Degradación de cianuro de sodio por Pseudomonas sp a dos temperaturas y tres pH

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(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M. UN IC. AC IÓ. MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. N. ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE. IN FO. Degradación de cianuro de sodio por DE. Pseudomonas sp. a dos temperaturas. SI ST. EM. AS. y tres pH. TESIS. BIÓLOGO MICROBIÓLOGO. DI. RE. CC. IO. N. DE. PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL DE. AUTOR : Br. JHONN JUVER MORILLO MENDOZA ASESOR : DR. JUAN JOSE GUEVARA GONZALES TRUJILLO – PERU. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UN IC. AC IÓ. N. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. M. Dr. Orlando Velásquez Benites. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. RECTOR DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. DE. Dra. Vilma Julia Méndez Gil. Dr. Santiago Uceda Duclos. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. VICERECTORA ACADÉMICA. DI. RE. SECRETARIO GENERAL DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AC IÓ. N. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. UN IC. Dr. José Mostacero León. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M. DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. IN FO. Dr. William Zelada Estraver. Dra. Bertha Soriano Bernilla. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. DI. RE. CC. DIRECTOR DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA.. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. PRESENTACIÓN. AC IÓ. N. Señores Miembros del Jurado:. En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de. UN IC. Grados y Títulos de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y. M. Parasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad. CO. Nacional de Trujillo, pongo a vuestra consideración y criterio el presente. ÁT. IC. A. Y. trabajo de tesis titulado:. RM. “Degradación de cianuro de sodio por Pseudomonas sp. a dos. IN FO. temperaturas y tres pH”, con el cual pretendo obtener el Título. SI ST. EM. AS. DE. Profesional de Biólogo Microbiólogo.. CC. IO. N. DE. Trujillo, julio del 2014. RE. ______________________________. DI. Br. Jhonn Juver Morillo Mendoza. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MIEMBROS DEL JURADO. Los suscritos, miembros del jurado, declaran que la presente tesis ha sido. AC IÓ. N. ejecutada en concordancia con las normas de la Escuela Académico. Profesional de Microbiología y Parasitología de la Universidad Nacional de. CO. M. UN IC. Trujillo.. A. Y. _________________________________. ÁT. IC. Dr. Heber Robles Castillo. DE. IN FO. RM. PRESIDENTE. Dr. Juan Guevara Gonzáles SECRETARIO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. _________________________________. _________________________________ Ms. C. Aníbal Quintana Díaz VOCAL. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN. Los profesores que suscriben, miembros del Jurado Examinador, declaran. N. que el presente Informe de Tesis titulado: “Degradación de cianuro de sodio. formales. y. fundamentales,. siendo. APROBADO. por. UN IC. requisitos. AC IÓ. por Pseudomonas sp. a dos temperaturas y tres pH”, ha cumplido con los. IC. A. Y. CO. M. UNANIMIDAD.. ÁT. _________________________________. IN FO. RM. Dr. Heber Robles Castillo. _________________________________ Dr. Juan Guevara Gonzáles SECRETARIO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. PRESIDENTE. _________________________________ Ms. C. Aníbal Quintana Díaz VOCAL. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEL ASESOR. AC IÓ. cianuro de sodio por Pseudomonas sp. a dos temperaturas y tres pH”.. N. El que suscribe, profesor asesor de la tesis titulada: “Degradación de. UN IC. CERTIFICA:. M. Que ha sido desarrollada, de acuerdo al reglamento establecido por la. CO. Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo,. A. Y. estando en conformidad con su correspondiente proyecto, y que el informe. RM. ÁT. IC. ha sido redactado acogiendo las observaciones y sugerencias alcanzadas.. IN FO. Por lo tanto, autorizo a Jhonn Juver Morillo Mendoza, continuar con el. DE. trámite del reglamento correspondiente.. SI ST. EM. AS. Trujillo, Marzo del 2014. DE. _________________________________. IO. N. Dr. Juan Guevara Gonzáles. DI. RE. CC. ASESOR. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEDICATORIA. A Dios, porque sé que siempre me protege y acompaña en todo momento,. AC IÓ. N. por guiar mí camino y brindarme la fuerza necesaria para seguir adelante.. UN IC. A mis padres Mercedes y Marina, porque creyeron en mí y porque me. M. sacaron adelante, dándome ejemplos dignos de superación y entrega,. CO. porque en gran parte gracias a ustedes, hoy puedo ver alcanzada mi meta,. A. Y. ya que siempre estuvieron impulsándome en los momentos más difíciles de. ÁT. IC. mi carrera, y porque el orgullo que sienten por mí, fué lo que me hizo ir. IN FO. RM. hasta el final. Va por ustedes.. A mis hermanos, Michael, Diego y Vannesa , a quienes les debo muchas. DE. cosas, quienes han vivido de cerca los distintos procesos de mi vida tanto en. AS. los momentos felices y tristes, porque me motivan y recuerdan que detrás de. SI ST. EM. cada detalle existe el suficiente alivio para empezar nuevas búsquedas.. DE. A Esther, por su paciencia y comprensión, porque prefirió sacrificar su. IO. N. tiempo para que yo pudiera cumplir con el mío, por su bondad que me. de ti. Gracias por estar siempre a mi lado.. DI. RE. CC. inspira a ser mejor persona. Ahora puedo decir que esta tesis lleva mucho. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AGRADECIMIENTO. Un cordial agradecimiento a mi asesor de tesis Dr. Juan Guevara. AC IÓ. N. Gonzáles, Profesor Principal del Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad. UN IC. Nacional de Trujillo, por ser un gran soporte en la realización de esta. M. investigación, por sus sabios consejos, por su paciencia, porque con su gran. A. Y. CO. experiencia profesional supo encaminar la realización de este trabajo.. ÁT. IC. A mi compañero de aulas y amigo Edwin Abel Huamán Medrano, que. RM. de manera desinteresada siempre estuvo presente y fue un gran apoyo para. IN FO. lograr culminar este trabajo.. DE. A los miembros del jurado, la Dra. Bertha Soriano Bernilla y Ms. C.. AS. Aníbal Quintana Díaz quienes con su amplia experiencia ayudaron a. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. encaminar esta investigación.. DI. Muchas Gracias.. ix Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN Se determinó el efecto de las temperaturas de 32 y 36°C en combinación con los. N. pH 9.5, 10, 10.5 sobre la degradación de cianuro de sodio por Pseudomonas sp.. AC IÓ. aislada a partir de lodos activos de la planta de tratamiento de aguas residuales. UN IC. de Covicorti – Trujillo. La muestra de lodo activo se recolectó mediante un muestreo por conveniencia y fue sometida a un enriquecimiento en un caldo. CO. M. mínimo de sales con 500 ppm de cianuro de sodio durante 4 días. Para los. Y. ensayos se tuvieron 6 frascos de vidrio conteniendo 100 ml de caldo mínimo de. A. sales con buffer carbonato,1000 ppm de cianuro de sodio y 4ml de inóculo de. ÁT. IC. Pseudomonas sp. (2.7 x 109 cel/ml ) a las temperaturas de 32 y 36° C en. RM. combinación con los pH 9.5, 10 y 10.5 ( diseño factorial); se usaron también. IN FO. otros 6 frascos de vidrio como controles bajo las mismas condiciones pero sin. DE. inóculo. Cada ensayo se realizó por triplicado y durante 6 días; la degradación. AS. de cianuro de sodio fue medida al tiempo cero y cada 24 horas mediante el. EM. método titulométrico. Los resultados muestran máxima degradación de cianuro. SI ST. por Pseudomonas sp. a 36°C/pH 9.5(655ppm) y 32°C/ pH9.5(648 ppm) pero mínima degradación a 36°C/ pH 10.5(203 ppm). Los análisis de ANAVA y. DE. TUKEY confirman diferencia significativa entre los controles y todos los. IO. N. tratamientos usados; también demuestran que no existe diferencia significativa. CC. entre aquellos tratamientos que usaron el mismo pH (9.5, 10 y 10.5). Finalmente. DI. RE. se concluye que la combinación de las temperaturas 32 y 36°C con los pH 9.5, 10, 10.5 influyen sobre la degradación de cianuro de sodio por Pseudomonas ps. siendo las combinaciones de 32 y 36°C con el pH 9.5 las que favorecen este proceso.. x Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ABSTRACT The effect of temperature was determined 32 and 36 ° C in combination with the. N. pH 9.5, 10, 10.5 on the degradation of sodium cyanide by Pseudomonas sp.. AC IÓ. isolated from activated sludge treatment plant wastewater Covicorti - Trujillo.. UN IC. The activated sludge sample was collected using a convenience sample and was subjected to an enrichment in minimal salts broth with 500 ppm of sodium. CO. M. cyanide for 4 days. For trials six glass bottles containing 100 ml were taken. Y. broth minimal salts buffer carbonate, 1000 ppm of sodium cyanide and 4 ml of. IC. A. inoculum of Pseudomonas sp. (2.7 x 109 cells / ml) at the temperatures of 32. ÁT. and 36 ° C in combination with the pH 9.5, 10 and 10.5 (factorial design); 6. RM. were also used other glass bottles as controls under the same conditions but. IN FO. without inoculum. Each assay was performed in triplicate, for 6 days;. DE. Degradation of sodium cyanide was measured at time zero and every 24 hours. AS. through titulométrico method. The results show high degradation of cyanide by. EM. Pseudomonas sp. at 36 ° C / pH 9.5 (655ppm) and 32 ° C / pH9.5 (648 ppm) but. SI ST. minimal degradation at 36 ° C / pH 10.5 (203 ppm). ANOVA analysis and Tukey confirm significant difference between controls and all treatment used;. DE. also show that there is no significant difference between treatments that used the. IO. N. same pH (9.5, 10 and 10.5). The paper concludes that the combination of the. RE. CC. temperatures 32 and 36 ° C with pH 9.5, 10, 10.5 influence the degradation of. DI. sodium cyanide Pseudomonas sp. combinations being 32 to 36 ° C with the pH 9.5 which favors this process.. xi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ii. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. iii. AC IÓ. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. PRESENTACIÓN. iv. UN IC. MIEMBROS DEL JURADO. M. APROBACIÓN. CO. DEL ASESOR. A. Y. DEDICATORIA. ÁT. IC. AGRADECIMIENTO. RM. RESUMEN. IN FO. ABSTRACT CONTENIDO. DE. INTRODUCCIÓN. vi vii viii ix x xi xii 1. 7. SI ST. EM. MATERIAL Y PROCEDIMMIENTO. 11 15. DE. DISCUSIÓN. v. 6. AS. OBJETIVOS. RESULTADOS. N. CONTENIDO. 22. IO. N. CONCLUSIONES. 23. CC. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 28. DI. RE. ANEXOS. xii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INTRODUCCIÓN Los cianuros son considerados contaminantes debido a su alta toxicidad para. N. todos los organismos aeróbicos, reaccionan con iones metálicos de enzimas tales. AC IÓ. como Fe, Zn y Cu, es un inhibidor irreversible de enzimas que participan en la. oxidada del citocromo a3. 1,2. UN IC. cadena respiratoria a nivel mitocondrial, específicamente reacciona con la forma ; la concentración entre 150 y 300 ppm es letal al. CO. M. ser humano y a niveles de 50 ppm se puede percibir con el olfato, a pesar de que el cianuro es un compuesto altamente nocivo, se produce naturalmente por pero también es. A. Y. mecanismos como la cianogénesis y síntesis de etileno 3,. ÁT. IC. transformado por mecanismos de detoxificación biológica4,5, alcanzándose así. IN FO. RM. un equilibrio ambiental relativo.. Dentro de las formas más tóxicas tenemos el ion cianuro (CN-) y el cianuro de. DE. hidrogeno (HCN) el cual es letal con una dosis de 90 a 100 ppm y puede ser 3,6. . La vida media del cianuro de hidrógeno en. AS. percibida desde los 20 a 30 ppm. EM. la atmósfera es de aproximadamente 1 a 3 años, este se encuentra principalmente. SI ST. como cianuro de hidrógeno gaseoso; mientras que una pequeña cantidad como. DE. finas partículas de polvo. Los compuestos de cianuro se mueven con bastante. N. facilidad en el suelo, formándose cianuro de hidrógeno que luego se evapora;. CC. IO. otros compuestos de cianuro se transforman a otras formas químicas por la. RE. acción de microorganismos en el suelo. En concentraciones altas, el cianuro es. DI. tóxico a estos microorganismos ya que permanece sin ser cambiado a otras formas y atraviesa el suelo llegando hasta el agua subterránea7. Las distintas. formas de exposición a este compuesto para algunos animales y humanos son: Al respirar aire cerca de sitios de desechos peligrosos que contienen cianuro; al. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. beber agua, tocar tierra o comer alimentos que contienen cianuro de manera natural como algunos tipos de frijoles y almendras, el humo de cigarrillos y el humo proveniente de incendios, son fuentes importantes de cianuro3,8.. AC IÓ. N. En la actualidad grandes cantidades de cianuro en sus distintas formas son. descargados a diario en suelos, aguas y aire procedente de diferentes actividades. UN IC. industriales tales como la minería, en el proceso de recuperación de oro9,. M. actividades de electrólisis de aluminio, que se realizan para recubrir la superficie. CO. del metal y protegerlo contra la corrosión 10, carbonización de madera empleada. A. Y. para cocinar, llamada también pirolisis y gasificación de carbón o gasificación. ÁT. IC. por pirolisis rápida11, producciones farmacéuticas y producción de fibras. RM. sintéticas como plásticos12.. IN FO. En Perú, el 20 % de la producción minera aurífera es informal, lo cual hace que. DE. la problemática de la contaminación por cianuro, mercurio y otros desechos. AS. tóxicos se agudice aún más, debido al poco control del cumplimiento de las. EM. normas que regulen sus usos y emisiones al ambiente, contaminando el suelo,. SI ST. aire y agua. Entre los departamentos más afectados tenemos a madre de Dios, La. DE. Libertad y Cajamarca, siendo Madre de Dios donde se centra el 96% de la. IO. N. minería informal13.. CC. Existen métodos de tratamientos químicos para degradar el cianuro que. DI. RE. generalmente se basan en la cloración alcalina14, pero no son muy recomendables, debido a que en ellos se utilizan reactivos que causan otro tipo de contaminación, es el caso de los tratamientos de cianuro mediante su oxidación con hipoclorito de calcio, produciéndose cianato de calcio y finalmente cloruro de cianógeno y organoclorados, liberándose al medio. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ambiente cloro residual y cloruros15. Entre los efectos que estos compuestos pueden causar a largo plazo, se pueden mencionar: carcinogénesis, mutagénesis, teratogénesis, enfermedades respiratorias y encefalopatías crónicas16; por lo. AC IÓ. N. tanto se hace necesario recurrir a otros tratamientos complementarios, que controlen la liberación de los nuevos contaminantes cuya acumulación llega a. métodos biológicos para la degradación de cianuro,. M. También tenemos. UN IC. ser igual o más dañino que el mismo.. CO. utilizando algunas especies de hongos, tales como Fusarium oxyporum, F.. A. Y. solani, Gliocladium virens y trichoderma koningii ; sin embargo las bacterias. ÁT. IC. también son buenos degradadores de cianuro y dentro de ellos tenemos algunas 17. , este último género es. RM. especies de los generos Bacillus y Pseudmonas. IN FO. considerado entre los mejores para la degradación de cianuro debido a su versatilidad metabólica , ya que tiene una amplia capacidad oxidativa y una alta. DE. adaptabilidad para utilizar una gran variedad de sustancias químicas como. EM. AS. fuente de carbono y nitrógeno; es también muy tolerante a ambientes alcalinos y. estudios realizados por Babu y colaboradores en 1996, demuestran la. DE. Los. SI ST. con muy poca cantidad de nutrientes.18,19.. N. capacidad de un extracto celular de Pseudomonas putida para utilizar el cianuro. CC. IO. como única fuente de carbono y nitrógeno. En los ensayos las células crecieron. RE. en presencia de cianuro de sodio (NaCN) y se midió la habilidad enzimática para. DI. convertir el cianuro en amonio a pH 7.5 y pH 9.5 20. En el 2001 Montoya realiza una propuesta de detoxificación de ambientes mineros mediante métodos químicos y biológicos, para estos últimos propone condiciones de degradación hasta de 700 ppm de cianuro de sodio, realizando. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. mediciones de la concentración residual de cianuro mediante los métodos titulométrico, colorimétrico y por conductividad iónica, aunque recomienda este último por ser más seguro para el operario, se considera muy útil el método. N. titulométrico cuando las concentraciones de cianuro que se van a medir son tan. AC IÓ. altas 21.. UN IC. Luque y colaboradores en el 2004, aíslan una cepa de Pseudomonas. M. pseudoalcaligenes CECT5344, utilizando un medio de cultivo mínimo. CO. preparado sin amonio y citrato, a pH 9.5 con 100ppm de NaCN y 50 mM de. A. Y. acetato como únicas fuentes de nitrógeno y carbono respectivamente, durante el. ÁT. IC. proceso de degradación de cianuro, el microorganismo fue capaz de crecer en. RM. medios alcalinos, hasta pH de 11.5 siendo 9 el pH óptimo para la degradación de. IN FO. cianuro y tolerar concentraciones de 1400 ppm de cianuro libre. El crecimiento del microorganismo fue concomitante y proporcional a la degradación de. DE. cianuro, el cual fue estequiometricamente convertido en amonio, adicional al. EM. AS. cianuro el microorganismo utilizó como fuente de carbono amonio, nitratato y. SI ST. cianato. En este trabajo se observó que todo el cianuro y amonio fueron asimilados, la actividad enzimática de la cianasa se indujo durante el crecimiento. DE. del microorganismo en presencia de cianuro o cianato, pero no con amonio o. IO. N. nitrato como fuente de carbono; los resultados sugieren que el cianato puede ser. CC. un intermediario en la ruta de degradación del cianuro, pero no se excluyen en. DI. RE. este trabajo otras rutas alternas para la degradación del cianuro 22. La biotecnología microbiana es una opción que cada vez impacta más el campo de la producción limpia, ofreciendo de esta forma otra solución al problema de acumulación de cianuro en el medio ambiente 6. Sin embargo en Perú no se toma importancia al estudio e investigación de técnicas y procesos, que con ayuda de 4. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. microorganismos aporten a la degradación de este compuesto de manera no toxica y sin dejar residuos dañinos al medio 6; tampoco se ha encontrado antecedentes acera de la influencia que tienen la combinación de temperaturas y. AC IÓ. N. pH en la degradación de cianuro por Pseudomonas sp., lo cual justifica el desarrollo de la presente investigación, ya que los conocimientos y técnicas. UN IC. adquiridas servirán de ayuda para futuros trabajos realizados en este campo Es. M. así que el presente trabajo tuvo como objetivo determinar el efecto de las. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. degradación de cianuro de sodio por Pseudomonas sp.. CO. temperaturas de 32 y 36°C en combinación con los pH 9.5, 10, y 10.5 sobre la. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. OBJETIVOS. N. Objetivo general:. AC IÓ. Determinar cuál es el efecto de las temperaturas de 32 y 36°C en combinación. UN IC. con los pH 9.5, 10, y 10.5 sobre la degradación de cianuro de sodio por. CO. M. Pseudomonas sp.. Aislar e identificar cultivos puros de Pseudomonas sp a parir de lodos. IC. A. . Y. Objetivos Específicos:. ÁT. activos de la planta de tratamiento de aguas residuales de Covicorti- Trujillo. RM. con capacidad de degradar cianuro de sodio y tolerar un pH fuertemente. Cuantificar la capacidad degradadora de Pseudomonas sp. sobre el cianuro. DE. . IN FO. alcalino.. AS. de sodio a las temperaturas de 32 y 36°C en combinación con los pH 9.5,. Determinar si existe diferencia significativa en la capacidad degradadora de. SI ST. . EM. 10, y 10.5, mediante el método titulométrico.. DE. Pseudomonas sp. sobre el cianuro de sodio a las temperaturas de 32° y 36°C. DI. RE. CC. IO. N. en combinación con los pH 9.5, 10, 10.5.. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MATERIAL Y PROCEDIMIENTO. N. 1. MATERIAL. Cultivo de Pseudomonas sp. aislado a partir de lodos activos de la planta de. UN IC. . AC IÓ. 1.1. muestra. Cianuro de sodio (20 g) procedente de la mina San Luis S.R.L. de la. CO. . M. tratamiento de aguas residuales de Covicorti, Trujillo.. IC. A. Y. provincia de Pataz, región La Libertad, Perú.. RM. ÁT. 2. PROCEDIMIENTO. IN FO. 1.1. Recolección de la muestra. Se recolectaron aproximadamente 200 ml de lodo activo en tres frasco. DE. estériles, de 3 puntos referenciales de las pozas de oxidación de la planta de. EM. AS. tratamiento de aguas residuales de Covicorti – Trujillo, los cuales fueron. SI ST. transportados posteriormente en un cooler hacia el Laboratorio de Microbiología Ambiental en la Facultad de Ciencias Biológicas de la. DE. Universidad Nacional De Trujillo donde se mezclaron homogéneamente y. IO. N. enriquecieron para finalmente aislar un cultivo puro de Pseudomonas sp.. RE. CC. (ANEXO 1). DI. 1.2. Enriquecimiento de la muestra con cianuro de sodio En este enriquecimiento se empleó 100 ml de caldo un medio mínimo de sales (0.005 % de K2HPO4, 0.2% de Na2SO4, 0.003% de NaCl, 0.1% de MgSO4 ) y buffer carbonato a pH 9, a este caldo se le adiciono 500 ppm de. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. cianuro de sodio como fuente de carbono y nitrógeno, finalmente se añadió 10 ml de la muestra de lodo activo. Se homogenizó por 5 minutos y fue incubado a temperatura ambiente por 3 días 4,6. (ANEXO2). AC IÓ. N. 1.3. Aislamiento e identificación de Pseudomonas sp:. UN IC. Para el aislamiento de Pseudomonas sp. se utilizó: Agar Cetrimide (medio. M. selectivo) el cual una vez sembrado fue incubado a 42°C x 48 horas.. CO. La comprobación de la pureza del cultivo de Pseudomonas sp. se realizó. A. Y. mediante crecimiento en agar Mac Conkey e identificación bioquímica. ÁT. IC. usando pruebas tales como: TSI, LIA, SIM, citrato, indol, oxidasa y catalasa. RM. ; adicionalmente se realizó también una coloración Gram y observación. IN FO. microscópica de la bacteria con lo que se corroboró su morfología y. DE. clasificación Gram.(ANEXO 2 y 3). AS. 1.4. Preparación del inóculo y estandarización. EM. El inóculo utilizado estuvo dado por una población celular en 24 ml de. SI ST. solución buffer carbonato a pH 9, el que se comparó con el tubo N°3 del. DE. Nefelómetro de Mac-Farland. Adicionalmente para corroborar la cantidad. N. real de bacterias ingresadas se realizó una siembra del inóculo en agar. CC. IO. cetrimide a diluciones 10-6 y 10-7 y luego de 24 horas de incubación a 36°C. DI. RE. se procedió al recuento respectivo 26. (ANEXO 4). 1.5. Ejecución del bioensayo. Se agregó 4 ml de inoculo de Pseudomonas sp. (1.3 x 109) en 6 matraces Erlenmeyer, cada uno con un volumen de 100 ml de un caldo mínimo de sales con buffer carbonato y cianuro de sodio (NaCN) a 1000 ppm. Como 8. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. controles, se usaron 6 matraces adicionales, con las mismas condiciones pero sin inoculo y se realizaron mediciones de la concentración residual de cianuro cada 24 horas, durante un periodo de 6 días, tanto en los matraces. AC IÓ. N. inoculados como en los controles. (ANEXO 4) Las condiciones que se utilizarán para cada. bioensayo se describen a. M. Dos matraces Erlenmeyer conteniendo 100 ml del caldo mínimo de sales (. CO. . UN IC. continuación:. Y. K2HPO4 0.005%, NaH2PO4 0.2%, NaCl 0.003%, MgSO4.7H2O 0.1%, y. IC. A. buffer carbonato) mas 1000 ppm de cianuro de sodio a pH 9.5 se inocularon. ÁT. con Pseudomonas sp.; uno de ellos se mantuvo a 32ºC y el otro a 36ºC. RM. durante 6 días. Como control se tuvo dos matraces Erlenmeyer con las. Dos matraces Erlenmeyer conteniendo 100 ml del caldo mínimo de sales (,. DE. . IN FO. mismas condiciones pero sin inoculo bacteriano.. AS. K2HPO4 0.005%, NaH2PO4 0.2%, NaCl 0.003%, MgSO4.7H2O 0.1%, y. SI ST. EM. buffer carbonato) mas 1000 ppm de cianuro de sodio a pH 10 se inocularon con Pseudomonas sp.; uno de ellos se mantuvo a 32ºC y el otro a 36ºC. DE. durante 6 días. Como control se tuvo dos matraces Erlenmeyer con las. IO. N. mismas condiciones pero sin inoculo bacteriano. Dos matraces Erlenmeyer conteniendo 100 ml del caldo mínimo de sales (,. DI. RE. CC. . K2HPO4 0.005%, NaH2PO4 0.2%, NaCl 0.003%, MgSO4.7H2O 0.1%, y. buffer carbonato). mas 1000 ppm de cianuro de sodio a pH 10.5 se. inocularon con Pseudomonas sp.; uno de ellos se mantuvo a 32ºC y el otro a 36ºC durante 6 días. Como control se tuvo dos matraces Erlenmeyer con las mismas condiciones pero sin inoculo bacteriano. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Los ensayos se realizaron en condiciones aeróbicas sólo con la boca de los matraces Erlenmeyer cubierta por tapones de algodón.. N. Se realizaron 3 repeticiones de cada uno de los ensayos.. AC IÓ. 1.6. Medición de la biodegradación de cianuro de sodio por Pseudomonas. UN IC. sp:. M. La concentración de cianuro residual fue medida por el método. CO. titulométrico, cada 24 horas durante 6 días, tanto en los matraces inoculados. A. Y. como en los controles 26.(ANEXO 5 y 6). ÁT. IC. 1.7. Análisis estadístico.. IN FO. RM. Los datos obtenidos de la cantidad de cianuro residual en el sexto día de evaluación fueron evaluado mediante Análisis de Varianza (ANAVA) y la. DE. prueba de TUKEY para determinar el grado de significancia entre cada una. AS. de las combinaciones de temperatura y pH.. Esto se realizó con el programa. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. estadístico IBM SPSS statistics versión 20. (ANEXO 7 Y 8). 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESULTADOS Se aisló e identifico un cultivo de Pseudomonas sp. procedente de las pozas de. AC IÓ. de 1000 ppm de cianuro de sodio y tolerar un pH hasta de 10.5.. N. oxidación de Covicorti – Trujillo, con capacidad de degradar concentraciones. UN IC. En la tabla 1. Se muestra la concentración media residual de cianuro de sodio en. M. caldo mínimo de sales con buffer carbonato durante seis días de tratamiento. CO. con Pseudomonas sp. a temperaturas de 32 y 36°C en combinación con los pH. Y. 9.5, 10 y 10.5., observando que existe diferencia significativa entre resultados. IC. A. obtenidos tras los distintos tratamientos al sexto día de evaluación obteniendo. RM. ÁT. un p<0.05 tras la prueba de ANAVA.. IN FO. En la tabla 2. Se muestra la degradación media acumulada de cianuro de sodio en caldo mínimo de sales con buffer carbonato por Pseudomonas sp. a lo largo. DE. de seis días de tratamiento con temperaturas de 32 y 36°C en combinación con. EM. AS. los pH 9.5, 10 y 10.5; observándose máxima degradación sp. a 36°C/pH 9.5. SI ST. (655ppm) y 32°C/ pH9.5 (648 ppm) pero mínima degradación a 36°C/ pH. DE. 10.5(203 ppm).. N. En la figura 1 se muestra los porcentajes de degradación total de cianuro de. CC. IO. sodio en caldo mínimo de sales con buffer carbonato a 1000 ppm por. RE. Pseudomonas sp. después de 6 días de tratamiento a temperaturas de 32°C y. DI. 36°C en combinación con los pH 9.5, 10, 10.5 .. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UN IC. AC IÓ. N. Tabla 1. Concentración media residual de cianuro de sodio en caldo mínimo de sales con buffer carbonato inoculado con Pseudomonas sp. durante seis días a temperaturas de 32 y 36°C en combinación con los pH 9.5, 10 y 10.5.. M. Concentración media residual (ppm). 5. 6. 1000. 1000. 1000a. ÁT. Tratamiento. 0. 1. 2. 3. Control. 1000. 1000. 1000. 1000. 32°C / 9.5. 1000. 849. 697. 524. 442. 379. 352b. 32°C / 10. 1000. 898. 783. 702. 663. 627. 594c. 32°C / 10.5. 1000. 961. 930. 887. 848. 825. 788d. 36°C / 9.5. 1000. 837. 669. 513. 437. 386. 345b. 36°C / 10. 1000. 906. 814. 724. 656. 602. 580c. 36°C / 10.5. 1000. 957. 906. 865. 835. 812. 797d. A. IC. IN FO DE. AS. EM. DE. SI ST. Y. 4. RM. CO. Días. DI. RE. CC. IO. N. ( a,b,c,d ) Letras distintas presentan diferencia significativa (p <0.005). 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Y. CO. M. UN IC. Tabla 2. Degradación media acumulada de cianuro de sodio en caldo mínimo de sales con buffer carbonato por Pseudomonas sp. a lo largo de seis días de tratamiento a temperaturas de 32 y 36°C en combinación con los pH 9.5, 10 y 10.5.. IC. A. Degradación media acumulada (ppm). 2. 0 0 0 0 0 0 0. 0 151 102 39 163 94 43. 0 303 217 70 331 186 94. DE. AS. EM. 3. RM. 1. IN FO. 0. 0 476 298 113 487 276 135. 4. 5. 6. 0 558 337 152 563 344 165. 0 621 373 175 614 398 188. 0 648 406 212 655 420 203. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. Tratamient o Control 32°C / 9.5 32°C / 10 32°C / 10.5 36°C / 9.5 36°C / 10 36°C / 10.5. ÁT. Días. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 100%. UN IC 66%. CO. 70%. M. 80% 65%. A. Y. 60%. IC. 50%. 42%. ÁT. 41%. RM. 40% 30%. 21%. 20%. IN FO. porcentaje de degradacion de NaCN. 90%. 20%. DE. 10% 0% 32°C / 9.5. 32°C / 10. 32°C / 10.5. 36°C / 9.5. 36°C / 10. 36°C / 10.5. Tratamientos. SI ST. EM. Control. AS. 0%. DE. Figura 1. Porcentajes de degradación total de cianuro de sodio en caldo mínimo. N. de sales con buffer carbonato por Pseudomonas sp. después de 6 días de. CC. IO. tratamiento a temperaturas de 32 y 36°C en combinación con los pH 9.5, 10 y. DI. RE. 10.5.. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DISCUSIÓN El trabajo se inició con un enriquecimiento de la muestra recolectada (lodo. N. activo); con la finalidad de contribuir a que las Pseudomonas presentes en la. AC IÓ. muestra encuentren una ruta degradativa para el cianuro de sodio y puedan. UN IC. usarlo como fuente de carbono y nitrógeno, seleccionando de esta manera. CO. alcalino en donde el cianuro no se volatilice14.(ANEXO 2). M. Pseudomonas que sean capaces de degradarlo y también de tolerar un pH. Y. Para el aislamiento de Pseudomonas sp se utilizó un medio selectivo que fue. IC. A. agar cetrimide, el cual está compuesto de amonio cuaternario que es un inhibidor. RM. ÁT. de gran variedad de especies bacterianas incluyendo muchas especies del genero. IN FO. Pseudomonas, lo que permite obtener un cultivo de este género más selectivo; la producción del pigmento piocianina se ve estimulada por el magnesio, cloruro. DE. de potasio y sulfato presentes en el medio. La tinción Gram, crecimiento en agar. AS. Mac Conkey y pruebas bioquímicas confirman que efectivamente el cultivo. SI ST. EM. aislado fué Pseudomonas sp.1,24.(ANEXO 2) Una de las pruebas de confirmación para asumir que el cultivo aislado fue. DE. Pseudomonas sp es el crecimiento en agar Mac Conkey que es un medio. IO. N. selectivo para bacterias Gram negativas, en este medio el viraje del color del. CC. indicador de pH (rojo neutro) se produce por fermentación de la lactosa presente. DI. RE. en el medio ocasionando la disminución del pH alrededor de la colonia. Los microorganismos no fermentadores de lactosa como Pseudomonas sp. producen colonias incoloras o amarillas, esto también se evidencio en el crecimiento obtenido en Mac Conkey durante esta investigación 24,28.(ANEXO 3). 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Pseudomonas sp. es una bacteria que no degrada sacarosa, lactosa ni glucosa con formación de ácidos y que tampoco elimina ácido sulfhídrico luego de degradar el tiosulfato, esto se hace evidente en la prueba bioquímica que usa el medio. AC IÓ. N. agar hierro tres azucares (TSI) el cual manifiesta alcalinidad tanto para la degradación de lactosa y sacarosa como para glucosa con la usencia de ácido. UN IC. sulfhídrico (K/K-); otra prueba bioquímica realizada fue la descarboxilación de. M. la lisina cuyo resultado es negativo para Pseudomonas sp. esto se evidenció con. CO. un color violeta del medio agar lisina hierro (LIA) donde fue sembrado el cultivo. Y. aislado. El crecimiento en medio SIM que se utiliza para observar la motilidad. IC. A. de los microorganismos, Pseudomonas sp. presenta una motilidad negativa en. RM. ÁT. este medio lo cual también sucedió con el cultivo aislado 24. La última prueba. IN FO. bioquímica realizada en medios solidos fue la del uso del citrato como única fuente de carbono donde el cultivo aislado dio positivo, lo cual es compatible. DE. con la bacteria Pseudomonas sp 28.(ANEXO 3). EM. AS. Pruebas como la catalasa, oxidasa e indol también fueron realizadas al medio de. SI ST. cultivo aislado para determinar la presencia de enzimas que confirmen que este cultivo es Pseudomonas sp.. Los resultados obtenidos en estas pruebas fueron. DE. los esperados ya que dieron positivo para las pruebas de catalasa y oxidasa, pero. CC. IO. N. negativo para la prueba de indol 24.(ANEXO 3). RE. Las bacterias del género Pseudomonas tienen requerimientos nutricionales muy. DI. simples, ya que pueden utilizar más de 100 compuestos como fuente de carbono y energía, entre ellos el cianuro y. poseen también una variedad de operones. inducibles por lo cual nutricionalmente son un género muy versátil, esto hace que varias especies de este género sean muy importantes en procesos de biorremediación 28. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. La biodegradación del cianuro podría ser una opción a los procedimientos industriales. Los métodos biológicos y particularmente los microbiológicos, se constituyen en alternativas eficientes, porque son específicos, respecto a los. AC IÓ. N. focos en los que se pretende que actúen y luego de estandarizarse, pueden resultar muy económicos, respecto a los procesos químicos. Otra ventaja de. UN IC. estos procesos es su diseño simple y el control que se posee del proceso operativo, los bajos costos de las sustancias químicas y la capacidad de tratar por. CO. M. este método todas las formas de cianuro y subproductos 12,22,29.. A. Y. Existen en la naturaleza organismos capaces de crecer en presencia de cianuro,. ÁT. IC. tal es el caso de boleophatlmus boddaerti, una especie de pez que tolera ciertas envuelve la. RM. concentraciones de cianuro en el ambiente, esta tolerancia no. IN FO. capacidad de degradarlo, como es el caso de algunas especies del genero. DE. Pseudomonas 30, las cuales poseen las herramientas enzimáticas necesarias para. AS. sobrevivir en ambientes altamente contaminados con cianuro y tienen la y de nitrógeno. , este poder de degradación está reflejado en los resultados obtenidos en la. SI ST. 31,32. 14,20. EM. capacidad de degradarlo utilizándolo como fuente de carbono. presente investigación, los cuales se exponen en la tabla 1 y tabla 2 donde se. DE. muestran la concentración media y la degradación media de cianuro de sodio. IO. N. en un medio de cultivo inoculado con Pseudmonas sp. a lo largo de 6 días a. CC. temperaturas de 32 y 36°C en combinación con los pH 9.5, 10 y 10,5 ; se. DI. RE. observa también que en todos los tratamientos establecidos Pseudomonas sp. redujo la concentración de cianuro inicial en todos los caldos de cultivo donde se inoculó dando una diferencia significativa entre estos (p<0.05) (ANEXO 7) En la figura 1 se muestra los porcentajes de degradación total de cianuro de sodio en medio mínimo de sales con buffer carbonato después de 6 días de 17. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. tratamiento a temperaturas 32°C y 36°C en combinación con los pH 9.5, 10, 10.5; observándose que a los rangos de temperatura y pH usados en el presente estudio, la degradación de cianuro de sodio por Pseudomonas sp. es. AC IÓ. N. inversamente proporcionales al aumento del pH y que la temperatura no ejerce efecto sobre este proceso. En el análisis estadístico realizado por la prueba de no existe diferencia significativa. entre los datos de degradación. UN IC. tukey. M. obtenidos bajo el mismo pH tanto para la temperatura de 32 y 36° C, pero si. CO. evidencia diferencia significativa entre los datos obtenidos bajo pH diferentes. Y. (ANEXO 8). Esto evidencia que la temperatura no ejerce efecto significativo. IC. A. respecto a la capacidad de degradar cianuro de sodio por Pseudomonas sp. sin. RM. ÁT. embargo los pH evaluados de 9.5, 10 , 10.5 tiene una gran influencia en la. IN FO. capacidad degradadora de la bacteria sobre el cianuro sodio. Dichos resultados se debe a que en los rangos de temperatura y pH evaluados para la degradación. DE. de cianuro, el pH ejerce un mayor afecto sobre los procesos de transporte a. AS. través de la membrana celular, ya que Pseudomonas sp. es una bacteria que. SI ST. EM. crece preferentemente a pH neutro y con rangos de temperatura mesófilos 28,33. En estudios realizados determinan que. algunas especies de Pseudomonas. DE. poseen oxidasas insensibles al cianuro, las cuales poden seguir funcionando con. IO. N. altas concentraciones del mismo. Además cuando se produce estrés se activaban. CC. una serie de mecanismos de seguridad que incluían a la alquil hidroperóxido. DI. RE. reductasa, la cual sustituye a la catalasa en las funciones de protección frente al estrés oxídativo. También se producen HSP (proteínas de choque térmico) estas moléculas no sólo defienden a las proteínas de las altas temperaturas, también lo hacen contra otros fenómenos que provocan desnaturalización, tales como como el pH. Esto puedo haberse dado en el proceso de degradación de cianuro de 18. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. sodio por el cultivo de Pseudomonas sp. aislado ya que fue resistente a una concentración alta de cianuro (1000 ppm) y a pH de hasta 10.5 28. Luque en el 2005, establece que. en. condiciones fuertemente alcalinas y. pseudoalcaligenes CECT5344, los. AC IÓ. N. utilizando el cianuro como única fuente de carbono para la cepa Pseudomonas compuestos como el hierro y algunas. UN IC. sustancias orgánicas reaccionan químicamente con el cianuro, afectando el. CO. M. crecimiento de los microorganismos, esto debido a que el cianuro se asocia con estos elementos formando complejos, de los cuales el microorganismo no puede. A. Y. obtener carbono ni nitrógeno fácilmente. Sin embargo la limitación de hierro en. ÁT. IC. el medio de cultivo sugieren la producción de sideróforos por parte del aislado. RM. bacteriano, aunque este metabolito no fue medido en el medio residual, es. IN FO. importante considerar esta variable para trabajos futuros ya que estos metabolitos son de gran interés en la agricultura para el control de algunas. AS. DE. bacterias y hongos fitopatógenos 38,39.. EM. Durante la evaluación de la degradación de cianuro de sodio se observa que los. SI ST. días 1, 2 y 3 a comparación de los posteriores, se presentó un mayor porcentaje. DE. de biodegradación de cianuro de sodio en todos los tratamientos evaluados; estos. N. resultados coinciden con otros trabajos donde se demuestra que las formas de. CC. IO. cianuro libre, CN- provenientes de las formas NaCN, KCN, etc., se biodegradan. RE. más rápidamente que las formas de cianuro asociadas a complejos metálicos. DI. tales como (K2Ni(CN)4) y (K3Fe(CN)6). 30. . también se encontró. que la. limitación de nutrientes como el fosforo incrementa la toma de carbono por parte de las células, lo cual pudo haber favorecido que Pseudomonas sp. degrade el cianuro utilizándolo como fuente de carbono. 36. . Es. por esto que la. composición del caldo mínimo de sales utilizado en los tratamientos presenta 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. muy poco porcentaje de fosforo y potasio (0.005%). Otro motivo por el cual la biodegradación d cianuro de sodio es más rápida en los 3 primeros días y se estabiliza a partir del 4 día seria por el aumento en la concentración de amonio. AC IÓ. N. ya que el microorganismo tomaría el amonio como fuente de nitrógeno dejando la toma del cianuro de sodio para cuando la concentración de amonio vuelva a. UN IC. descender 5,18,19.(ANEXO 9,10 Y 11). CO. M. La proporción HCN/ CN- depende fundamentalmente del pH. El elevado pKa del cianuro (9), implica que a pH neutro o ácido, este compuesto se volatilice en. A. Y. forma de HCN. Desde el punto de vista químico la eliminación biológica del. ÁT. IC. cianuro requiere condiciones alcalinas y una fuente de carbono incapaz de. RM. reaccionar químicamente con el cianuro como lo es el buffer carbonato a pH 9.6. IN FO. 37 .. DE. En los controles con caldo mínimo de sales y buffer carbonato a los pH de 9.5,. AS. 10, 10.5 en combinación con las temperatura 32 y 36°C, se observa una. EM. retención del el 100% de cianuro después de 6 días de tratamiento, observar. SI ST. (ANEXO 12) lo que evidencia la no volatilización del cianuro del medio y el Pseudomonas sp. sobre el cianuro de sodio, ya que en. DE. poder de degradación de. N. dichos controles no se inoculó la bacteria. La retención del cianuro de sodio es. CC. IO. debido a que el pH es el factor determinante para mantener al cianuro en una. RE. forma estable no volátil y que la temperatura no ejerce efecto sobre la retención. DI. de cianuro en el medio, a esta conclusión también se ha llegado en otros trabajos donde se ha demostrado que el pH es factor clave en estos procesos 38,39. Se eligió usar Buffer carbonato para realizar los bioensayos, pues no reacciona con el cianuro formando complejos u otras sustancias toxicas y porcentaje de 20. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. recuperación de cianuro es aceptable y se garantiza la estabilidad del pH durante el tiempo de los bioensayos. En trabajos con células neuronales de gatos se ha verificado que el buffer carbonato es un medio eficiente en conservar el pH. AC IÓ. N. estable a través del tiempo y mantener las concentraciones de cianuro constante. También es importante resaltar que el cultivo aislado de Pseudomonas sp., se. UN IC. ajusta a las condiciones de pH requeridas para la biorremediación de compuestos. M. cianurados, pues toleró los medios con pH 9.5, 10,10.5, sobrepasando la. CO. tolerancia de aislados pertenecientes a la misma especie evaluados en otros. A. Y. estudios, a pH de 7.0, 7.5 y 9.5 5,40.. ÁT. IC. Investigaciones como la realizada por Kunz encontraron que P. fluorescens. RM. NCIMB11764 fue eficaz en la remoción de formas simples de CN- (KCN) en las. IN FO. primeras 72 horas, utilizando el compuesto cianurado como único inductor enzimático. En este caso el cianuro induce la producción de cianuro oxigenasa y. DE. se obtiene como productos de conversión enzimática CO2, NH3 y α-cetoacidos. EM. AS. como coproductos 5. Esta podría ser una de las vías que utiliza la bacteria. SI ST. durante la degradación del cianuro de sodio sin embargo dichos productos no fueron medidos en esta investigación. Cabe resaltar también que es posible que biodegradación. DE. la. no haya sido totalmente completa y en el medio. IO. N. permanezcan compuestos intermedios entre cianuro y amonio, como cianatos,. CC. tiocianatos y formatos 31,41. Por el contrario, todo el cianuro pudo ser convertido. DI. RE. a amonio y éste, por procesos de nitrificación pasar a nitritos y nitratos o por procesos de regeneración a α-cetoacidos, en presencia de CO2 38,42.. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CONCLUSIONES. . Pseudomonas sp. a partir de lodos activos de la planta de. degradar cianuro de sodio y tolerar un pH de 10.5. . capaces. de. UN IC. tratamiento de agus residuales de Covicorti – Trujillo. AC IÓ. N. Se aisló. CO. M. La combinación de las temperaturas 32 y 36°C con los pH 9.5, 10, 10.5. Y. influyen sobre la degradación de cianuro de sodio por Pseudomonas ps. ,. IC. A. observándose máxima degradación al combinar las temperaturas 32 y. ÁT. 36°C con el pH 9.5 , con valores de 648 y 655 ppm de cianuro de sodio. RM. degradado para cada combinación respectivamente; Por otro lado la. IN FO. mínima degradación de cianuro de sodio se obtuvo bajo el pH 10.5 con. DE. un valor de 312 ppm a 32°C y 203 ppm a 36°C. . AS. Se encontró diferencia significativa entre los controles y todos los. EM. tratamientos utilizados para degradar cianuro de sodio por Pseudomonas. No se encontró diferencia significativa entre aquellos tratamientos que. DE. . SI ST. sp. en el presente estudio.. DI. RE. CC. IO. N. usaron el mismo pH, sin importar la temperatura con las que se combinaron; es así que no se encontró diferencia significativa entre los tratamientos de 32°C/pH 9.5 con 36°C/pH 9.5, 32°C/ pH 10 con 36°C/ pH 10 y 32°C/pH 10.5 con 36°C/ pH 10.5.. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. 1. Mathews C, Van holde K, Ahern K. G. Bioquímica. Tercera edición. Madrid.. AC IÓ. N. Editorial Pearson Educación, S.A. 2002; p. 1386. chromatography. with. pulsed. UN IC. 2. Terri C, Jeffrey R. Direct determination of free cyanide in drinking water by ion amperometric. detection.. of. CO. M. Chromatography A. 2007; p. 31–39. Journal. Y. 3. Ramírez A. Toxicidad del cianuro. Investigación bibliográfica de sus efectos en. IC. A. animales y en el hombre. An Fac med. 2010;71(1):54-61. ÁT. 4. Knowles C. Cyanide utilization and degradation by microorganisms. En: Ciba. RM. Foundation Symposium. 140: 1988, p. 3-15. IN FO. 5. Kunz D, Chen J, Guanglia ng P. Accumulation of a-Keto Acids as Essential. DE. Components in Cyanide Assimilation by Pseudomonas fluorescens NCIMB. AS. 11764.Applied and Environmental Microbiology. 1998;64(11):4452–4459. EM. 6. Restrepo O, Montoya C, Muñoz N. Degradacion microbiana de cianuro. SI ST. procedente de plantas de beneficio de oro mediante una cepa nativa de P. fluorecens.Universidad Nacional de Medellin. 2006;73(149):45-51. DE. 7. Producción más limpia en la minería del oro en Colombia mercurio, cianuro y. IO. N. otras sustancias. Ministerio de energía y minas de Colombia; 2007: disponible. http://www.upme.gov.co/Docs/Mineria_limpia.pdf. DI. RE. CC. en. 8. Quiroga P, Olmos. Revisión de la toxicocinética y la toxicodinamia del ácido cianhídrico y lo cianuros. Acta Toxicol. Argent. 2009; 17 (1): 20-32 9. Sancho J, Fernández B, Alaya J, Garcia M, Lavandeira A. Aplicación del permanganato potásico para la eliminación de cianuros de cobre en aguas 23. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. residuales d a planta de lixiviación en una mina de oro (II): ensayos en planta piloto. Rev met. 2011; 47 (3): 224-233. 10. Quispe L, Arteaga M, Cardenas E, Lopez L, Santelices C, Palanque E, Cabrera. AC IÓ. N. S. Eliminacion de cianuro mediante sistema combinado UV/H2O2/Ti2. Revista Boliviana de química. 2011;28 (2): 113-118. UN IC. 11. Gobierno de aragon. Residuos Convertidos en Fuentes de Energía.. M. http://www.aragoninvestiga.org/investigacion/temas_todo.asp?id_tema=28&in. CO. Consultada el 12 de octubre del 2013.. Y. 12. Akcil A, Mudder T. Microbial destruction of cyanide wastes in gold mining:. IC. A. process review. Biotechnology Letters. 2003; 25(6): 445-50.. IN FO. Salud Pública. 2008; 25(4): 413-418.. RM. ÁT. 13. Chung B. Control de los contaminantes químicos en el Perú. Rev Peru Med. 14. Gaviria A. Análisis de alternativas para la degradación de cianuro en efluentes. DE. líquidos y sólidos del municipio de Segovia, Antioquia en la planta de beneficio. EM. 73(149): 31-34.. AS. de la empresa mineros nacionales, municipio de Marmato, redalyc. 2006;. SI ST. 15. Burbano D, Fajardo A, B urbano D, Burbano E, Apraez N, Moreano M. estudio. DE. de métodos químicos de remoción de cianuro presente en residuos de. N. cianuración provenientes del proceso de extracción de oro de venta en el. CC. IO. departamento de Nariño. revista.luna.azúl. 2010; 31: 8-16. RE. 16. Aguldelo R, Betancur J, Jaramillo C. Biotratamiento de residuos cianurados y su. DI. relación con a salud púbica. Rev. Fac. Nac. Salud Publica. 2010; 28(1): 7-20. 17. Blas J. aislamiento y selección de bacterias degradadoras de cianuro a partir de rlaves mineros, procedentes de la sierra del departamento de la libertad. Tesis. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. para optar el titulo de biólogo microbiólogo. Ciencias biológicas: Universidad Nacional de Trujillo. 18. Kunz D, Nagappan O, Avalos S,. Delong G. Utilization of cyanide as. AC IÓ. N. nitrogenous substrate by Pseudomonas fluorescens NCIMB 11764: evidence for multiple pathways of metabolic conversion. Applied and Environmental. UN IC. Microbiology. 1992;58(6): 2022-2029.. M. 19. Fernandez R, Kunz D. Bacterial Cyanide Oxygenase Is a Suite of Enzymes. CO. Catalyzing the Scavenging and Adventitious Utilization of Cyanideas a. Y. Nitrogenous Growth of Substrate.Journal of Bacteriology. 2005; 187(18): 6396-. IC. A. 6402.. RM. ÁT. 20. Babu G, Vijaya O, Ross V, Wolfran J, Chapatuala K. Cell-free extract(s) of. IN FO. Pseudomonas putida catalyzes the conversion of cyanides, cyanatos, thiocyanates, formamide, and cyanide containing mine waters into ammonia.. DE. Applied Microbiology Biotechnology. 1996;45 (1-2): 273-277.. AS. 21. Montoya C. Cianuro, oro y medio ambiente en la minería del nordeste. EM. antioqueño.Revista Facultad de Ingeniería. 2001; 5 (22): 43-49.. SI ST. 22. Luque V. Characterization of the cyanase from Pseudomonas pseudoalclaigenes. DE. CECT5344, an enzyme that is not essential for cyanide assimilation.. N. Environmental Microbiology.2004;15(1): 253–270.. CC. IO. 23. Evaluación tecnológica de los biorreactores de membrana. Sumarios Anejos. p.. RE. 81.. DI. https://upcommons.upc.edu/pfc/bitstream/2099.1/2738/2/37258-2.pdf Consultada el 17 de octubre de 2013. 24. Mac Faddin, Jean F. Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia Clínica. Tercera edición. Madrid. Panamericana. 2003; P.632-634.. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 25. Dimitry Y, et al. Microbial Thiocyanate Utilization under Highly Alkaline Conditions. Applied And Environmental Microbiology, 2001; 67(2):528–538 . 26. Dirección del medio ambiente. Manual de procedimientos analíticos para aguas efluentes.. Disponible. en. AC IÓ. N. y. http://imasd.fcien.edu.uy/difusion/educamb/docs/pdfs/manual_dinama.pdf. edición.disponible. en. :. M. Tercera. UN IC. 27. Organización mundial de la salud.. manual de bioseguridad en el laboratorio.. CO. http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/CDS_CSR_LYO_2004. Y. _11SP.pdf. IC. A. 28. Madigan M, Matinko J y Parker J. Brock – biologia de lo microorganismos. RM. ÁT. 10ma ed. España; editorial Pearson Prentice Hall; 2004.. IN FO. 29. Reyes I, Samillan C, Ñique W. tecnología enzimática para la eliminación de cianuro y xantano etílico de potasio en relaves de la minera en función de pH del. DE. medio, concentración de reactivo FPL, tiempo y velocidad de agitación.. AS. SCIENDO. 1998; 1 (1): 35 – 40.. EM. 30. Chew S. Comparative Physiology and Biochemistry Cyanide detoxification in. SI ST. the mudskipper, Boleophthalmus boddaerti.. Journal of Experimental. DE. Zoology,2005; 15(2): 1-8. N. 31. Knowles C. Cyanide utilization and degradation by microorganisms. Ciba. CC. IO. Foundation Symposium. 1988;140: 3-15. RE. 32. Dhillon J K, Shivaraman N. Biodegradation of cyanide compounds by a. DI. Pseudomonas species. Canadian Journal Of Microbiology.1999; 45 (3): 201-208. 33. Quentin M y Weiser R. Bacteriologia y Micologia Medica. 2° edición México: Interamericana Mac Graw – Hill; 1991.436-439.. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 34. Chen J, Kunz D. Cyanide utilization in Pseudomonas fluorescens NCIMB 11764 involves a putative siderophore. FEMS Microbiology Letters .2006; 156:61-67. 35. Díaz M, Villa P; Frías A. Evaluation of the siderophores production by aeruginosa.. Revista. Latinoamericana. de. Microbiología.. AC IÓ. N. Pseudomonas. 2002;44(3) :112-117.. UN IC. 36. Anders M, Persson D; Goran L. Physiological and Morphological Changes. M. Induced by Nutrient Limitation of Pseudomonas fluorescens 378 in Continuous. CO. Culture. Applied and Environmental Microbiology.1990; 56(3): 686-692. Y. 37. Marder L, Guilherme O, Bernardes A. Removal of Cadmium and Cyanide from. IC. A. Aqueous Solutions through Electrodialysis. Revista Latinoamericana de. RM. V. Metabolismo del cianuro y del cianato en Pseudomonas. pseudoalcaligenes. IN FO. 38. Luque. ÁT. Microbiología. 2003;14( 4): 610-615.. CECT5344.. Aplicaciones. biotecnológicas.. Andalucia.. DE. Analistas económicos. 2005:187-189.. AS. 39. Riani J, Leao V. The elution of metal cyanocomplexes from polyacrylic – and. EM. polystyrene – based ion excharge resins using nitrate and thiocyanate eluants.. SI ST. Brazilian Journal of Chemical Engineering. 2007; 24(3): 421 – 431.. DE. 40. Wang C, Kunz D, Venables B. Incorporation of Molecular Oxygen and Water. N. during Enzymatic Oxidation of Cyanide by Pseudomonas fluorescens NCIMB. CC. IO. 11764. Applied Environmental and Microbiology. 1996; 62(6): 2195–2197.. RE. 41. Figueira M, Ciminelli V, Andrade M. Cyanide degradation by an Escherichia. DI. coli strain. Canadian Journal of Microbiology. 1996; 42(5): 519-23.. 42. Akcil A, Mudder T. Microbial destruction of cyanide wastes in gold mining. Biotechnology Letters.2003; 25(6): 445-50.. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(40) RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M. UN IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. ANEXOS. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(41) CO. M. UN IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DE. N. B. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. A. DI. RE. CC. IO. ANEXO 1: Zona de muestreo y recolección de muestra de lodos activos. A. Poza de oxidación número 2 de Covicorti – Trujillo. B. Frascos estériles conteniendo lodo activo obtenido de tres puntos distintos escogidos por conveniencia en la poza de oxidación de covicorti – Trujillo.. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(42) AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CO. M. UN IC. B. EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. A. C. DE. SI ST. F. DI. RE. CC. IO. N. ANEXO 2: Obtención del cultivo puro de Pseudomonas sp. a partir del aislamiento en agar cetrimide A. Enriquecimiento de lodo activo en caldo de cultivo con 100 ppm de NaCN. B. Siembra de lodo preenriquecido en agar cetrimide C.. Aislamiento de. pseudomonas sp en agar cetrimide. D. cultivos puro de pseudomonas sp. en agar nutritivo con buffer carbonato a pH 9 y 200 ppm de NaCN.. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(43) IC ÁT. B A. D D. DE. C A. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. A. A. Y. CO. M. UN IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DI. RE. CC. IO. N. ANEXO 3: Pruebas bioquímicas y Comprobación de la pureza del cultivo de Pseudomonas sp aislado a partir de los lodos activos de las pozas de oxidación de Covicorti – Trujillo. A. pruebas bioquímicas de uso de citrato, TSI, LIA, crecimiento en medio SIM, indol. B. crecimiento en agar Mac Conkey y prueba de la oxidasa. C. prueba de catalasa D. Coloración gram.. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(44) UN IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CO. M. A. RM. ÁT. IC. A. Y. B. AS. DE. IN FO. D. E. EM. C. SI ST. ANEXO 4: A. Biomasa de Pseudomonas sp. en agar cetrimide obtenida para elaborar el inóculo B. Comparación por turbidez del inoculo de. DI. RE. CC. IO. N. DE. Pseudomonas sp. con el tubo número 3 de Mac Farland.. C.. inoculación de Pseudomonas sp. en caldo de cultivo con 1000 ppm de cianuro de sodio. D. incubación de los frascos de vidrio controles y testigo conteniendo caldos de cultivo a tres pH distintos (9.5, 10 y 10.5) con 1000 ppm de cianuro de sodio a temperaturas de 36°C. E. incubación de los frascos de vidrio controles y testigo conteniendo caldos de cultivo a tres pH distintos (9.5, 10 y 10.5) con 1000 ppm de cianuro de sodio a temperaturas de 32°C. 32. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(45) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ANEXO 5: Método Titulométrico para determinar concentraciones de cianuro. FUNDAMENTO El ión cianuro es titulado con una solución estándar de nitrato de plata para. AC IÓ. N. formar el complejo soluble Ag(CN)2, durante este proceso llegara el momento. en que el ion plata exceda en cantidad para acomplejarse con el cianuro y será. UN IC. detectado por el ioduro de potasio (KI) dando una coloración amarilla.. CO. M. PROCEDIMIENTO. Y. Colocar en un matraz Erlenmeyer 10 ml de la solución con cianuro de sodio a. RM. ÁT. adicionar 0.2 ml de ioduro de potasio al 2%.. IC. A. titular y agregar la misma cantidad de hidróxido de sodio 0.04 M, por ultimo. IN FO. Titular con nitrato de plata hasta que el color cambie a amarillo tenue. Titular un. DE. blanco en otro matraz con la misma cantidad que el primero pero con tan solo. SI ST. EM. AS. hidróxido de sodio.. N. DE. dónde:. CC. IO. A = mL de estándar de nitrato de plata gastados en la titulación de la muestra. DI. RE. B = mL de estándar de nitrato de plata gastados en la titulación del blanco N = normalidad de la solución estándar de nitrato de plata V = mL de muestra utilizados para la determinación. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..