5. RESULTADOS
5.9. Generación de una proteína CD48 humana con propiedades de interacción optimizadas
El hecho demostrado de que A43 y su homólogo celular atCD48 son capaces de unir al receptor hCD2 nos llevó a plantearnos qué diferencias a nivel de secuencia aminoacídica o estructurales en el dominio Ig N-terminal diferenciaban ambas proteínas con hCD48, el cual prácticamente no interacciona con hCD2. Para ello realizamos un alineamiento de los dominios Ig-N terminales de A43, CD48 de A.trivirgatus, humano y rata (rCD48) y hCD58-Fc (Figura 49), focalizando nuestra atención en las dos regiones (recuadradas) que participan en la interacción heterofílica entre hCD2 y hCD58 o entre rCD2 y rCD48, descritas en estudios previos (Wang J. et al., 1999, Evans et al., 2006). Nuestro objetivo era identificar qué aminoácidos descritos que participan en las interacciones hCD2-hCD58 y rCD2-rCD48 variaban entre hCD48 y A43 o atCD48. Como se puede observar en los alineamientos, una gran parte de estos aa son iguales o similares (mostrados en verde oscuro), pero identificamos varios de ellos de interés que diferían entre hCD48 y A43 o atCD48 (en rojo). En el loop entre las láminas β C y C’ encontramos un cambio de una treonina polar a una fenilalanina hidrofóbica, y en el loop entre las láminas β F y G encontramos un cambio de carga de residuos positivos en A43 o atCD48 a una lisina negativa en hCD48. Como ya se ha comentado previamente los receptores SLAM basan sus interacciones electrostáticas entre aminoácidos cargados, por lo que consideramos más importante este último cambio. Además, también resaltamos dos cambios estructurales que podían influir en la interacción con hCD2. El primero es la glicosilación de hCD48 en la posición 72 próxima a la lámina β F que no se encuentra presente en A43 o atCD48, lo que podría provocar un impedimento estérico para la unión con hCD2. El otro cambio son los dos aminoácidos hidrofóbicos (metionina y fenilalanina) presentes en A43 y atCD48 en las posiciones 83 y 84 que se encuentran cambiados en hCD48 por dos residuos polares (glicina y asparagina). Este cambio lo consideramos destacable ya que tanto en hCD58 como en rCD48 existe un gap en esta posición, por lo que hipotetizamos que sería más beneficioso para la interacción con hCD2 la existencia de dos aminoácidos hidrofóbicos posicionados hacia adentro de la molécula que dos aminoácidos polares que podría entorpecer estructuralmente la interacción.
Resultados
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A’ B C C’ C’’
A43: DSVNIVNALVGGNITLNISESLPENVREITWFCTYDQKIADWD-VKRLKYFDNKF
||| ++||+ |||+||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||
aoCD48: DSVDVINAVSGGNVTLNISESLPENVREITWFCTYDQKIADWD-VKRLKYFDNKF
| +++||||||||||||||||| + +|||+| ||||++|| ++ |||++||
hCD48: HLVH-MTVVSGSNVTLNISESLPENYKQLTWFYTFDQKIVEWD-SRKSKYFESKF
rCD48: SIPD-INAYTGSNVTLKIHKDPLGPYRRITWLHTKNQKILEYNYNSTKTIFESEF hCD58: FSQQIYGVVYG-NVTFHVPSN--VPLKEVLWKKQKD-KVAELE-NSEFRAF-SSF 10 20 30 40 50
D E F
G
A43: KGRVRLDSQSGALYLSRVQKEDANIYIMRVLKDTMFEQDWKIRLQVFDEV ||||||||||||||||+|||||||||||||||+||||||||||||||||| aoCD48: KGRVRLDSQSGALYISKVQKEDANIYIMRVLKETMFEQDWKIRLQVFDPV ||||||| |||||||||||||| + ||||||| | ||+|||+|||+||| hCD48: KGRVRLDPQSGALYISKVQKEDNSTYIMRVLKKTGNEQEWKIKLQVLDPV rCD48: KGRVYLEENNGALHISNVRKEDKGTYYMRVLRET--ENELKITLEVFDPV hCD58: KNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEMESPNIT--D-TMKFFLYVLES-60 70 80 90
Figura 49. Alineamiento de A43 con atCD48, hCD48, rCD48 y hCD58. Alineamiento del domino Ig1 de A43 con los
dominios N-terminales Ig V-like de atCD48, hCD48, rCD48 y hCD58. Los residuos preservados (I) o similares (+) entre A43 y atCD48 o atCD48 y hCD48, se encuentran indicados. Los aminoácidos preservados en la familia SLAM, CD2 y CD58 se encuentran señalados en amarillo. Los aminoácidos que participan en la interacción heterofílica entre hCD2 y hCD58 están etiquetados en verde oscuro (iguales o similares en hCD48-Fc, A43-Fc y atCD48-Fc) o rojos (no conservados en hCD48-Fc con respecto a A43-Fc y atCD48-Fc). Los sitios potenciales de N-glicosilación se encuentran en verde. Las posiciones de las láminas β de hCD48 y las predichas para el dominio Ig1 de A43 se indican subrayadas. En recuadros las zonas de la secuencia que aminoacídica que participan en la interacción hCD2-hCD58. Las posiciones de los aminoácidos están referidas a hCD48.
A continuación, nos planteamos determinar si los cambios de residuos mencionados en el apartado anterior entre hCD48 y A43 o atCD48 podían incrementar la capacidad de hCD48 de interaccionar con hCD2, conservando su unión a h2B4. Para ello, se planteó la generación mediante mutagénesis dirigida de una batería de mutantes de la construcción hCD48-Fc, en los que se intercambiarían los aminoácidos de interés de hCD48 por los presentes en A43 o atCD48. En primer lugar se inició este análisis mutando los aminoácidos correspondientes a la N-glicosilación de la posición 72 y al cambio de carga de la posición 81. Concretamente, los mutantes generados fueron 5, N72A, NST72-74ANI, K81E, N72-74A+K81E y NST72-74ANI+K81E (Figura 50 A) Comentar que este estudio se encuentra actualmente en desarrollo, faltando por generar los siguientes mutantes, F33Y, GN83-84MF, N72A+GN83- 84MF y N72A+K81E+GN83-84MF.
Seguidamente, se realizaron ensayos de interacción entre células COS-7 transfectadas con los plásmidos hCD2 o h2B4 y células NK-YT, con las proteínas de fusión de cada uno de los mutantes generados de hCD48-Fc, el propio hCD48-Fc, A43-Fc, atCD48-Fc y hCD58-Fc, a una concentración de saturación de unión de 8µgr/ml. Como se puede observar en la Figura 50 B y C, hubo dos mutantes de hCD48-Fc, NST72ANI y NST72-74ANI+K81E, que mejoraron sensiblemente su interacción con hCD2, pero en cambio perdieron capacidad
Resultados
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de unión a h2B4. En cambio, el mutante N72A interaccionó levemente con hCD2 y mejoró su capacidad de unión a h2B4.
Figura 50. Interacciones de los distintos mutantes de hCD48, hCD48, A43, atCD48 y hCD58 con h2B4 o hCD2.
(A) Fragmento de las secuencias aminoacídicas de hCD48 y A43/atCD48. En azul los aminoácidos de hCD48 que han ido siendo cambiados en los mutantes por los presentes en A43/atCD48 en rojo. (B) Tabla con los distintos mutantes de hCD48-Fc, hCD48-Fc, A43-Fc, atCD48-Fc o hCD58-Fc y su grado de interacción con los receptores h2B4 (en gradiente verde) o hCD2 (en gradiente amarillo) presentes en células NK-YT o células COS-7 transfectadas con h2B4 o hCD2. Las células fueron incubadas con 8µg/ml de las distintas proteínas de fusión, seguido de anti-hFc y anti-IgG PE. Las MFI obtenidas mediante citometría de flujo para cada interacción se encuentran entre paréntesis. En la figura se muestra un experimento representativo de tres experimentos independientes. (C) Ejemplo representativo del análisis por citometría de flujo del ensayo descrito en A. Se muestran las interacciones (histogramas sombreados) de A43-Fc, hCD48-Fc, hCD48-Fc N81A y hCD48-Fc NST72-74ANI+K81E con células NK-YT o COS-7 hCD2. Los histogramas en blanco representan controles isotípicos y la MFI detectada está indicada en cada histograma.
A
C
B
Resultados
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Estos resultados son prometedores y sugieren que continuando con estos estudios de mutagénesis dirigida se podría obtener una proteína de fusión hCD48-Fc con cambios limitados capaz de unir hCD2 y h2B4 con la máxima eficiencia. El hecho de disponer de una herramienta con dos dianas biológicas implicadas en inmunidad, hCD2 y h2B4, podría presentar posibles usos terapéuticos.
Discusión
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