para el crecimiento en medio con HAT, mientras que las células NS1 aportan la inmortalidad.

4.2.4.3. Selección y mantenimiento en cultivo de los hibridomas de interés

Durante los días posteriores a la fusión, las potenciales clonas de células productoras de anticuerpos fueron creciendo en las placas sembradas. Cuando alcanzaban una superficie de aproximadamente el 25% del pocillo, se consideraba que presentaban el tamaño óptimo para determinar si generaban anticuerpos dirigidos contra el antígeno empleado en la inmunización. En el caso de la inmunización con células 300.19 estables, mediante citometría de flujo se utilizaron los sobrenadantes de los cultivos de los hibridomas para detectar el antígeno expresado en las estas células 300.19. En cambio, en el caso de la inmunización con proteínas de fusión Fc, los sobrenadantes de los hibridomas fueron analizados por ELISA tipo sándwich, utilizando como antígenos a detectar las mismas proteínas de fusión Fc.

Los cultivos de hibridomas cuyos sobrenadantes presentaban anticuerpos que reaccionaban contra el antígeno deseado, fueron transferidos a placas de 24 pocillos en medio con 20% de FBS específico para fusiones, con HT (100 µM hipoxantina y 16 µM timidina) y HCFS. A continuación se realizó un subclonaje por dilución límite del hibridoma, con el fin de obtener con total seguridad clonas procedentes de una célula individual. Además, en los siguientes días se fueron retirando progresivamente los suplementos HT y HCFS del medio utilizado para cultivar los hibridomas. Aproximadamente quince días después se retiró el suplemento HT y alrededor de una semana después se retiró el HCFS. Por último, el medio suplementado con 20% de FBS específico para fusiones fue cambiado por medio al 15% FBS específico para el cultivo de hibridomas.