Regulación intracelular de los niveles de Fe

La expresión de las proteínas que participan en el metabolismo de Fe es r egulada traduccionalmente por el sistema regulador de hierro IRP/IRE. Este sistema de regulación está conformado por: a) los elementos reguladores de hierro: IRE («Iron Responsive Elements») que se encuentran en los extremos 5´ ó 3´ no codificantes de los mRNA que traducen las proteínas involucradas en el metabolismo de Fe, tales como Ferritina, DMT1, RTf e Ireg1 (transportador de salida en las células de epitelio intestinal). Así, elementos IRE se encuentran en el extremo 5´ de los mRNA de la ferritina y de

Ireg1 y en el extremo 3´ de los mRNA del RTf y del transportador DMT1; y b) por las proteínas reguladas por hierro: IRP 1 y 2 («Iron Regulatory Proteins»). IRP1 es una proteína de 98 kDa, cuya actividad de unión a los elementos IREs es regulada inversamente por la concentración intracelular de Fe, es decir, a menor concentración intracelular de Fe, mayor actividad de unión a IREs. IRP2 (105 kDa), presenta una actividad de unión constitutiva, es decir, siempre está presente y no depende de la concentración intracelular de Fe. Sin embargo, esta proteína es degradada por ubiquitinación cuando la concentración de Fe aumenta (figura 6-2).

Figura 6-2. Regulación del metabolismo intracelular de Fe: Sistema IRP/IRE. Las proteínas IRP se unen a los

elementos IRE, localizados en los extremos 5‘ ó 3‘ no traducidos de los RNAm que codifican para proteínas involucradas en el metabolismo de Fe y de esta forma regulan su expresión, ya sea inhibiendo la traducción o estabilizando al RNAm.

Los elementos IRE y las proteínas IRP actúan en conjunto para detectar y responder a los cambios de hierro en el medio intracelular (“pool” de hierro reactivo). Las proteínas IRP contienen un núcleo cubano que les permite detectar el contenido intracelular de Fe. Cuando el contenido del “pool” de Fe reactivo es bajo, el núcleo se encuentra en un estado conformacional 3Fe-4S, es decir abierto. En estas condiciones se puede unir a los elementos IRE de los mRNA y así regular su expresión. Cuando la proteína IRP se une al extremo 5´ no codificante del mRNA, inhibe la traducción pues bloquea la entrada de la subunidad mayor del complejo traduccional. Cuando se une al extremo 3´no codificante, estabiliza al mRNA ya que impide la acción de las ARNasas. Por lo tanto cuando el contenido de Fe en el “pool” de Fe reactivo es bajo, las IRPs

se unen a los elementos IREs, e impiden la traducción de la ferritina e Ireg1, lo que se traduce en una disminución del almacenamiento y además, se produce la estabilización de los mensajeros del receptor de transferrina y DMT1, lo que aumenta la captación de Fe. Cuando el Fe intracelular aumenta, el núcleo de las proteínas IRPs cambia de estado conformacional a 4Fe-4S (estado cerrado) perdiendo su capacidad de unirse a los mRNA y se convierte en la enzima aconitasa citosólica. Esto finalmente produce la traducción de los mensajeros de Fn e Ireg1 y desestabilización de los mensajeros del TfR y DMT1, lo que se traduce finalmente en un aumento del almacenamiento y una disminución de la captación de Fe.

2.3.1. Transportador de metales divalentes 1

El DMT1 tiene un amplio rango de sustratos, entre los que se encuentran Fe2+_{, Cu}2+_{, Zn}2+_{, Mn}2+_{, Co}2+_, Cd2+_{, Ni}2+_{, y Pb}2+_{. Dos mRNA para DMT1 se} generan por empalme alternativo, uno con un motivo IRE en la región 3´ no traducida y otro sin motivo IRE. Esto resulta en la activación de la síntesis de DMT1-IRE y del transporte apical de hierro a bajos niveles celulares de hierro y en una actividad basal de transporte independiente de la concentración celular de hierro dado por DMT1 sin IRE. DMT1 realiza transporte activo acoplado a protón y depende del potencial de membrana de la célula. La secuencia del gen DMT1 predice una proteína con doce segmentos de transmembrana, de 561 aminoácidos con sus extremos amino y carboxilo terminal ubicados hacia el citoplasma y es expresado ubicuamente. La expresión de DMT1 es estimulada por una dieta deficiente en hierro y representaría un mediador clave de la absorción de hierro intestinal. DMT1 además de localizarse en la membrana apical de las células de epitelio intestinal, también se encuentra localizado en endosomas tardíos y lisosomas, donde DMT1 podría transferir el Fe libre del endosoma al citoplasma durante el ciclo intracelular de la transferrina.

2.3.2. Receptor para Transferrina

El TfR es una macromolécula central para la regulación de la homeostasis del hierro. Es una glicopr oteína de transmembrana tipo 2; homodimérica, cada monómero se conforma por 780 aminoácidos, se expresa en los enterocitos de las criptas duodenales, los cuales regulan la absorción del hierro de la dieta; casi todas las células animales expresan el TfR, a

excepción de algunas células como los eritrocitos maduros. La estructura del R Tf pr esenta una r egión extracelular con 3 dominios; un dominio de unión a proteasas, un dominio apical y un dominio helical; una región transmembrana y una región citoplasmática (extremo amino terminal).

La membrana basolateral participa en dos procesos relacionados con el metabolismo de hierro: a) en la transferencia del hierro desde el enterocito al plasma a través del transportador Ireg1 y la oxidasa hefestina. (figura 6-1). El hierro que no es exportado al plasma es almacenado en la pr oteína de almacenamiento Fn y posteriormente se pierde por exfoliación de las células intestinales. Las proteínas relacionadas al metabolismo del hierro en esta membrana, tanto en el precursor como en el enterocito maduro, son sensibles a los depósitos de hierro del cuerpo y b) en la captación de Fe sistémico (transferrina-Fe) por el TfR. Cuando el hierro corporal se encuentra normal o aumentado, el TfR une transferrina-Fe (Tf-Fe) formando el complejo ternario TfR-Tf-Fe, en la superficie de la membrana basolateral y lo internaliza a través de un proceso endocítico. El complejo TfR-Tf- Fe una vez en la vesícula endocítica y por efecto del pH (aproximadamente 5,5-6,0) se libera el Fe al lumen de la vesícula. El complejo TfR-Tf es estable a este pH. El complejo TFR-Tf recicla a la membrana y puede realizar un nuevo ciclo. El Fe de la vesícula endocítica es transportado al citasol de la célula intestinal por el transportador DMT1 y pasa a formar parte del “pool” de Fe común de la célula. Este proceso aumenta el contenido intracelular de Fe de la célula y por lo tanto, cambia la actividad de las proteínas reguladoras de Fe. En la célula eritroide, el Fe liberado probablemente forma parte del “pool” de hierro que va al interior de la mitocondria para la síntesis del heme o para la inserción del heme en proteínas, enzimas dependientes del heme o para ser almacenado en la ferritina. Cuando el hierro alcanza la membrana mitocondrial interna es atrapada por ligandos y es transferido a través de la membrana interna por la ferroquelatasa. Sólo la forma reducida del hierro (Fe+2_{) puede ser} procesada por la ferroquelatasa.

El hierro modula la expresión del TfR de una manera «feedback» negativo en células no eritrocíticas, sin embargo en células que sintetizan hemoglobina los niveles de mRNA son solamente afectadas por una alta concentración de hierro. El hem baja los niveles de mRNA del receptor para transferrina. Luego que el hem es formado, este

es transportado rápidamente fuera de la mitocondria para combinarse con las cadenas de la globina en el citosol. Cuando la síntesis del hem es inhibida en las células eritroides, muy poco o ningún hierro es acumulado en el citosol como ferritina, en contraste con células no eritrocitarias en que el exceso de hierro es necesariamente metabolizado formando ferritina. Un defecto en la síntesis del hem explica la formación de sideroblastos en anillo en pacientes con anemia sideroblástica.

Algunos factores que serían los causantes de la acumulación de Fe no hem en las mitocondrias de los eritroblastos son: a) El hierro no puede ser usado por falta de protoporfirina IX, y b) El hierro puede abandonar la mitocondria sólo cuando es incorporado a la protoporfirina IX y forma el hem.

La diferenciación eritrocitaria es activada por la eritropoyetina (EPO) que lleva a una inducción de la transcripción de todas las enzimas de la vía del hem que ocurren coordinadamente con la inducción de los receptores de la transferrina. Además la disponibilidad de transferrina está sujeta a los niveles de hierro en la síntesis eritrocitaria.

2.3.3. Proteína HFE

La proteína HFE es el producto de expresión del gen de la hemocromatosis hereditaria (HH). La proteína HFE es una glicoproteína de transmembrana tipo 1 de 343 aminoácidos, que es codificada por el gen HFE. Esta proteína es homóloga a la molécula MHC clase I; pero existen diferencias, ya que la molécula MHC clase I participa en el sistema inmune presentando el péptido antigénico a las células T, en cambio, la HFE no une péptidos ni realiza funciones inmunes. Estructuralmente la HFE presenta tres dominios extracelulares (α1, α2 y α3), una región transmembrana y una pequeña región citoplasmática. Los superdominios α1 y α2 se forman por 8 cadenas beta plegadas y dos alfa hélices, los cuales se ubican en la superficie del dominio α3, el cual se une a través de un puente de disulfuro a la β2-Microglobulina (β2m) en la superficie celular.

La proteína HFE interactúa con el complejo TfR- Tf-Fe al pH de la superficie de la célula (pH 7,4). Por lo tanto, se forma un complejo ternario (Fe- Tf, TfR, HFE), el cual es endocitado y al pH endosomal el hierr o se libera desde la transferrina; esta última se transfor ma en apotransferrina unida al TfR, la cual se recicla en

la superficie celular donde el pH básico de la sangre gatilla su disociación. La molécula de HFE se disocia del TfR en el interior del endosoma, se piensa que la HFE induce cambios estructurales que facilitan la liberación del hierro del complejo Fe-Tf a pH ácido.

Además del complejo ternario se puede formar otro complejo; en el cual a cada cadena del homodímero del TfR, se une una molécula de HFE para formar un complejo simétrico doble, donde hay amplios contactos entre las dos cadenas polipeptídicas del dímero TfR, pero no hay contacto entre las dos moléculas de HFE. Los contactos intermoleculares primarios son entre los dominios α1-α2 de la HFE y las hélices 1 y 3 del dominio helical del TfR formando un centro estable. Los dominios α3 y β2m de la HFE no hacen contacto con el TfR, son más móviles.

La Tf se une a la región correspondiente al dominio helical del TfR; la molécula de HFE se une también a la misma zona, es decir, ambas moléculas compiten por el mismo sitio en el TfR. La evidencia estructural y bioquímica de que la HFE y el complejo Fe-Tf se unen al mismo sitio en el TfR sugiere que este receptor con dos moléculas de Fe-Tf no podría unir HFE. Asimismo, el complejo HFE-TfR con una estequiometría 2:2 no podría unir Fe-Tf; con esto se da a conocer que la HFE puede competir eficazmente con el Fe-Tf a pesar de la gran concentración fisiológica de éste. En solución lo que más predomina es el complejo ternario, con estequiometría 1:2:1 (Fe-Tf, TfR, HFE). Algunas funciones de la proteína HFE en condiciones normales son: a) participar en la captación del hierro celular, b) en la liberación del hierro intracelular ya sea disminuyendo la afinidad del TfR y c) anulando la endocitosis del receptor del TfR.

La hemocromatosis hereditaria (HH) es un desorden caracterizado por un incremento en la captación de hierro dietético y un incremento de la tasa de transferencia de hierro hacia la sangre, lo que conduce a una sobrecarga de hierro. Esto se debe a una disminución en la expresión de la proteína HFE funcional. Dos mutaciones principales dan cuenta del 90% de la hemocromatosis hereditaria. La primera es la mutación de la cisteína 280 por una tirosina en el dominio α3. Esta mutación impide que la

chaperona β2-microglobulina se una a la

pr oteína HFE y por lo tanto ésta no es transportada hasta la membrana basolateral de

la célula del epitelio intestinal, donde realiza su actividad. La segunda mutación corresponde a un cambio de la histidina 63 por un ácido

aspártico, en el dominio α1. Esta mutación

disminuye la afinidad de la proteína HFE por el receptor para transferrina. Se han postulado tres posibles mecanismos de acción de la proteína HFE: 1) gracias a que la proteína HFE presenta afinidad por el R Tf, competería con la Tf, disminuyendo así la absor ción de hierro sistémico; 2) A nivel del endosoma bloquearía al transportador DMT1, inhibiendo así la liberación de Fe desde la vesícula endocítica al citoplasma y 3) por un proceso de transitosis, la proteína HFE llega a la membrana apical y ahí inhibe al transportador DMT1. Esto implicaría que HFE actuaría como una proteína sensible a los niveles de depósitos de hierro del organismo (figura 6-1). Además se señala que las concentraciones relativas de HFE y TfR serían importantes para la carga de hierro, y por lo tanto su relación es fundamental para el mantenimiento de la homeostasis del hierro. También se ha demostrado que la proteína HFE incrementa la actividad de unión IREs-IRPs, lo que ejerce un control universal sobre la regulación de hierro celular.

2.3.4. Transportador Ireg1

Otro elemento que participa en la homeostasis de Fe es el transportador Ireg1, también denominado ferr oportina o pr oteína transportadora de metales (MTP1). La localización de Ireg1 en células y tejidos es consecuente con su función de exportación de hierro desde las células. En el duodeno está presente en los enterocitos maduros y ausente en las criptas (figura 6-1). En el hígado se encuentra preferentemente en las células de Küpf fer, y esto podría explicar porque en individuos con HH las células de Küpf fer contienen bajos niveles de hierr o en comparación con el resto de las células del hígado.

El mRNA de Ireg1 posee en su región 5’ un sitio de unión para IRPs. Por esto se sugiere que este mRNA sería inhibido en condiciones de hierro intracelular disminuido. En individuos hipotransferrémicos el transportador Ireg1 se encuentra elevado a nivel duodenal, debido a que estos individuos, como presentan una anemia severa, necesitan un aumento rápido en la carga de hierro, que se obtiene mediante la estimulación del transportador por reguladores eritropoyéticos y posiblemente vía hipoxia.

2.3.5. Hefestina

La proteína hefestina (proteína homóloga a la ferroxidasa multicobre ceruloplasmina) se localiza en la membrana basolateral del enterocito, asociada al transportador Ireg1 (figura 6-1) participando en la oxidación de Fe+2 _{a Fe}+3_{. En} esta condición, es decir, Fe+3 _{la transferrina} plasmática une al Fe y lo transporta por la circulación, hacia los distintos tejidos. La anemia ligada al sexo (SLA) es un desorden que se caracteriza por una sobrecarga de hierro en el enterocito y una cantidad disminuida en el plasma, producida por una inhibición en la exportación del hierro a través de la membrana basolateral. En la SLA, la hefestina se encuentra mutada (donde ocurre una deleción del aminoácido 194 de la proteína) y se inhibe la oxidación del hierro, disminuyendo el Fe disponible para ser transportado por la transferrina.

2.3.6. Hepcidina

Es un péptido catiónico circulante rico en cisteínas, sintetizado en el hígado y excretado por la orina, con actividad anti-microbiana. Existen dos formas predominantes de hepcidina (Hepc), Hepc20 y Hepc25, ambas presentan 8 cisteínas conectadas por enlaces disulfuros intramoleculares. El péptido es sintetizado como un pro-péptido de 84 aminoácidos, pero solamente las formas de 20 y 25 aminoácidos son purificadas a partir de orina. Evidencias en modelos animales sugieren que la hepcidina es un regulador negativo de la absorción del Fe dietario y de la liberación del Fe de reciclaje desde los macrófagos. El RNAm de la hepcidina es inducido por los depósitos de Fe y por la inflamación. Se ha sugerido que la hepcidina sería uno de los mediadores que participan en el desarrollo de la anemia de la inflamación. El mecanismo por el cual la hepcidina ejerce su efecto sobre la absorción intestinal aún no está claramente establecido. Hepcidina podría regular la absorción de Fe a través de la modulación de la expresión de alguna de las moléculas involucradas en la absorción intestinal de Fe. Dos posibles blancos por su función crítica en la captación de Fe son los transportadores DMT1 e Ireg1.