UNIVERSIDAD DE BARCELONA FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE ANATOMÍA Y EMBRIOLOGÍA HUMANA
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UNIVERSIDAD DE BARCELONA FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE ANATOMÍA Y EMBRIOLOGÍA HUMANA
Estudio de los cambios morfológicos del epitelio
corneal en un modelo animal de ojo seco
Respecto al epitelio control
1. Confirmamos que el estrato superficial del epitelio corneal es una capa ininterrumpida con muy pocas células exfoliadas. Aparece como un mosaico de células de diferentes tonalidades grises, con núcleos no manifiestos y uniones intercelulares intactas.
2. Las células descamadas o en avanzado proceso de descamación se presentan solitarias, por encima del epitelio, sin microproyecciones, con los bordes retraídos y muestran una membrana porosa.
3. Hemos demostrado que el tamaño y la forma de las células son muy variados, aunque predominan las células pequeñas y de contornos poligonales. También hemos constatado que estas dos variables son los rasgos que mejor discriminan los diferentes tipos celulares.
4. Consideramos incorrecto el clasificar a las células en base al tono que muestren, ya que esta es una característica que está demasiado influida por factores externos y, además, no resuelve bien los tres grupos celulares (células claras, oscuras e intermedias).
5. La presencia de cráteres o holes en las células control no guarda relación con ninguna de las características celulares analizadas en esta tesis doctoral.
6. Nuestro método para cuantificar el número de microproyecciones permite establecer, de forma precisa, el estado de la superficie celular.
7. La forma y densidad de las microproyecciones es, en general, uniforme a nivel intracelular pero muestra una clara variabilidad intercelular
9. La mayoría de las uniones intercelulares del epitelio corneal sano se muestran intactas, al margen del tipo celular estudiado. Por tanto la descamación no parece ser patrimonio de un tipo celular u otro, con lo que los tres tipos celulares se corresponderían con tres fenotipos diferentes que maduran de forma paralela en la superficie del epitelio.
10. Demostramos que las diferentes tonalidades presentes en las células epiteliales dependen del número de microproyecciones por unidad de superficie y de la disposición de las mismas.
Respecto a los cambios que sufre el epitelio corneal por falta de parpadeo
1. La privación de parpadeo provoca una degradación progresiva en las células del estrato superficial del epitelio corneal que se manifiesta, preferentemente, en la alteración y disminución de las microproyecciones y en la pérdida de las uniones intercelulares. También aparecen cambios significativos en el tamaño, forma y tono celular.
2. Los epitelios sometidos al tiempo de apertura palpebral (TAP) 0 y TAP 1 no presentan cambios morfológicos reseñables. Las alteraciones morfológicas empiezan a manifestarse a partir del TAP 2 (1 a 2h de apertura palpebral), aparecen limitadas a ciertas áreas y su número aumenta a medida que aumenta el TAP.
4. La descamación patológica, que el modelo de ojo seco desencadena, a partir del TAP 2, posee los rasgos morfológicos característicos de un proceso necrótico.
5. Las células aumentan de tamaño y se hacen más circulares. Estos cambios se inician de forma temprana y se mantienen en los diferentes TAP.
6. La tonalidad del mosaico celular se uniformiza a medida que aumenta el TAP y ello es debido a la perdida general de microproyecciones.
7. La presencia o ausencia de cráteres o holes está claramente influida por el TAP.
8. La disminución en el número de las microproyecciones es una de las primeras alteraciones que aparecen en la superficie epitelial. Dicha disminución va incrementándose progresivamente, y es el signo que guarda una relación más clara con el tiempo de apertura palpebral.
9. Las microproyecciones de la capa subyacente, observadas en el TAP 4 tras la exfoliación de grandes zonas, son cuantitativamente semejantes a las del epitelio control, aunque difieren cualitativamente porque presentan un aspecto mucho más granuloso.
10. La pérdida de las uniones intercelulares es progresiva, y aumenta medida que aumenta el tiempo de apertura palpebral.
11. Los tres tamaños celulares establecidos muestran idénticas alteraciones desencadenadas por el TAP. Sin embargo, la frecuencia de aparición de estas es diferente en los tres grupos.
grandes como la variabilidad de esta característica morfológica en el conjunto de células epiteliales.
13. Para valorar la progresión del deterioro de un epitelio sometido a una evaporación excesiva de lágrima, debe analizarse, ante todo, la rotura de las uniones intercelulares, especialmente entre las células más grandes.
14. Para discernir el estado general en el que se encuentra un epitelio es más exitoso el análisis por zonas, ya que corrige la falta de homogeneidad que sufre el epitelio mientras se deteriora célula a célula.
UNIVERSIDAD DE BARCELONA FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE ANATOMÍA Y EMBRIOLOGÍA HUMANA
Estudio de los cambios morfológicos del epitelio
corneal en un modelo animal de ojo seco
En este apartado hemos contrastado nuestros resultados con la literatura existente sobre el tema. El objetivo es proporcionar una explicación teórica plausible para las características morfológicas observadas en el epitelio corneal sano y para los cambios que el tiempo de apertura palpebral (TAP) desencadena en ellas.
En consecuencia, esta discusión está organizada en dos subapartados. En el primero discutiremos sobre la morfología de las células del epitelio corneal sano y en el segundo sobre los cambios que sufre dicho epitelio sometido a los diferentes TAP.
4.1. El epitelio corneal
En las observaciones realizadas en la presente tesis doctoral hemos descrito el estrato apical del epitelio corneal como una capa ininterrumpida con muy pocas células exfoliadas. Las imágenes obtenidas muestran una exfoliación del 0,2%, como comentamos en el capítulo de resultados. Esta cifra concuerda con la aproximación realizada por Doughty (1990 y 1991), según la cual, las células epiteliales en avanzado proceso de descamación representan menos del 0,5% del total de células fotografiadas con microscopía electrónica de barrido (SEM), en córneas de conejo sanas. En nuestro caso, al igual que Doughty, no hemos incluido este tipo de células en el estudio morfométrico, aunque si hemos descrito sus características morfológicas de visu.
Como en nuestro caso, varios trabajos (Doughty 1990, 1996 y 1997) (Renard et al 1983) describen a las células descamadas como células situadas por encima del epitelio, de tonos claros y brillantes, bordes redondeados y aspecto liso a 500x. Sin embargo, estas mismas células a 5000x presentan un aspecto rugoso que Renard et al (1983) atribuyen a la presencia de microvellosidades y microvilli cortos y serrados mientras que nosotros pensamos, como Doughty (1997), que este tipo de células poseen escasas o ninguna prominencia en la membrana celular.
Para nosotros, el aspecto rugoso de la membrana parece deberse, más bien, a pequeños poros y arrugas, en consonancia con el proceso degradativo que han sufrido las celulas. Ren y Wilson (1996b) demostraron que las células inviables o terminalmente diferenciadas presentan una disminución de la actividad metabólica y un incremento en la permeabilidad de la membrana. Esto último concuerda con el hecho de que las células descamadas tengan una superficie marcadamente porosa.
Estamos también de acuerdo con Doughty (1990, 1996, 1997) y Renard et al (1983) en que las células en proceso de descamación (células que aún mantienen ciertas uniones intercelulares con sus vecinas) se presentan en pequeños grupos, son oscuras, no tan redondeadas como las células descamadas y a veces muestran un núcleo manifiesto.
Que aparezcan en grupos concuerda con los descubrimientos de Buschke et al (1943) quienes observaron que las mitosis ocurren en grupos celulares de tres a seis células. Además, Lu, Reinach y Kao (2001) afirman que las células hijas de las células amplificadoras de transición migran conjuntamente de forma ascendente cuando inician su diferenciación terminal. En consecuencia, al final de este proceso sería lógico encontrarlas en un estadio similar del proceso de descamación.
la descamación de las células del epitelio corneal: la apoptosis (en sus diferentes categorías) y la diferenciación terminal. Todos ellos afectan a una célula individualmente o a pequeños grupos celulares, como aparecen en nuestras imágenes.
En cuanto al aspecto general del epitelio sano, en las imágenes obtenidas al microscopio electrónico de barrido (SEM), concuerda plenamente con la descripción consensuada como valida en la literatura. En general, el epitelio se presenta como un mosaico de células de diferentes tonalidades de gris, mayoritariamente tonos intermedios, con núcleos no manifiestos y uniones intercelulares intactas. El tamaño y la forma de las células son muy variados, aunque existe una mayoría de células pequeñas y de forma poligonal.
No obstante, en nuestros resultados hemos destacado, también, las diferencias de nitidez y contraste en las imágenes a 500x, causadas por la presencia de una fina película semitransparente que cubre total o parcialmente la imagen. A este respecto, Doughty (2004), trabajando con ojos de bovinos, estableció que dicha película desaparece si se realizar un lavado a presión con solución salina al 0,97%.
En dicho estudio no se establece de qué material está constituida la película semitransparente que desencadena las dificultades de visualización, aunque se propone que podría tratarse de células muertas. Las imágenes aportadas parecen demostrar que las córneas no se deterioran. Por lo tanto, pensamos que será necesario realizar nuevos estudios, con córneas de conejo, para comprobar la inalterabilidad de la muestra, siguiendo esta nueva técnica de lavado agresivo. Queda también por analizar la composición de la película semitransparente.
Pedrosa 1996) ni con SEM (Doughty 1990a) (Collin y Collin 2000a) (Doughty 2002). Sin embargo, dicha capa no se elimina totalmente, aún realizando lavados con diferentes sustancias (Renard et al en 1983) (Doughty 1990a). En consecuencia, es probable que en nuestras imágenes se observen restos de mucina en forma de manchas o hebras.
Por otro lado, Doughty observó que si se baña el epitelio con solución salina preservada (Doughty 1994) o con solución salina equilibrada (BSS) no preservada (2003) antes de la fijación el epitelio muestra, de forma esporádica, hebras de moco poroso y denso a los electrones (idénticas a las manchas observadas en nuestras imágenes). Para dicho autor estas manchas son hebras de mucina desnaturalizada, similares a las que aparecen en la queratoconjuntivitis seca o el penfingoide cicatricial. La diferencia es que, en este caso, los agentes desencadenantes de la desnaturalización son, según Doughty, los cationes divalentes presentes en las soluciones de lavado.
En conclusión, podríamos decir que las manchas amorfas observadas son, muy probablemente, hebras de mucina, desnaturalizada durante el proceso de adecuación de la muestra para su observación al SEM.
En el apartado de resultados también hemos descrito ciertas zonas de la córnea C03i que presentaban una proporción de células en proceso de descamación mucho más alta que en el resto de las imágenes. Para interpretar estas diferencias, debemos recordar que el proceso de renovación del epitelio corneal es el resultado de un complejo equilibrio entre la síntesis y la descamación celular (como se comentó ampliamente en la introducción de esta tesis doctoral). Por otro lado, el índice mitótico del epitelio es muy variable, incluso entre las dos córneas de un mismo individuo y, además, está sujeto a un ritmo circadiano (Fogle et al 1980) (Layker et al 1991).
Además, Ren y Wilson (1996b) han demostrado que la densidad de células inviables aumenta desde la periferia corneal hacia el centro con lo que dicha velocidad también variaría dependiendo de la zona en la que nos encontrásemos.
Es importante señalar que, la velocidad del proceso de exfoliación celular (o tasa de exfoliación) en el epitelio corneal no se conoce con exactitud. Los resultados de los estudios realizados son bastante dispersos, hecho que apunta también hacia la ausencia de homogeneidad en dicha tasa. Según una recopilación de diferentes estudios, realizada por Ren y Wilson (1996a), la tasa de exfoliación espontánea del epitelio corneal de conejo in vivo es de 5 a 15 células/minuto/córnea (si se considera un valor medio de 10 células correspondería aproximadamente a un 2,6% cada hora). Dicho valor es mucho más bajo que el estimado para los métodos de recolección in vitro (100 células/minuto/córnea, o sea un 26% cada hora).
Por otro lado, estas divergencias podrían ser debidas a las diferentes condiciones del epitelio, in vivo e in vitro. No obstante, para Burstein y Klyce (1977) la tasa de exfoliación in vitro es de 0,5% cada hora. Esta última tasa implica que el epitelio corneal de conejo se renueva completamente cada 8 días, igual que en el hombre, según Hanna et al (1961). Por su parte, Rigal (1993) considera que la renovación completa del epitelio humano se realiza en 7 días mientras que Oyster (1999) sostiene que el proceso completo es de 10 días.
En cuanto a la morfología de los cráteres o holes, decir que nuestra descripción es análoga a la realizada anteriormente por otros autores (Pfister y Renner en 1977, Francois et al en 1977 y 1980, Dormans y Van Logten en 1982 y Doughty (1990a,b,c). Pfister (1973) postula que estas estructuras formarían parte del fenómeno de descamación fisiológica. Sin embargo, Renard et al (1983) no comparten dicha hipótesis. Ellos consideran que los cráteres son fruto de una particular disposición de las microproyecciones. Para rebatir la propuesta de Renard y sus colaboradores diremos que los holes pueden ser de dimensiones bastante grandes, bordes claros y sobresalientes y superficie interior sin microproyecciones (oscura y lisa). Por tanto, es bastante inverosímil que las microproyecciones del interior hayan podido situarse en la periferia formando el anillo exterior, sin que ello suponga un deterioro de las mismas.
En nuestra opinión, los cráteres son zonas donde la membrana celular se ha roto. Dicha rotura se originaría debido al contacto directo de las células apicales con el medio externo. En concreto, las células subyacentes que aparecen en la superficie inician la reabsorción del citoplasma y el retraimiento de la membrana celular. Este último proceso se enfrentaría a las fuerzas que mantienen unidas unas células con otras, generando tensiones en la membrana que, finalmente, se rompería, formando holes. La aparente distribución al azar de estas estructuras sería consecuencia de las diferentes tensiones de retraimiento, según la forma de cada célula.
Pfister (1973) observó que los cráteres eran más frecuentes en el conejo que en las ratas, monos, gatos o perros. Quizás esto sea debido a la baja frecuencia de parpadeo del lepórido (una media de 3 parpadeos cada hora), que dificultaría el mantenimiento de una película lagrimal sin roturas, lo que supone un mayor contacto con el medio externo.
y liberando, así, tensiones de la membrana. Por lo tanto, en dicho estadio no se formarían holes. Es más, la propia retracción ocultaría los que existieran con anterioridad. En resumen, los cráteres o holes formarían parte de la diferenciación terminal pero ya se habrían formado cuando el proceso descamativo se inicia.
Este podría ser el motivo por el que las células en avanzado proceso de descamación no presentan cráteres en su superficie. Tampoco suelen presentar cráteres aquellas células que han sufrido un marcado deterioro superficial, como es el caso de algunas de las células sometidas a tiempos de apertura palpebral largos. Ello podría deberse a la pérdida de elasticidad, grosor y otras propiedades de la membrana, como consecuencia de las condiciones adversas a las que ha sido expuesto ese epitelio corneal.
Por su parte, Collins y Collins (2000) (como ya comentamos en la introducción) observaron estructuras similares a los cráteres en el epitelio corneal de peces y apuntaron que podrían ser poros externos de las células caliciformes porque estos se hallaban, frecuentemente, en la zona de unión de tres o más células.
Es importante puntualizar que en el epitelio corneoconjuntival del conejo existen diversos tipos de poros u orificios, que morfológicamente son diferentes a los cráteres (Doughty 1997) y algunos de ellos se consideran poros glandulares. Por otro lado, la posición de los cráteres o holes, que nosotros hemos observado en el epitelio corneal, es muy variada (como se puede observar en nuestras imágenes) y tanto pueden encontrarse entre células como en medio de la superficie celular. En consecuencia, no parece que Collins y Collins estén hablando de las mismas estructuras a las que nosotros nos referimos.
Dicho de otro modo, la ausencia o presencia de cráteres no parece estar relacionada ni con la densidad de microproyecciones ni con las variables tonales (tono de la célula, tomo medio de las microproyecciones o tono medio de la membrana), ni con una forma o talla celular determinada, ni, aparentemente, con las uniones intercelulares. Respecto a esta última variable, cabe señalar de nuevo que, las células descamadas o en proceso de descamación avanzado no se han incluido en el estudio morfométrico.
También hemos podido establecer que, la presencia o ausencia de cráteres se ve afectada por las condiciones de sequedad extremas provocadas por la falta de parpadeo. Como lo demuestra el hecho de que, la variable holes está presente en todos los modelos predictivos del TAP como una de las variables significativas. Sin embargo, el carácter binario de holes proporciona una información restringida. Por ello, pensamos que son necesarios nuevos estudios con una nueva variable de carácter numérico, que permita concluir más sobre este tema.
Otro aspecto del epitelio sano, que es importante comentar, es la morfología de las microproyecciones de la membrana. En el apartado de resultados hemos comentado que, en general, la forma y densidad de las microproyecciones es uniforme a nivel intracelular pero variable si se comparan unas células con otras. A este respecto, existe un consenso en la literatura, con el que concuerdan nuestros resultados (Rigal 1993).
No obstante, hemos encontrado algunas células, sobre todo oscuras, que presentan bordes celulares con una densidad de microproyecciones menor que en el área celular central. Otros autores también mostraron estas diferencias intracelulares (Doughty 1996) (Rigal 1993) en epitelios sanos. En consecuencia, se han considerado normales.
clara y definitiva, como sucede en las imágenes de epitelios corneales de peces, presentadas por otros autores (Collins y Collins 2000) (Harding et al 1974). Por el contrario, si aparecen microvilli adoptando diferentes posiciones en el espacio. En concreto, hemos observado (como expusimos en los resultados) que algunos de los supuestos micropliegues parecen ser el resultado de la unión en filas de varios microvilli erectos.
Al igual que Doughty (1990) pensamos que la complejidad de la distribución espacial de estas estructuras impide hacer medidas fiables de sus dimensiones, con imágenes al SEM. Además, no podemos saber con certeza por qué las microproyecciones adoptan estas diferentes disposiciones. La causa podría ser el peso de la mucina, como argumentó Pfister (1973), el propio crecimiento longitudinal que, por acción de la gravedad, doblaría el microvilli, o, quizás, las presiones entre células que al tensionar más o menos la membrana celular dejarían a los microvilli tensos y erectos o flácidos y curvados.
En lo que respecta a la caracterización de los diferentes tipos celulares, nuestros resultados concuerdan con la idea, ampliamente aceptada en la literatura, según la cual las células pequeñas son, en general, las más claras mientras que las grandes son las más oscuras. En cuanto al grupo de células de áreas intermedias, presentan tonos intermedios, como algunas de las células pequeñas y grandes. También en consonancia con lo descrito en la literatura hemos observado que los tonos intermedios son los más frecuentes. Pero, desde un punto de vista estadístico no hemos podido diferenciar tres tipos celulares en base al tono ya que sólo aparecen diferencias significativas en la tendencia central de las células pequeñas frente a las grandes.
poseen un coeficiente de correlación mayor, por lo que parecen estar íntimamente relacionadas.
Estos resultados concuerdan con los de Doughty (1990b) en varios aspectos. En primer lugar, estamos de acuerdo con este autor en que el epitelio muestra una elevadísima variabilidad en sus características celulares que, a veces, dificulta la obtención de resultados concluyentes. En segundo lugar, confirmamos que la distribución de áreas celulares en las células control no es normal y en tercer lugar, y más importante, pensamos como Doughty que, para poder diferenciar los tipos celulares el factor área es más idóneo que el factor tono celular.
El tono de las células es un factor relacionado con ciertas características morfológicas celulares. Sin embargo, está demasiado influenciado por las condiciones de preparación y observación de la muestra como para ser utilizado, con éxito, en la clasificación de una población, con tanta variabilidad, como la que nos ocupa. No obstante, se ha venido empleando como tal, de forma general, durante muchos años.
Nosotros proponemos utilizar una combinación de área y forma para establecer los tres tipos celulares presentes en el epitelio corneal sano, puesto que, estos son los rasgos más discriminantes, como ha quedado demostrado con nuestros resultados estadísticos.
No podemos obviar que, gracias a los trabajos de Doughty (1990 a 2004) nos decidimos a utilizar el área celular para clasificar inicialmente a las células, en contra de una mayoría de estudios que empleaban el tono celular. Aunque en muchos de sus trabajos Doughty también emplea el tono para clasificar, siempre compara áreas y formas para diferenciar un grupo de otro.
Hasta ahora hemos discutido todas las características morfológicas analizadas en esta tesis, excepto las uniones intercelulares y la densidad de microproyecciones. Esta última, la hemos podido cuantificar mediante la variable superficie ocupada por microproyecciones (SOM) que representa el % de la superficie celular ocupada por dichas prominencias. A su vez, hemos obtenido la variable binarizando la imagen y calculando el porcentaje del área celular que ocupan las microproyecciones de la membrana (ver más detalles en el capítulo de material y métodos).
La variable SOM es, quizás, una de las claves de esta tesis doctoral pues nos ha permitido establecer un parámetro objetivo y cuantificable para comparar las características de las microproyecciones entre células. Hasta el momento, nadie había podido cuantificar, de forma rigurosa, la cantidad de microproyecciones por unidad de superficie que presenta una célula.
Pfister (1973) estableció unos valores (26 microvilli/µm2 para las células oscuras y 13 microvilli/µm2 para las claras), utilizado imágenes de microscopía electrónica de barrido tomadas bajo diferentes ángulos. Sin embargo, dicho autor no indicó el método utilizado (suponemos que fue una aproximación después de contar visualmente los microvilli de una zona celular de tamaño determinado). Los resultados de Pfister indican, claramente, que las células con más densidad de microproyecciones son las oscuras (el doble que en las claras), aunque estas prominencias se muestran, según dicho autor, más cortas (0,25µm de longitud en las células oscuras y 0,6 µm en las células claras).
A este respecto, nosotros hemos comprobado que la densidad de las microproyecciones visibles al SEM (con las técnicas de fijación convencionales) es mayor en las células pequeñas (que suelen ser las más claras) y en las clasificadas como de tamaño intermedio (cuyos tonos de gris son intermedios) que en las grandes (oscuras). De este modo, el epitelio control posee una elevada densidad de microproyecciones, que se muestra relativamente menor en las células grandes.
No hemos encontrado diferencias en la tendencia central de la variable SOM
entre las células pequeñas y las medianas. Así mismo, las gráficas de dispersión muestran una población de células medianas con valores de SOM
muy semejantes a los de las células pequeñas, sin ninguna tendencia general diferencial. Estos resultados podrían ser debidos a una falta de sensibilidad de la variable. No obstante, nuestras observaciones visuales van en la misma dirección, ya que, sólo hemos podido establecer inequívocas diferencias entre las células claras y las oscuras.
Por otro lado, el cálculo de la SOM, puede estar influenciado no sólo por la densidad de las microproyecciones sino también por la disposición espacial que adoptan dichas prominencias en la superficie celular, aunque esta última característica no parece ser tan determinante.
Hipotéticamente, una disposición paralela (horizontal) a la superficie celular aumentaría el valor de la SOM mientras que una disposición perpendicular (vertical) disminuiría dicho valor. Sin embargo, una célula con elevada densidad de microproyecciones (como sucede en casi todas las células control) tendrá siempre una SOM elevada, sea cual sea la disposición de las mismas, tal y como hemos comprobado en esta tesis.
distorsionante de la variabilidad en la disposición no afectaría al cálculo de la densidad.
Por el contrario, las células con densidades intermedias podrían presentar una sobreestimación de la SOM, por efecto de la disposición espacial de las microproyecciones y, de hecho, es probable que así haya sucedido. En este caso, las prominencias celulares mantienen su aspecto vermiforme y suelen doblarse y disponerse horizontalmente. Dicho efecto podría ser el causante de la falta de diferencias significativas entre la SOM de las células pequeñas y las medianas, si es que en realidad existen.
En resumen, podemos afirmar que a partir de cierto tamaño existe una tendencia a la disminución del número de microproyecciones. Si las células medianas poseen una densidad de microproyecciones igual o algo menor que las pequeñas deberá ser confirmado en posteriores estudios.
Por lo que respecta a la adherencia entre células vecinas, nuestros resultados demuestran que la mayoría de las uniones intercelulares del epitelio corneal sano están intactas, como era de esperar. Además, hemos comprobado que los diferentes tipos celulares (células pequeñas, medianas y grandes) no presentan diferencias en la tendencia central de la variable uniones
intercelulares.
Ello nos lleva a afirmar que, la descamación no parece ser patrimonio de un tipo celular u otro, como cabría esperar atendiendo a la hipótesis de Pfister (1997), según la cual, los tipos celulares se corresponderían con diferentes estadios de madurez celular. Las células claras serían las más jóvenes y las oscuras las más viejas.
Por su parte, Doughty (1996), basándose en la heterogeneidad de las células claras, propone (como ya se comentó en la introducción) que los diferentes tipos celulares serían el resultado de tres fenotipos diferentes que madurarían de forma paralela en la superficie celular. Nuestros resultados apoyarían esta hipótesis.
Es obvio que, las imágenes de microscopía electrónica de barrido sólo pueden aportar indicios que ayuden a confirmar o rebatir alguna de estas hipótesis y, en ningún caso, serán absolutamente concluyentes. Por lo tanto, el origen de los tres tipos celulares queda por resolver.
En otro orden de cosas, parece lógico pensar que, las diferentes uniones intercelulares observadas (sobre todo al impedir el parpadeo en el conejo) se corresponden con progresivos estadios del proceso de descamación celular. De este modo, una célula con uniones intactas (categoría 1) no habría iniciado el proceso descamativo mientras que otra que hubiera perdido gran parte de sus uniones intercelulares (categoría 0,2) estaría en las fases finales de la descamación. A su vez, las uniones de categoría 0,8 iniciarían un proceso de perdida de adherencia mostrando sus bordes celulares perfectamente unidos pero elevados respecto de la superficie celular, razón por la que aparecen más claros y marcados.
En el epitelio control la variabilidad de las uniones intercelulares es mínima. Además, las células descamadas o en avanzado proceso de descamación (<0,5%) no producen discontinuidades en dicho tejido, al contrario de la descamación causada por una evaporación excesiva de lágrima (como comentaremos más adelante). Todo ello confirma que, la descamación fisiológica es paulatina, de modo que, permite una regeneración completa antes de la total descamación de las células más superficiales, como se describe en la literatura (Duane y Jaeger 1990) (Remington 1998).
microscopía electrónica de barrido, consta de dos elementos: la imagen de las microproyecciones y la imagen de la membrana celular desnuda, que aparece entre dichas prominencias. Para calcular las variables se han desestimado aquellas zonas de la célula en las que aparecían artefactos. En consecuencia, el tono celular, en nuestras imágenes, sólo puede ser originado por el tono de las microproyecciones y por el de la membrana.
Nosotros hemos demostrado que el tono de la membrana apical de las células del epitelio corneal es un valor casi constante, por lo que no puede ser el causante de los cambios de tonalidad intercelular. Este resultado concuerda con la idea de que el epitelio sano es una superficie lisa y uniforme. Si alguna célula estuviera en un plano marcadamente superior su membrana celular aparecería, en las imágenes al SEM, con un tono más claro.
En cambio, la tonalidad media de las microproyecciones varia de unas células a otras. Ello quiere decir que algunas células poseen microvilli más erectos que otras o que el microvilli se está degradando (cambiando su composición). En nuestros resultados se observa como la variable tono mediomcp disminuye, por termino medio, y presenta mayor variabilidad a medida que la célula aumenta de tamaño.
Este comportamiento es análogo al que presenta la variable tono que cuantifica el tono de una célula a 500x. Además, las dos variables, tono
mediomcp y tono poseen una de las más altas correlaciones encontradas en la
muestra de células. Por lo tanto, todo parece indicar que el tono de una célula a 500x depende claramente del tono de sus microproyecciones.
Por otro lado, existe otra característica de las microproyecciones que podríamos considerar artífice del tono celular, esta es su densidad (número de prominencias por unidad de superficie). La variable utilizada para cuantificarla,
superficie ocupada por microproyecciones (SOM), se comporta como la
variable tono y la variable tono mediomcp adquiriendo valores más bajos y más dispersos a medida que el área celular aumenta. En cuanto a las correlaciones,
Así, podemos considerar que el diferente tono que muestran las células en las imágenes al SEM, es el resultado de, por un lado, la mayor o menor verticalidad de las microproyecciones o su degradación y, por otro, de la cantidad de dichas prominencias por unidad de superficie. De este modo, confirmamos cuantitativamente lo que algunos autores habían apuntado de forma cualitativa (Dormans y van Logten 1982) (Lohman et al 1982) (Doughty 1990a) (Collin y Collin 2000a). El tono celular depende de la densidad de microproyecciones y de su morfología en toda su longitud.
No obstante, somos conscientes de que, la mucina podría ser un factor determinante del tono celular (Waggone y Philip 1981) (Renard et al 1983) Hazlett (1984). Por tanto, nuestros resultados serán validos para aquellas imágenes de muestras sometidas a una fijación convencional, como la que nosotros hemos realizado. Ahora bien, si más adelante se descubre un método para eliminar eficazmente la totalidad de la capa mucínica, también se podrá aplicar el cálculo de nuestras variables tonales y de la variable SOM para establecer las relaciones pertinentes.
En otro orden de cosas, se podría suponer que las tres características de las microproyecciones, densidad, posición vertical y composición, de las cuales depende el tono celular, están relacionadas. De este modo, un mayor número de microproyecciones conduciría a un tono medio de las mismas más alto, o al revés. Sin embargo, de nuestros resultados se deduce que una mayor o menor densidad de microproyecciones no está relacionada con una mayor o menor verticalidad de las mismas. Por ejemplo, una célula que posea una elevada densidad de microproyecciones puede presentar microproyecciones erectas o dispuestas horizontalmente (tal y como se observa en algunas de nuestras imágenes), aunque el tono celular será distinto en cada caso.
