Efecto in vitro de extractos de membrana de bartonella bacilliformis sobre células de cordón umbilical

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ESCUELA DE POSTGRADO. PO. SG. RA DO. SECCION MAESTRIA EN CIENCIAS. DE. EFECTO IN VITRO DE EXTRACTOS DE MEMBRANA. IT A. L. DE Bartonella bacilliformis SOBRE CELULAS DE. G. CORDON UMBILICAL. MENCION g FARMACIA CLINICA. BL I. O. TE CA. DI. TESIS PARA OPTAR EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS. BI. Tesista Bach. HERMES EBERARDO ESCAJADILLO BELLO Asesor : Mg. JOSÉ LIZARDO CRUZADO RAZCO TRUJILLO-PERU 2015. Nro de Registro...... i. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. SG. RA DO. JURADO DICTAMINADOR. Dr. William Antonio Sagástegui Guarniz. TE CA. DI. G. IT A. L. DE. PO. PRESIDENTE. Mg José Lizardo Cruzado Razco. SECRETARIO. BI. BL I. O. MIEMBRO. Mg César Demófilo Gamarra Sánchez. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RA DO. DEDICATORIAS. En recuerdo de mis padres:. PO. SG. Augusto y Rita. DE. A. IT A. L. Lila Consuelo , mi esposa. A. Mis adorables hijas Sandra Paola, Mónica Cecilia y Cinthia Vanessa por el inmenso amor que les profeso.. BI. BL I. O. TE CA. DI. G. por su apoyo y comprensión.. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. AGRADECIMIENTOS. RA DO. Al Mg Lizardo Cruzado Razco. DE. PO. SG. por su esmerado asesoramiento.. IT A. L. Al personal médico del Hospital Belén por su invalorable apoyo en la. BI. BL I. O. TE CA. DI. G. recolección de las muestras.. A la plana docente de la sección de Ciencias De la Escuela de Postgrado de la Universidad Nacional de Trujillo , por los conocimientos brindados en nuestra formación académica.. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RA DO. PRESENTACION. Señores. SG. Miembros del Jurado Dictaminador. PO. PRESENTE. DE. En cumplimiento de normas reglamentarias me permito poner en su consideración el informe. “ Efecto in vitro de extractos de membrana de Bartonella bacilliformis. L. de tesis intitulado. IT A. sobre células de cordón umbilical “ con la que pretendo obtener el grado de Master en Ciencias. DI. G. , mención Farmacia Clínica , si sus criterios fueran favorables.. Trujillo, Enero del 2015. BI. BL I. O. TE CA. Con ese motivo expreso a Ustedes mi más respetuoso agradecimiento. .................................................................... Bach. HERMES EBERARDO ESCAJADILLO BELLO. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. INDICE. RA DO. RESUMEN ABSTRACT. I. INTRODUCCION ................................................................................. 1. SG. II. MATERIAL Y METODO....................................................................... 6. PO. III. RESULTADOS ................................................................................... 9 IV. DISCUSION .................................................................................... 13. DE. V. CONCLUSION ................................................................................. 16 VI. RECOMENDACIÓN ......................................................................... 17. BI. BL I. O. TE CA. DI. G. IT A. L. VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ..................................................... 18. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN El presente trabajo de tesis se realizó con el objetivo de determinar la influencia de los extractos de membrana de Bartonella bacilliformis in vitro sobre células aisladas de cordón umbilical y que por antecedentes registrados, corroborar la posibilidad que éste tiene de estimular la. RA DO. diferenciación de células madres mesenquimales en Linfocitos.. Se tomaron 60 muestras de cordón umbilical, con una longitud promedio de 40 cm en viales estériles conteniendo cada uno 20 mL de medio de cultivo celular Waymouth con antibiótico a. SG. 100 UI/ mL de Penicilina y 100 ug/mL de Estreptomicina se codificó y se conservó a - 40°C hasta su procesamiento. Los cultivos de Bartonella bacilliformis fueron obtenidas en el laboratorio de. PO. Toxicología de la UNT.. Se dividieron en cuatro grupos, cada uno con 15 muestras, A, B, y C los grupos problema y D el grupo testigo o blanco.. DE. El procesamiento de las muestras se realizó inicialmente haciendo el homogeinizado de los mismos y luego se le añadió 0.5 mL de colagenasa y 2 mL de Waymouth con gentamicina y V. L. gotas de extracto de membrana de Bartonella bacilliformis , no se añadió extracto de membrana. IT A. a las muestras testigo y se incubaron a 37°C durante 72 horas .,luego se centrifugó a 3000 rpm por 15 minutos , guardando el sobrenadante a -40°C para identificar la IL-2 y con el precipitado. G. se preparaba un frotis dos por cada muestra.. TE CA. 100 campos microscópicos.. DI. La lectura se hacía a 100 x (inmersión), siguiendo la técnica de Almena, se contaron las células en. Similar procedimiento se hizo con los preparados de las muestras testigos. La identificación de la IL-2 se realizó en los sobrenadantes de la inducción mediante espectrofotometría UV a 582 nm de longitud de onda.. O. Los resultados fueron la identificación de la IL-2 en las muestras, las mismas que presentaron. BL I. picos similares a la muestra patrón de IL-2 a 582 nm de longitud de onda., y en los campos microscópicos Linfocitos CD4+ como resultado del proceso de transformación de células madres. BI. mesenquimales de cordón umbilical en Linfocitos CD4+ por efecto de los extractos de membrana de Bartonella bacilliformis.. PALABRAS CLAVES: Células madres, extractos de membrana de Bartonella bacilliformis, Interleucina -2, Linfocitos CD4+ vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT The present thesis work was carried out with the objective of determining the influence of extracts of membrane of Bartonella bacilliformis vitro on cells isolated from umbilical cord and that for registered background, corroborate the possibility it has to stimulate the differentiation. RA DO. of stem cells in mesenchymal cells.. 60 samples of umbilical cord, with an average length of 40 cm in sterile vials containing each 20 mL of culture medium cell Waymouth with antibiotic to 100 IU / mL penicillin and 100 ug/mL. SG. streptomycin was coded and kept at - 40° C until processing. Crops of Bartonella bacilliformis were obtained in the laboratory of Toxicology of the UNT.. PO. They were divided into four groups, each with 15 samples, A, B, and C the problem groups and (D) the Group witness or white. Processing of the samples was carried out initially by the homogeinizado of them and then added 0.5 mL collagenase and 2 mL of Waymouth with. DE. gentamicin and V drops of extract of membrane of Bartonella bacilliformis, not membrane extract was added to samples witness and incubated at 37 ° C for 72 hours., then centrifuged at. L. 3000 rpm for 15 minutes storing the supernatant at.. IT A. The reading was 100 x (DIP), following the technique of Almena, counted the cells in 100 microscopic fields. Similar procedure was done with the prepared samples witnesses. The. G. identification of the IL-2 was carried out in the supernatants of induction by UV. DI. spectrophotometry at 582 nm wavelength.. TE CA. The results were the identification of IL-2 in the samples, which are presented peaks similar to the sample pattern of IL-2 at 582 nm wave length, and microscopic fields CD4 + lymphocytes as a result of the process of transformation of stem cells mesenchymal of umbilical cord in. O. lymphocytes CD4 + by effect of the extracts of membrane of Bartonella bacilliformis.. BL I. KEY words: Cell mothers, extracts of membrane of Bartonella bacilliformis,. BI. interleukin - 2, CD4 + lymphocytes.. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. INTRODUCCION. RA DO. La respuesta inmune innata en los mamíferos , es fundamental durante la etapa inicial de la defensa del huésped contra la infección por bacterias , virus , hongos , protozoarios. antes que. se desarrolle la inmunidad adquirida antígeno- específica . Para sobrevivir dentro del ambiente hostil del huésped, las bacterias patógenas utilizan un conjunto de proteínas capaces de interferir. SG. con las rutas de transducción de señales, cuyo objetivo final es eliminar los microorganismos. Se han estudiado los mecanismos que emplean las bacterias patógenas para sobrevivir dentro del. PO. huésped y evitar que la respuesta inmune innata y/o adquirida las elimine6,2 .. La autoinmunidad constituye un problema polimórfico de salud, se han identificado más de. DE. doscientas enfermedades que tienen su origen en la autoinmunidad, y debe ser atendido para mejorar las condiciones de vida de éstos pacientes. En nuestro país , se ha iniciado una nueva etapa en el tratamiento de la Diabetes tipo I o insulino dependiente que registra alta incidencia. IT A. L. en la sociedad, se ha implantado en áreas de las células beta del páncreas cultivo de células madres de médula ósea , de los propios pacientes , los resultados obtenidos son satisfactorios,. G. en éstos casos , no se encuentran razones éticas que limiten su aplicación ; similarmente sucedió con cuadros de infartos miocárdicos , en los que recibieron cultivos de células madres del propio. DI. paciente en áreas del miocardio que presentaron tejido necrosado , sus resultados también son. TE CA. buenos. 15,17. En caso de pacientes quemados, que sufren graves tragedias y que mayoritariamente fallecen, pueden salvar sus vidas si se aplicase como método de ayuda la administración de cultivo de células madres, para mejorar la proliferación de células en el tejido dañado.. O. La células madres obtenidas del cordón umbilical tienen más beneficios que las que son. BL I. obtenidas de la médula ósea o de la sangre periférica porque al ser inmunológicamente inmaduras, son más proliferas (alta compatibilidad con los demás familiares), no tienen el mismo. BI. proceso de envejecimiento, ni exposición a virus externos. Adicionalmente, están disponibles en el momento que se necesiten14 . Estas células madre son 100% compatibles con el dueño de ellas y pueden ser altamente compatibles con la de sus hermanos, padres y familiares. Existen ciertas enfermedades que no pueden ser tratadas con las células madre de uno mismo, y se buscará a un donador.. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El tiempo que pueden permanecer vivas las células madre criopreservadas no se conoce con exactitud, pero existen muestras tomadas hace más de 15 años que siguen en estado óptimo, por lo que se cree que pueden durar tranquilamente el tiempo de vida de una persona promedio. Las aplicaciones de las células madre en la medicina, recién se está iniciando y su investigación y. RA DO. desarrollo ofrecen mejores resultados ; actualmente se pueden usar en el tratamiento de enfermedades como algunos tipos de leucemias (linfocítica aguda, mielocítica crónica, mielógena aguda), Linfoma de tipo no Hodgkin, Mieloma múltiple, Neuroblastoma, anemias (aplástica, Sachs, Beta Talasemia, inmunodeficiencia combina severa15,16 .. SG. Fanconi, Falciforme), osteoporosis, Lupus, síndrome de Wiskott Aldrich, síndrome de Hunter, Tay. Se realizan estudios de terapia celular aplicada en la reparación de daño cerebral luego de una. PO. embolia, daños en la médula espinal, tratamientos de enfermedades cardiovasculares, diabetes, cáncer (ovarios, testículos, mama, pulmón), melanoma, regeneración de tejidos, sida, alzheimer,. DE. parkinson, artritis reumatoide, cirrosis, etc. También se realizan estudios en la terapia genética16. Los sistemas de secreción bacterianos son complejos multiproteicos que se expanden a través. L. de las membranas bacterianas, permitiendo el intercambio de moléculas entre la bacteria y el. IT A. medio que le rodea, o incluso dentro de la propia bacteria entre distintos compartimentos. Son muchas las moléculas que son transportadas por estos canales, desde un amplio rango de. G. proteínas hasta moléculas de DNA. Más amplia aún es la importancia biológica de estos sistemas,. DI. ya que están relacionados directamente, por ejemplo, con la rápida dispersión de resistencias a antibióticos, la plasticidad genómica la virulencia de distintas bacterias y el propio metabolismo y. TE CA. biogénesis de las bacterias 1,7,9 .. Los sistemas de secreción han sido clasificados en diversos grupos en función de las moléculas transportadas, la biosíntesis, estructura y relaciones entre ellos. En bacterias Gram-negativas, se. O. han caracterizado las siguientes familias de sistemas de secreción: Tipo I (T1SS), Tipo II (T2SS),. BL I. Tipo III (T3SS), Tipo IV (T4SS), Tipo (T5SS), y Tipo VI (T6SS). Recientemente se ha descrito otra familia de sistemas de secreción (Tipo VII, T7SS específicos de bacterias Gram-positivas.. BI. Típicamente, los T2SS están compuestos por entre 12 y 16 proteínas llamadas Gsp (General secretion pathway) (Filloux, 2004). Todas ellas se ensamblan en un complejo multiproteíco que constituye una gran estructura (el secretón) que une el periplasma y lo conecta con el espacio. extracelular a través de la membrana externa e interna. La secretina GspD conformaría en la membrana externa un anillo con una cavidad central de entre 50 y 90 Å en función de las especies (Bitter, 2003) 13 . 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. B. bacilliformis, patógeno humano muy virulento que puede causar la muerte, representa el linaje ancestral más representativo de Bartonella, en el cual no se encuentra ninguna clase de T4SS, ni siquiera ningún remanente de ello que pudiera indicar la presencia de un T4SS en el antecesor y que luego se perdiera. En esta especie, el ciclo de infección de células endoteliales y. RA DO. eritrocitos se desarrolló en ausencia de ningún T4SS. Sin embargo, las especies modernas codifican al menos un T4SS que ha adoptado funciones esenciales en la estrategia de infección, pudiendo remplazar probablemente diversos factores de virulencia requeridos por B. bacilliformis, y permitiendo a la bacteria una mayor adaptación al huésped. Por lo tanto, en estos. SG. casos la perdida de virulencia ha provocado una mayor adaptación y una rápida expansión (Dehio, 2008) 11,12,13 .. PO. El primer T4SS en Bartonella fue identificado relativamente hace poco, al tratar de encontrar el gen que codificaba la proteína frente a la cual se creaban antígenos (VirB5) tras una infección por. DE. Bb (Padmalayam et al., 2000; Schmiederer and Anderson, 2000). La organización genética y la secuencia de los genes virB está altamente conservada entre distintas especies modernas de. L. Bartonella (Saenz et al., 2007). IT A. El sistema VirB resulta imprescindible para todos los fenotipos asociados con una infección por Bb de células endoteliales vasculares de cordón umbilical humano (HUVECs) (Schmid et al.,. G. 2004).. DI. Los efectores secretados a la célula huésped provocan en ella una serie de cambios y respuestas como:. TE CA. - Reordenamientos masivos del citoesqueleto de la célula permitiendo la formación de una estructura llamada invasoma. Primero se forma una reagrupación de las bacterias formando esta estructura, y posteriormente se internalizan (Dehio et al., 1997).. O. - Activación de la respuesta inflamatoria. Se piensa que la activación de la respuesta inflamatoria. BL I. provoca el reclutamiento de fagocitos que tras la infección por parte de Bb liberan factores proangiogénicos, como el factor VEGF (vascular endotelial growth factor), lo que promueve la. BI. proliferación celular (Dehio, 2005; Fuhrman et al., 2001; Resto-Ruiz et al., 2002) Investigaciones recientes se ha comprobado la inducción de receptores denominados VCAM_I (vascular cell adhesión molecule), éste es un receptor para monocitos y linfocitos. Se sabe que las células endoteliales no forman éste tipo de receptores, pero en presencia de TNF la expresión de éstos se incrementa. La citoquina TNF se libera como consecuencia de la lisis o lesiones endoteliales. La inducción del receptor. ICAMI (intercellular. adhesion molecule), es 3. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. generalmente inducida en las células endoteliales y sirve de receptor para los leucocitos. La expresión de ésta molécula se incrementa con la presencia de interleukina I (IL-1). La citoquina TNF alfa, induce otro receptor que se denomina ELAM I. (endotelial leukocite adhesión. molecule), denominada también Selectina. Este receptor es el encargado de la adhesión de PMN 4,8. .. RA DO. neutrófilos en endotelios de capilares. La hipersensibilidad retardada adquirida es un mecanismo desarrollado por el sistema inmune en el que participan células presentadoras de antígenos.. Los Antígenos, lo unen a su receptor, lo internalizan y lo procesan en vesículas endosómicas. son degradadas por enzimas presentes en los endosomas y. SG. Estas proteínas endocitadas. lisosomas para generar pequeños péptido (10 a 30 AA) que podrán unirse a las moléculas del. PO. MHCII. Estas son sintetizadas en el Retículo endoplásmico rugoso y luego son transportadas al endosoma donde se unen a los péptidos. Luego este complejo péptido-MHCII son presentados. DE. en la membrana de los macrófagos. A éstos receptores se unen los linfocitos memoria, denominados coadyuvantes (Th-1) que hace el reconocimiento, al mismo tiempo libera IL-2 que. L. mediante procesos autocrinos y paracrino estimulan la proliferación de linfocitos .Después sigue. IT A. el proceso de diferenciación celular y los linfocitos juveniles se convierten en linfocitos denominados CD4 + que se activan y se transforman en linfoblastos o células activadas. En éste. G. estado, éstos blastos sintetizan gamma interferón (Gamma-IF) que actúa sobre receptores de. DI. células presentadoras de antígenos (CPA) macrófagos. Asimismo, inducen receptores para que el interferón gamma pueda disponer la apoptosis de las células infectadas.. TE CA. El balance entre la capacidad de los macrófagos para reconocer a los patógenos bacterianos y la habilidad del patógeno para modular las rutas de transducción de éstas células determina con frecuencia el resultado final de una infección. Una de las rutas de transducción de señales más. O. importantes en las respuestas inmunes innata y adquirida es la mediada por la activación del. BL I. factor nuclear kB (NF-kB). La actividad de NF-kB da como resultado la transcripción de genes que codifican citocinas, factores de crecimiento, proteínas de fase aguda, inmuno-receptores, otros. BI. factores de transcripción, moléculas de adhesión celular, proteínas virales y reguladores de la apoptosis.. La primera ruta que activa A NF-kB, por medio del complejo IKK, está localizada exclusivamente en los linfocitos. Se involucra al receptor de células T (TCR), a la proteína cinasa C (PKC) y a (MAGUK) y a la proteína Bcl-10 asociada a la mucosa del tejido linfoide -1 (MALT-1). La regulación defectuosa del NF-kB está relacionada con el cáncer, enfermedades inflamatorias y 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. autoinmunes, shock séptico, infecciones virales o un desarrollo inmune inadecuado4,5,6,15. Nuestro propósito es demostrar que los extractos de membrana de Bartonella bacilliformis tienen algún efecto sobre las células madres aisladas de muestras tomadas de cordones. RA DO. umbilicales en los servicios de Gineco-obstetricia del Hospital Belén de Trujillo.. PROBLEMA:. ¿Cuál es el efecto in vitro de los extractos de membrana de Bartonella bacilliformis sobre las células madres de cordón umbilical de recién nacidos?. SG. HIPOTESIS. Por los antecedentes registrados en el comportamiento de la Bartonella bacilliformis es posible. BI. BL I. O. TE CA. DI. G. IT A. L. DE. PO. que estimula la diferenciación de las células madres en células linfocíticas.. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. MATERIAL Y METODOS 1.0 MATERIAL DE ESTUDIO 1.1 Se tomaron sesenta (60) muestras de cordón umbilical en las salas de Gineco –. RA DO. Obstetricia del Hospital Belén de Trujiillo con una longitud promedio de 40 cm., en viales estériles conteniendo 20 mL de medio de cultivo celular Waymouth con antibiótico a 100 UI/ mL de Penicilina y 100 ug/mL de Estreptomicina se codificó y se conservó a - 40°C hasta su procesamiento.. SG. 1.2 Cultivos de Bartonella bacilliformis, cuyas cepas fueron obtenidas en el Laboratorio. 2.0 TECNICAS Y PROCEDIMIENTOS : 15 muestras. Grupo B Problema. : 15 muestras. Grupo C Problema : 15 muestras. : 15 muestras. IT A. Grupo D Blanco. L. Grupo A Problema. DE. 2.1 Las muestras se dividieron en cuatro grupos:. PO. de Toxicología de la UNT.. DI. G. 2.2 CULTIVO DE Bartonella bacilliformis:. Con las cepas obtenidas se formó un pool y se cultivó en medio bifásico (agar sangre y. TE CA. solución salina fisiológica estéril). Se incubó a 28°C durante 10 días.. O. 2.3 COSECHA DE Bartonella bacilliformis:. BL I. Se retiraron los frascos de cultivo de la incubadora, con el asa bacteriológica se frotó suavemente la superficie del medio con la finalidad de desprender las cepas adheridas al. BI. medio; la suspensión se trasvasó a tubos de centrífuga estériles y codificados. Se centrifugó a 3000 rpm durante 15 minutos, se eliminó el sobrenadante, se resuspendió el precipitado en suero fisiológico y nuevamente se centrifugó a 300 rpm – Este proceso se repitió 5 veces con la finalidad de eliminar aquellas partículas del medio de cultivo que estuvieran presentes.. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 3.0 EXTRACCION DE LOS ANTIGENOS DE SUPERFICIE DE MEMBRANA DE Bartonella bacilliformis El precipitado obtenido en el paso anterior se trasvasó a un matraz estéril de 150 mL y se le. RA DO. agregó 50 mL de una mezcla de 40 mL de solución de ácido tricloroacético al 5%. Se sometió a agitación magnética durante 72 horas, después se centrifugó a 5000 rpm durante. 15 minutos. .Con jeringa descartable de 20 mL se extrajo el sobrenadante y se trasvasó a una bolsa de diálisis; se cerró herméticamente la bolsa y se llevó a un matraz de 500 mL que contenía 300 mL de. SG. buffer fosfato a pH 7.3 y se agitó magnéticamente. Cada 24 horas se eliminó el buffer fosfato. Este procedimiento se realizó hasta las 72 horas. El dializado fue trasvasado a viales estériles de. PO. boca ancha con tapa de gasa estéril y se llevó a incubación a 37°C hasta la eliminación total del. DE. líquido.. L. 3.1 PURIFICACIÓN DEL EXTRACTO OBTENIDO. IT A. Se agregó a los viales que contenían los extractos 5 mL de acetona; se agitó durante 20 minutos; se trasvasó a tubos de centrífuga y se centrifugó a 3000 rpm durante 15. G. minutos. Con pipetas Pasteur se extrajo la mayor cantidad de acetona. Después se incubó. TE CA. DI. a 37°C hasta completar la evaporación de la acetona.. 4.0 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS DE CORDON UMBILICAL. O. 4.1 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS PROBLEMAS Y TESTIGO:. BL I. De cada una de las muestras A, B, C, D se cortó un segmento pequeño de cordón umbilical y se trasvasó a un tubo homogeinizador , luego el homogeinizado se trasvasó. BI. a un tubo de Eppendorf , se le añadió 0.5 mL de colagenasa y 2 mL de Waymouth con gentamicina y V gotas de extracto de membrana de Bartonella bacilliformis , no se añadió extracto de membrana a las muestras testigo y se incubó a 37°C durante 72 horas .. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 4.2 PREPARACIÓN DE LÁMINAS:. Se retiran las muestras de la incubadora y el contenido se centrifugó a 3000 rpm por 15 minutos , luego se extrajo el sobrenadante con jeringa de tuberculina y se guardó en. RA DO. tubos estériles a -40°C para identificar interleukina -2 y con el precipitado se preparó un frotis dos por cada muestra.. SG. 4.3 TINCIÓN DE LOS FROTIS:. Cada frotis se cubrió con colorante Wright (colorante madre) se le dejó 2 minutos para. PO. la fijación, después se agregó agua destilada a toda la extensión del frotis y se dejó por 5. 4.4 LAVADO DE LA LÁMINA (FROTIS). DE. minutos.. IT A. L. Con un chorro de agua de caño se hizo el lavado y se dejó secar por una hora. G. 4.5 LECTURA MICROSCÓPICA DE LOS PREPARADOS:. DI. Se hizo a 100 x (inmersión), siguiendo la técnica de Almena, se contaron las células en100 campos microscópicos .. TE CA. Similar procedimiento se hizo con los preparados de las muestras testigos.. O. 4.6 IDENTIFICACIÓN DE INTERLEUKINA -2 EN LOS SOBRENADANTES DE LA INDUCCIÓN:. BL I. Se ha demostrado que en la inmunidad adquirida praticipan células presentadoras de Antígenos (CPA) o macrófagos, células de memoria CD4-Th-1. , células CD4, células. BI. dendríticas y antígenos específicos. In vitro no se registra la necesidad de células presentadoras de antígenos pero los Linfocitos CD4 liberan IL-2, para demostrar éste hecho se identificó IL-2 en sobrenadante del cultivo celular, mediante espectrofotometría. UV a 582 nm de longitud de onda.. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESULTADOS La figura 1 representa la identificación de interleukina 2 (IL-2) en los sobrenadantes de la inducción. La curva signada con el número 1 corresponde al patrón positivo (IL-2 sigma). Las curvas numeradas con 2,3,4 presentan un pico similar al que se puede observar en el patrón a. RA DO. 582 nm de longitud de onda , la curva 5 presenta un registro no coincidente con el patrón, que necesariamente no corresponde a la IL-2, éste registro se observó en todas las lecturas del grupo. Figura1.. RESULTADOS. DE. LA. LECTURA. CUALITATIVA. ESPECTROFOTOMÉTRICA. DE. BI. BL I. O. TE CA. DI. G. IT A. L. DE. PO. INTERLEUKINA-2. SG. testigo.. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) PO. SG. RA DO. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2 RESULTADOS DEL PROCESO DE TRANSFORMACION DE CELULAS MADRES. MESENQUIMALES. DE. Figura :. DE CORDON UMBILICAL EN LINFOCITOS CD 4 +POR EFECTO DE LOS. BL I. O. TE CA. DI. G. IT A. L. EXTRACTOS DE MEMBRANA DE Bartonella bacilliformis EN MUESTRA Nro 2 (GRUPO A). Figura :. 3 RESULTADOS DEL PROCESO DE TRANSFORMACION DE CELULAS MADRES. BI. MESENQUIMALES. DE CORDON UMBILICAL EN LINFOCITOS CD 4 +POR EFECTO DE LOS. EXTRACTOS DE MEMBRANA DE Bartonella bacilliformis EN MUESTRA Nro 4. (GRUPO A). 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) MESENQUIMALES. DE TRANSFORMACION. DE CELULAS MADRES. DE. FIGURA 4. RESULTADOS DEL PROCESO. PO. SG. RA DO. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DE CORDON UMBILICAL EN LINFOCITOS CD 4 +POR EFECTO DE LOS. BI. BL I. O. TE CA. DI. G. IT A. L. EXTRACTOS DE MEMBRANA DE Bartonella bacilliformis EN MUESTRA Nro 6 (GRUPO B). FIGURA. 5.. RESULTADOS DEL PROCESO. MESENQUIMALES. DE TRANSFORMACION. DE CELULAS MADRES. DE CORDON UMBILICAL EN LINFOCITOS CD 4 +POR EFECTO DE LOS. EXTRACTOS DE MEMBRANA DE Bartonella bacilliformis EN MUESTRA Nro 8 (GRUPO B) 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) RESULTADOS DEL PROCESO. MESENQUIMALES. DE TRANSFORMACION. L. 6.. DE CELULAS MADRES. DE CORDON UMBILICAL EN LINFOCITOS CD 4 +POR EFECTO DE LOS. IT A. FIGURA. DE. PO. SG. RA DO. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. BI. BL I. O. TE CA. DI. G. EXTRACTOS DE MEMBRANA DE Bartonella bacilliformis EN MUESTRA Nro 15 (GRUPO C). FIGURA. 7.. RESULTADOS. DE LA NO TRANSFORMACION. DE CELULAS MADRES. MESENQUIMALES DE CORDON UMBILICAL EN MUESTRA Nro 5 (GRUPO TESTIGO). 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DISCUSION Los resultados obtenidos en el presente trabajo “ Efecto in vitro de los extractos de membrana de Bartonella bacilliformis sobre células de cordón umbilical” se presentan en las figuras 2,3,4,5. RA DO. y 6 corresponden a células linfocitarias CD4+, resultado obtenido como consecuencia de los extractos de membrana de Bartonella bacilliformis sobre células mesenquimales de tejidos de cordón umbilical , éstas células mesenquimales aunque tienen el mismo origen embrionario que. SG. las células mesenquimales de la médula ósea , dan lugar también a células epidérmicas y epiteliales , las células madres son suceptibles al estímulo que genera el receptor VCAM I, ICAMI. PO. , ejemplo Selectina al unirse al receptor NF-KB de las células madres 4 .. Los resultados mostrados en la figura Nro 7 del grupo testigo, son negativos. Es necesario indicar que en estudios de investigación sobre aislamiento y cultivo de células de cordón umbilical. (CMMCU) , han llegado a identificar y caracterizar. DE. mesenquimales. moléculas de adhesión como los VCAM , ICAM , marcadores específicos y de matriz celular. L. (CD109, CD50 ,CD58 etc), factores de crecimientos (citoquinas y sus respectivos receptores ) e. IT A. integrinas . 3. Mediante estrategias de diferenciación in vitro, se ha observado que la CMMCU diferenciados en. G. osteoblastos, adipocitos etc pueden cambiar sus fenotipos hacia otros linajes mesenquimales. DI. (linfocitos, monocitos) en respuesta a estímulos específicos extracelulares en el medio de cultivo.. TE CA. Investigaciones realizadas por Korbling y Estrov 2003, Ogawa et al 2002; Tsai et al 2002 y Heike y Nakata 2004 demostraron la capacidad de células madres adultas de la médula ósea de producir células con propiedades muy similares a hepatocitos, neuronas y cardiomiocitos así cómo progenitores mieloides (eritrocitos y leucocitos) y linfoides (linfocitos B y T) cuándo se. O. transfieren a microambientes diferentes al original. , motivo por el cuál propusieron cuatro. BL I. modelos que explican los posibles mecanismos ; el primero corresponde al conocido convencionalmente sobre diferenciación celular en el que una célula progenitora restringida. BI. hacia un solo linaje da origen a células de su misma estirpe ; el segundo se refiere a la capacidad de tienen las células madres adultas de diferenciarse en progenitores más activos en el ciclo celular que pueden dar a su vez a células de linajes celulares diferentes (progenitor mieloide y progenitor linfoide); el tercero conocido como trans-diferenciación , que adquieren la capacidad de generar células de muy diversos linajes y el último modelo se refiere a la capacidad de las. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. células maduras de de-diferenciarse y re-diferenciarse a células del mismo tejido que le dio origen o un tejido diferente15 . El modelo encontrado a nuestra investigación es semejante al modelo dos. De acuerdo a investigaciones recientes mostraron los antígenos de los extractos de membrana. RA DO. de Bartonella bacilliformis inducen receptores denominados VCAM_I (vascular cell adhesión molecule), éste es un receptor para monocitos y linfocitos. Se sabe que las células endoteliales no forman éste tipo de receptores,. pero en presencia de TNF la expresión de éstos se. incrementa. La citoquina TNF se libera como consecuencia de la lisis o lesiones endoteliales y. SG. actividad tóxica de llipopolisacáridos sobre los macrófagos. La inducción del receptor ICAMI (intercellular adhesion molecule), es generalmente inducida en las células endoteliales y sirve de. PO. receptor para los leucocitos. La expresión de ésta molécula se incrementa con la presencia de interleukina I (IL-1) que es liberada por células endoteliales. La citoquina TNF alfa, induce otro (endotelial leukocite adhesión molecule), denominada. DE. receptor que se denomina ELAM I. también Selectina . Este receptor es el encargado de la adhesión de PMN neutrófilos en 4,11,12. .. L. endotelios de capilares. IT A. Después sigue el proceso de diferenciación celular y los linfocitos juveniles se convierten en linfocitos denominados CD4 + que se activan y se transforman en linfoblastos o células activadas. G. En éste estado , éstos blastos sintetizan gamma interferón (Gamma-IF) que actúa sobre. DI. receptores de células presentadoras de antígenos (CPA) macrófagos . Así mismo, inducen receptores para que el interferón gamma pueda disponer la apoptosis de las células infectadas.. TE CA. Los linfocitos CD4+ visualizados en las figuras 2,3,4 y 5 su presencia fue corroborada por la secreción de IL-2 y que en la figura 1 contiene las curvas de identificación de IL-2 y registradas con los números 2,3,4 que corresponden a las muestras problemas y la numerada con 5. O. corresponde al testigo. Las primeras presentan un pico de 582 nm de longitud de onda del. BL I. espectrofotómetro UV, con similares características de la curva 1 (patrón sigma), mientras que la curva 5 presenta una curva invertida a los 582 nm lo que significa que y no corresponde a la. BI. presencia de IL-2. 5,8 Es necesario indicar que una de las rutas de transducción de señales más importantes en las respuestas inmunes innata y adquirida es la mediada por la activación del factor nuclear kB (NFkB). La actividad de NF-kB da como resultado la transcripción de genes que codifican citocinas, factores de crecimiento, proteínas de fase aguda, inmuno-receptores, otros factores de transcripción, moléculas de adhesión celular, proteínas virales y reguladores de la apoptosis. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. La primera ruta que activa A NF-kB, por medio del complejo IKK, está localizada exclusivamente en los linfocitos. Se involucra al receptor de células T (TCR), a la proteína cinasa C (PKC) y a (MAGUK) y a la proteína Bcl-10 asociada a la mucosa del tejido linfoide -1 (MALT-1) Las células madre son células con una característica peculiar, pueden dividirse tras ser. RA DO. estimuladas y producir dos tipos de células hijas: una nueva célula madre y otra célula con la capacidad de continuar la vía de diferenciación para la que está programada5,15 .. Las células del estroma umbilical, también llamadas células madre mesenquimales, son un tipo de células madre que se encuentran en el tejido que rodea a los vasos sanguíneos del cordón. SG. umbilical, y que se conoce como la gelatina de Wharton. Estas células están embebidas en una matriz de colágeno procedente del mesodermo extraembrionario que se forma durante la. PO. segunda semana del desarrollo del embrión. Aunque se encuentran también en otros lugares del organismo, el tejido del cordón umbilical es una de las fuentes más ricas del mismo. Se trata de. DE. unas células multipotentes, adultas e inmaduras, con morfología de miofibroblastos y la plasticidad suficiente para derivar hacia diversos linajes celulares, originando huesos, cartílagos,. L. grasa, tejidos conectivos, esqueléticos y músculo cardiaco, entre otros (medicina regenerativa).. IT A. Las células del cordón umbilical presentan marcadores de células madre embrionarias y mesenquimales, poseen una gran capacidad de proliferación, no son tumorigénicas y son bien. G. toleradas por el sistema inmune del receptor en transplantes alogénicos.. DI. Las células madre mesenquimales fueron inicialmente descritas en los años 60 en experimentos con animales. Pero hasta los 80 no se confirmó su presencia en humanos. Estas células se pueden. TE CA. encontrar en la médula ósea (entre 1 y 4 células por cada 100.000 células nucleadas), y también en el tejido del cordón umbilical .Las células madre mesenquimales presentan una gran capacidad de diferenciación, que unida a sus características peculiares de inmunomodulación, ha. O. hecho que numerosos grupos de investigación se hayan fijado en este tipo de células como base. BL I. para diversas terapias celulares, existiendo en la actualidad multitud de ensayos clínicos donde se utilizan este tipo células, obtenidas de la médula ósea o de tejidos grasos y cultivadas en vivo,. BI. para utilizarlas en aplicaciones terapéuticas muy diversas. Comparado con los otros sitios de donde pueden extraerse las células madre mesenquimales, el tejido del cordón umbilical se caracteriza por lo siguiente: Tiene mayor número de células madre mesenquimales. Su recolección no es un proceso invasivo, por lo que no supone ningún riesgo para el individuo. Se pueden expandir y cultivar fácilmente en el laboratorio3,8,10,15,16 . 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) RA DO. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Los extractos. de Bartonella. bacilliformis. SG. CONCLUSION. inducen la transformación de las células. BI. BL I. O. TE CA. DI. G. IT A. L. DE. PO. mesenquimales de cordón umbilical en linfocitos CD4 +.. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RECOMENDACIÓN En la últimas décadas las CMMCU han sido objeto de estudios biológicos por la plasticidad demostrada IN VITRO, la de lograr diferenciarse en múltiples tejidos celulares y sus funciones las convierten en candidatas para brindar soluciones clínicas. RA DO. inmunoreguladoras que importantes.. Con base en la diferenciación que poseen la CMMCU in vitro , muchos experimentos han sido llevados a cabo con animales en los cuáles éstas células son capaces de reparar o regenerar. SG. tejidos deteriorados o mutados , huesos, cartílagos , tejidos hepáticos etc también son capaces de interferir con el crecimiento celular en neoplasias y modular reacciones inmunes en. PO. colagenopatías y esclerosis múltiple.. BI. BL I. O. TE CA. DI. G. IT A. L. DE. Con los resultados obtenidos nuestras perspectivas de investigación están ampliadas............... 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. Takano Morón J. Enfermedad de Carrión (Bartonella humana). Univ. Nac DAC 1985 1: 85-105 2.Concepción Castells M. Biología celular y molecular del mastocito. Alergol Inmunol Clínica (revista en Internet) 1997 (Acceso 15 de Enero 2014). RA DO. 3.Alp Can Deniz Balci .Aislamiento ,cultivo y caracterización de estroma de cordón umbilical humano derivado de células madre mesenquimales. Mesenchymal stem cells assayd and aplications 3° ed. Pearson educación de México 2010. p. 60-68. bacterias patógenas. Reb (México) 24 (1) 12-20 ,2005. SG. 4.Oviedo Boyso J,Ochoa Zarzosa. Interferencia molecular en la ruta de transducción de NF-kB por. 5.Margni Ricardo A. Participación de factores de transcripción en la regulación de la. PO. diferenciación linfocitaria . (Revista en Internet) Disponible en:. www.medicinabuenos aires .com/revistas/vol59-99n5 1 491-495 pdf. DE. 6.Ortega Perez I y Redondo JM. La familia de factores de transcripción NFAT con dianas de inmunosupresión. Nefrología (revista en internet) 2000. Vol XX (2) 25-30 Disponible en:. L. www.revistanefrologia.com /mostrarfile.asp/ID-924. IT A. 7.Rolain Jean .Marc, Maurin max y Raoult Didier : bactericidal effect of antibiotics on Bartonella and Brucella spp: Clinical implication. Journal of antimicrobial Chemoterapy (revista en Internet). G. 2000: 46(5) 811-814. DI. Jac.oxfordjournals.org/cgi/content/abstract/46/5/811 8.WeissI. Deborah y Brown Melissa. Regulation of IL4 production inmast cells: a paradigm for cell-. TE CA. type-specific gen expression. Immunologic al reviews (Stanford USA) February 2001: 35-47 9.Seubert Anja . Schulein ralf, dehio christoph. Bacterial persistence within erythrocytes: a unique pathogenic strategy of bartonella spp. International Journal of medical Microbilogy. February. O. 2002 : 291(6/7) 555-560:. BL I. http://www.urbanfischer.de/juornals/ijmn 10.Anderson GE, Volkhard AJ kemf : Host cell modulation by human , animal and plant. BI. pathogens. International journal medical Microbiology April 2004.293(7/8) 463-470 http://www.urbanfischer.de/juornals/ijmn 11.Dehio Christop. Molecular and cellular basis of bartonella pathogenesis. Annual Review of Microbiology: 2004. 58 365-90 arjournals.anualreviews.org.doi/pdf10.1146/annurev.micro.58.030603.123700. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

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