16S de arqueas y bacterias
3.8. Hibridaciones in situ : FISH y CARD-FISH
3.8.1. Observación al microscopio y recuentos
Las hibridaciones de FISH y CARD-FISH se visualizaron utilizando un microscopio de epifluorescencia Leica DM 2500. Las imágenes fueron adquiridas con la cámara fotográfica Leica DFC 300 FX adosada al microscopio, y su correspondiente software (Leica Microscopy Systems Ltd, Heerburgg, Switzerland). Los recuentos se realizaron utilizando un ocular con grilla y se calculó el promedio de células marcadas en aproximadamente 50 campos. Para las muestras de los pozos geotermales, los porcentajes de hibridación se calcularon como el cociente entre las células hibridadas con la sonda específica y las células teñidas con DAPI en aproximadamente 20 campos. En el caso de las muestras del Río Agrio, debido a la baja biomasa y la alta concentración de material autofluorescente, no pudieron utilizarse los recuentos realizados con la tinción DAPI. Los recuentos de las hibridaciones la sonda EUB tampoco se utilizaron debido a que se obtuvieron valores menores que la suma de los recuentos con las sondas para los grupos taxonómicos de bacterias utilizadas. Debido a ello, y para estas muestras, el recuento de células se calculó como la suma de las hibridaciones con las sondas ALF, BET, GAM, NTR y ARCH. Los porcentajes de hibridación se calcularon dividiendo los valores de recuento obtenidos para cada sonda por la sumatoria de los recuentos de todas las sondas utilizadas.
3.9.
Análisis canónico de correspondencia (ACC)
Se utilizó este tipo de análisis estadístico para evaluar las correlaciones entre los parámetros fisicoquímicos y los datos de biodiversidad, ya sean semicuantitativos (recuentos celulares y % de hibridación con las distintas sondas) o de presencia o ausencia de OTUs. Para esto se utilizó el programa CANOCO para Windows versión 4.5 (Microcomputer Power, Ithaca, NY, USA) (ter Braak et al., 2002). ACC es un tipo de análisis de correlación donde se busca el mejor gradiente lineal posible entre un juego de datos multivariables, con la restricción de que los gradientes son combinaciones lineales de las variables explicativas (explanatory variables). En un análisis preliminar realizado con el mismo programa se determinó, según la longitud del gradiente, que debía usarse un enfoque unimodal. Así mismo, CANOCO posee una herramienta de selección de variables que detecta aquellas que están fuertemente correlacionadas y selecciona las que explican mejor la varianza del sistema.
triángulos) y las muestras (representados por puntos azules) con las variables ambientales se mide por donde la proyección perpendicular de estos puntos corta las flechas rojas de dichas variables (mayor la longitud del segmento determinado por la intersección, mayor la correlación entre esa muestra o especie y la variable ambiental). La intensidad de la correlación entre especies y muestras se mide por la distancia lineal entre sus símbolos. La significancia de los ejes fue determinada utilizando el test de permutaciones de Monte Carlo.
Referencias – Sección 3
Achenbach L., Woese C. (1995) 16S and 23S rRNA-like primers. In Archaea: a laboratory manual. Sower K.R., Schreier H.J. (eds). Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 521–523.
Amann R.I. (1995) In situ identification of microorganisms by whole cell hybridization with rRNA-targeted nucleic acid probes. In Molecular Microbial Ecology Manual. Akkermans ADL, van Elsas J.D, de Bruijn FJ, editors. Dordrecht, Netherlands: Kluwer Academic Publishers, pp. 1–15.
Amann R.I., Binder, B.J., Olson R.J., Chisholm S.W., Devereux R., Stahl D.A. (1990) Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations. Appl Environ Microbiol 56:1919–1925.
Bond P.L, Banfield J.F. (2001) Design and performance of rRNA targeted oligonucleotide probes for in situ detection and phylogenetic identification of microorganisms inhabiting acid mine drainage environments. Microbial Ecol 41: 149–161.
Chao A. (1984) Non-parametric estimation of the number of classes in a population. Scand J Stat 11: 265–270.
Daims H., Bruhl A., Amann R., Schleifer K.H., Wagner M. (1999) The domain-specific probe EUB338 is insufficient for the detection of all Bacteria: development and evaluation of a more
comprehensive probe set. Syst Appl Microbiol 22: 434–444.
Daims H., Nielsen P., Nielsen J.L., Juretschko S., Wagner M. (2001) Novel Nitrospira-like
bacteria as dominant nitrite-oxidizers in biofilms from wastewater treatment plants: diversity and in situ physiology. Water Sci Technol 43: 416–523.
Good I.J. (1953) The population frequencies of species and the estimation of population parameters. Biometrica 40: 237–264.
Hallberg K.B., Coupland K., Kimura S., Johnson D.B. (2005) Macroscopic Streamer Growths in Acidic, Metal-Rich Mine Waters in North Wales Consist of Novel and Remarkably Simple Bacterial Communities. Appl Environ Microbiol 72: 2022–2030.
Hammer Øyvind D.A., Harper T., Ryan P.D. (2001) PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis. Paleontol Electron 4: 9–17.
Sons, pp. 115–175.
Ludwig W., Strunk O., Westram R. (2004) ARB: a software environment for sequence data. Nucleic Acids Res 32: 1363–1371.
Massana R., Murray A.E., Preston C.M., Delong E.F. (1997) Vertical distribution and phylogenetic characterization of marine planktonic Archaea in the Santa Barbara Channel. Appl
Environ Microbiol 63: 50–56.
Manz W., Amann R., Ludwig W., Wagner M., Schleifer. K.H. (1992) Phylogenetic oligodeoxynucleotide probes for the major subclasses of Proteobacteria: problems and
solutions. Syst Appl Microbiol 15: 593–600.
Moreno C.E. 2001. Métodos para medir la biodiversidad. M&T–Manuales y Tesis SEA,
vol.1. Zaragoza.
Neef A. (1997) Anwendung der in situ-Einzelzell-Identifizierung von Bakterien zur Populations analyse in komplexen mikrobiellen Biozo¨nosen. Ph.D. thesis. Technical University of Munich, Munich, Germany.
Pernthaler A., Pernthaler J., Amann R. (2002) Fluorescence in situ hybridization and catalyzed reporter deposition for the identification of marine bacteria. Appl Environ Microbiol 68: 3094– 3101.
Rusch A., Amend J.P. (2004) Order-specific 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes for (hyper)thermophilic archaea and bacteria. Extremophiles 8: 357–366.
Schloss P.D. (2005) Introducing DOTUR, a computer program for defining operational taxonomic units and estimating species richness. Appl Environ Microbiol 71: 1501–1506.
Sclesceri L.S., Greenberg A.E., Eaton A.D. (1998) Standard methods for the examination of water and wastewaters. 20th edn. Washington, USA: American Public Health Association.
Ter Braak C.J.F., Smilauer P. (2002). CANOCO reference manual and CanoDraw for Window’s user’s guide: software for canonical community ordination (version 4.5). Ithaca, USA: Microcomputer Power, pp. 500.