Técnicas de biología molecular de ácidos nucleicos

4.2.2.1.1. Minipreps

Las minipreps realizadas para obtener el ADN plasmídico se llevaron a cabo mediante la técnica de la lisis alcalina, como se detalla a continuación. Todas las centrifugaciones llevadas a cabo a los largo de la técnica fueron a 13000 rpm. Varias colonias bacterianas individuales que contenían el plásmido a amplificar y purificar se crecieron en volúmenes de 3 mL de LB con ampicilina, durante aproximadamente 16 horas a 37ºC y con una agitación. Los cultivos bacterianos se centrifugaron, se descartaron los sobrenadantes y se resuspendieron los pellets que contenían las bacterias en 100 µL de solución I, añadiéndose a continuación consecutivamente a cada tubo 200 µL de la solución II y 150 µL de la solución III, mezclándose todo en cada paso y dejándose en hielo 5 minutos. Transcurrido este tiempo, se centrifugaron las mezclas durante 5 minutos y los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos. A continuación, se añadió a cada muestra un volumen igual de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico, mezclándose y centrifugándose otros 5 minutos a temperatura ambiente. Se obtuvieron de esta manera dos fases, transfiriéndose cada fase superior a un tubo nuevo donde se añadió un volumen igual de cloroformo:alcohol isoamílico y se volvió a repetir el proceso anterior. Se transfirieron las nuevas fases superiores a tubos nuevos y se precipitó el DNA que contenían, añadiendo de 2 a 3 volúmenes de etanol al 100% y dejando las muestras 1 hora a -80ºC. Tras ello, se centrifugaron durante 10 minutos, los sobrenadantes fueron descartados, se añadió 1 mL de etanol al 70% a cada una y se volvieron a centrifugar 10 minutos. Por último, los sobrenadantes fueron eliminados, se dejaron secar los pellets y el ADN que contenían fue resuspendido en agua con RNasa A una concentración de 100 µg/mL, incubándose durante 5 minutos a 37ºC para que actuara la enzima y se eliminara el ARN que pudiera contener la muestra.

4.2.2.1.2. Midipreps

Se realizaron midipreps para generar mayor cantidad de ADN plasmídico y de una mayor pureza que el obtenido con las minipreps. Se inoculó una colonia bacteriana individual que contenía el plásmido de elección en 100 mL de LB con ampicilina. Este cultivo se creció durante 16 horas a 37ºC con agitación. Seguidamente, se empleó el kit Nucleobond® Xtra Midi Plus (Macherey Nagel, 740412), según el protocolo suministrado con el producto.

4.2.2.2. Extracción de ARN y reacción transcriptasa reversa

En primer lugar se realizó la extracción del ARN total de cultivos celulares sembrados a una confluencia del 80% en placas de pocillos de 24, sin infectar o infectados con SMCMV u OMCMV. Las células fueron lavadas con PBS, añadiéndose a continuación 200 µL de Trizol

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(Invitrogen, 15596-026) a cada pocillo. Seguidamente, se transfirieron estas suspensiones a tubos y se añadieron a cada uno de ellos 50 µL de cloroformo, centrifugándose durante 15 minutos a 13000 rpm y trasfiriendo a continuación la fase superior a tubos nuevos. Se añadieron 100 μL de isopropanol y tras una incubación de 10 minutos, esta suspensión fue centrifugada de nuevo a 13000 rpm durante 10 minutos a 4ºC. El sobrenadante fue retirado y se añadieron 1.2 mL de etanol al 75% mezclándose con el vortex. Se centrifugó de nuevo a 8000 rpm durante 15 minutos a 4ºC y el sobrenadante fue retirado. El sedimento conteniendo el ARN total se dejó secar y fue resuspendido con 20 µL de agua estéril, incubando esta suspensión a 60ºC durante 10 minutos.

Las muestras obtenidas fueron tratadas con 1 U de la enzima DNasa por cada µg de ARN. La reacción transcriptasa reversa fue realizada utilizando el kit Superscript™ III First- Strand Synthesis System (Invitrogen, 18080-051), siguiendo las especificaciones del fabricante. De manera concisa, 1 μg de ARN fue retrotranscrito a ADNc utilizando oligonucleótidos oligo(dT) durante 50 minutos a 50ºC, seguido de 5 minutos a 85ºC. Finalmente, las muestras fueron tratadas con la enzima RNasa H durante 20 minutos a 37ºC para la eliminación del ARN presente en la muestra de partida.

4.2.2.3. Extracción del ADN de células eucariotas

Para extraer el ADN de las células eucariotas OMK, en primer lugar se lavaron con PBS y se recogieron rascando con una espátula. A continuación se clarificaron mediante centrifugación a 13000 rpm y 4ºC y se descartó el sobrenadante, resuspendiéndose las células en 250 µl de tampón de lisis y añadiéndose seguidamente otros 250 µl de SDS al 1%. Esta solución se mezcló suavemente y se añadió Proteinasa K a una concentración de 300 µg/mL, incubándose durante 20 horas a 56ºC. Al día siguiente se añadió un volumen igual de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico y se centrifugó 15 minutos a 13000 rpm. A partir de este punto se utilizaron puntas cortadas para no degradar el ADN. Se transfirió la fase acuosa a un nuevo tubo, se repitió el mismo paso con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico y a continuación con cloroformo:alcohol isoamílico, precipitando finalmente el ADN contenido en la última fase acuosa superior obtenida. La precipitación del DNA consistió en la adición de 1/10 del volumen de la muestra de acetato sódico 3 M (pH 5.2) y 2-3 volúmenes de etanol 100%. Tras una hora a -80ºC se centrifugaron las muestras 15 minutos a 13000 rpm y 4ºC y se descartaron los sobrenadantes. Se añadieron 800 µl de etanol al 70%, se volvió a centrifugar otros 10 minutos y se eliminó el sobrenadante dejando secar el pellet, el cual se resuspendió finalmente en 10 µl de agua.

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4.2.2.4. Extracción del ADN de virus extracelulares

Con objeto de obtener ADN genómico viral de los sobrenadantes de células HEL299 infectadas con SMCMV o de células OMK infectadas con OMCMV, estos sobrenadantes fueron clarificados y calentados durante 10 minutos a 100ºC para desnaturalizar las proteínas de la partícula viral y liberar el ADN de su interior.

4.2.2.5. Cuantificación del ADN o ARN presente en una muestra

Para calcular la cantidad de ácidos nucleicos presentes en una muestra, se llevó a cabo la determinación de la absorbancia a 260 nm (asumiendo que una unidad de absorbancia equivale a una concentración de 50 µg/mL para el ADN y de 40 µg/mL para el ARN). La pureza de la muestra se determinó mediante el coeficiente de absorbancia 260nm/280nm. Adicionalmente, en todos los casos se comprobó la integridad de los ácidos nucleicos y la concentración aproximada mediante electroforesis en geles de agarosa.

4.2.2.6. Reacción de la polimerasa en cadena (PCR)

La amplificación por PCR de secuencias de ADN se realizó empleando el kit GoTaq® Flexi DNA Polymerase (Promega, M8301). Las condiciones generales de cada reacción de PCR utilizadas fueron las siguientes: 1X del tampón suministrado con la polimerasa, 1.5 mM MgCl2, 200 µM dNTP (Promega, C1145), 1 µM de cada uno de los oligonucleótidos y 0.6 U de polimerasa en un volumen final de 25 µL. A esta mezcla se le añadieron como moldes 100-200 ng de plásmido, 1 ng de ADNc o un volumen que variaba entre 0.5 y 2 µL de las preparaciones de ADN de virus extracelulares. Los ciclos utilizados en estas reacciones de PCR fueron los siguientes: 1 ciclo de 5 minutos a 94ºC (desnaturalización inicial); 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC (desnaturalización), 1 minuto a 51ºC (anillamiento) y 1 minuto a 72ºC (elongación); y un último ciclo de 10 minutos a 72ºC (elongación final).

En ocasiones, para la introducción de mutaciones puntuales o de deleciones de grandes fragmentos se empleó la técnica Splice Overlap Extension (SOE)-PCR (Figura 12). Esta técnica consiste en la amplificación de dos productos de PCR utilizando para cada uno de ellos un oligonucleótido externo de la región de la secuencia a mutar (indicados con los números 1 y 4 en la Figura 12) y otro interno (mostrados como 2 y 3 en la Figura 12). Estos oligonucleótidos internos incluían la mutación puntual o deleción deseada y eran complementarios, por lo que con los pares de oligonucleótidos 1-2 y 3-4, se obtuvieron dos productos de PCR que en uno de sus extremos compartían una secuencia complementaria. A continuación, utilizando como molde 300 ng del fragmento de mayor tamaño y la misma cantidad equimolar del de menor tamaño, se prepararon nuevas reacciones de PCR, pero sin añadir los oligonucleótidos. Seguidamente, se realizaron unos ciclos iniciales para permitir el anillamiento de ambos fragmentos en su región complementaria: 1 ciclo de 5 minutos a 94ºC; 5 ciclos de 5 minutos a 94ºC, 1 minuto a 51ºC y 1 minuto a 72ºC; y un último ciclo de 10 minutos

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a 72ºC. Por último se añadieron los oligonucleótidos externos 1 y 4 y se procedió con los ciclos de PCR detallados al inicio de este apartado.

Figura 12. Representación esquemática del uso de la técnica SOE-PCR para la introducción de mutaciones puntuales o la deleción de fragmentos de secuencias de ADN. (A) Introducción de mutaciones puntuales mediante

SOE-PCR. A partir de un molde con la región a mutar indicada en amarillo, se amplificaron dos fragmentos mediante PCR que contenían la mutación, mostrada en rojo, empleándose 4 oligonucleótidos representados con flechas, dos externos (1 y 4) y dos internos con la mutación deseada (2 y 3). Ambos fragmentos resultantes eran complementarios entre sí en la región del extremo que contienen la mutación, por lo que se realizó un anillamiento entre los dos. A continuación, utilizándolos como molde se realizó una nueva PCR con los oligonucleótidos externos (1 y 4) obteniéndose el fragmento final con la mutación puntual deseada. (B) Deleción de fragmentos mediante SOE-PCR. A partir de un molde con la región a delecionar indicada en rosa, se generaron por PCR dos fragmentos con la deleción, procediendo de igual manera que en A, salvo que los oligonucleótidos internos 2 y 3 contienen las secuencias flanqueantes a la deleción que se desea introducir representadas en verde y morado. Empleando como moldes ambos fragmentos obtenidos, se realizó un anillamiento seguido de una nueva PCR con los oligonucleótidos externos (1 y 4).

4.2.2.7. Electroforesis del ADN en geles de agarosa

Para analizar el ADN extraído, los productos de PCR obtenidos, visualizar la calidad de los plásmidos y sus restricciones, así como la separación de fragmentos de ADN de distintos tamaños, se realizó electroforesis horizontal en geles de agarosa. El porcentaje de agarosa utilizado fue del 1%, la cual se disolvió en TAE 1X, la solución fue calentada y se añadió Red Safe a una dilución 1/20000. Se han empleado los marcadores de peso molecular Lambda DNA HindIII digest (Sigma, D9780) y 1 Kb plus DNA ladder (Invitrogen, 10787-018). Se polimerizó el gel en un soporte con un peine para permitir la formación de los diferentes pocillos añadir las muestras. Una vez polimerizado el gel, se retiró el peine, se introdujo en una cubeta con TAE 1X, se cargaron en los pocillos el marcador de peso molecular indicado en cada caso y las muestras a analizar, aplicándose a continuación una corriente de 120 V. En los casos en los que se quería extraer un fragmento del propio gel, el voltaje empleado fue de 60 V para mejorar la separación de las distintas bandas y la resolución. Transcurrido el tiempo necesario, el gel se observó en un transiluminador de rayos UV, se tomaron fotografías con un sistema de captura de imágenes y en caso de ser necesario, se cortaron las bandas del gel de interés.

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Para la recuperación a partir de geles de agarosa de fragmentos de ADN se utilizó el kit Nucleospin Gel and PCR Clean-up (Macherey-Nagel, 740609.50), siguiendo las instrucciones del fabricante.

4.2.2.8. Restricciones del ADN y defosforilación de sus extremos 5’

Las digestiones del ADN de interés con enzimas de restricción se realizaron utilizando las condiciones especificadas para cada enzima. Normalmente cada reacción contenía el ADN a digerir, el tampón de la enzima 1X, 2 U de enzima por cada µg de ADN y, cuando era necesario, 0,01% de BSA. Estas reacciones se incubaron a 37ºC durante 2 horas y a continuación fueron visualizadas mediante electroforesis en geles de agarosa.

La eliminación de los grupos fosfato de los extremos 5’ de las cadenas de ADN se llevó a cabo empleando la enzima fosfatasa alcalina de gamba (SAP). Las reacciones contenían el fragmento de ADN, el tampón de la enzima 1X y 1 unidad de fosfatasa alcalina por cada pmol de ADN. Tras 10 minutos de incubación a 37ºC, la SAP se inactivó a 65ºC durante 15 minutos.

4.2.2.9. Ligación del ADN

Para las reacciones de ligación de dos fragmentos de ADN se usaron 50 ng de vector y 10 veces más de número de moléculas del inserto. Las reacciones contenían el vector, el inserto, el tampón de la ligasa T4 1X y 175 unidades de la ligasa T4, en un volumen final de 10 µl. Las reacciones fueron incubadas entre 12 y 16 horas a 16ºC y posteriormente se transformaron en células competentes E. coli DH5α.

En los casos en los que las ligaciones de ADN fueron realizadas en el vector pGEM-T a continuación, los plásmidos generados fueron secuenciados con los oligonucleótidos SP6 y T7, con el fin de confirmar la ausencia de mutaciones. La secuenciación del ADN fue realizada en la Unidad de Genómica de los Centros Científicos y Tecnológicos de la Universidad de Barcelona.

4.2.2.10. Transformación en bacterias

La cepa de E. coli empleada para todos los clonajes desarrollados durante este trabajo fue la cepa DH5α. Para la transformación de estas células con el plásmido de interés, se mezclaron 100 µL de la suspensión de estas bacterias competentes con 50 ng de ADN plasmídico o con todo el volumen procedente de una reacción de ligación, según cada caso. Estas células E. coli DH5α competentes utilizadas fueron preparadas siguiendo las indicaciones de Sambrook y Russell (Sambrook y Russell, 2001). Una vez mezcladas las bacterias con el ADN fueron mantenidas en hielo durante 25 minutos y transcurrido este

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tiempo, las muestras fueron sometidas a un choque térmico de 45 segundos a 42ºC con agitación vigorosa. Seguidamente, fueron incubadas 2 minutos en hielo, se les añadieron 800 µL de LB y se mantuvieron durante 60 minutos a 37ºC. Una vez terminado este periodo de incubación, fueron centrifugadas, el sobrenadante fue descartado y las bacterias fueron resuspendidas en 50 µL de LB, sembradas en una placa de Petri con LB suplementado con el ampicilina e incubadas a 37ºC durante 16 horas.