Efecto de tres concentraciones de extracto hidroalcohólico de citrus limon sobre el ciclo celular en meristemos radiculares de allium cepa

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(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M. UN IC. AC IÓ. CIENCIAS BIOLÓGICAS. N. ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE. IN FO. EFECTO DE TRES CONCENTRACIONES DE EXTRACTO. DE. HIDROALCOHÓLICO DE Citrus limon SOBRE EL CICLO. SI ST. EM. AS. CELULAR EN MERISTEMOS RADICULARES DE Allium cepa.. TESIS DE BIÓLOGO. DI. RE. CC. IO. N. DE. PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL. AUTOR: Br. ARELY ESTELA OTINIANO MATOS ASESOR: Dr. JUAN CÉSAR MURO MOREY TRUJILLO – PERU. 2014 i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. AC IÓ. N. QUE OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. RECTOR. CO. VIRRECTOR ACADÉMICO. M. UN IC. Dr. Orlando Velásquez Benites. IC. A. Y. Dra. Vilma Julia Méndez Gil. ÁT. VICERRECTOR ADMINISTRATIVO. IN FO. RM. Dr. Flor Marlene Luna Victoria Mori. DE. JEFE DE LA OFICINA DE REGISTRO ACADÉMICO. EM. AS. Dr. Julio Castañeda Carranza. Dr. José Mostacero León. N. DE. SI ST. DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. Dr. William Zelada Estraver. DI. RE. CC. IO. SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. DIRECTOR DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Dr. Freddy Pelaez Pelaez. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Y. CO. M. UN IC. AC IÓ. N. JURADO DICTAMINADOR. A. Dr. Raúl Beltrán Orbegoso. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. PRESIDENTE. SECRETARIO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. MsC. Juan Carlos Rodríguez Soto. Dr. Juan César Muro Morey VOCAL. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. N. VºBº DEL ASESOR. AC IÓ. El que suscribe, profesor asesor de la presente tesis para optar por el Título. UN IC. Profesional de Biólogo, certifica que ha sido desarrollada de conformidad con los objetivos propuestos y que el informe ha sido revisado y acoge las observaciones. CO. M. y sugerencias alcanzadas.. Y. Por lo tanto autorizo a la Br. Arely Estela Otiniano Matos a continuar con los. Dr. Juan César Muro Morey ASESOR. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. trámites correspondientes.. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. N. APROBACIÓN DE TESIS. AC IÓ. Los profesores que suscriben, miembros del jurado dictaminador, declaran que. UN IC. ésta reúne todos los requisitos exigidos, por lo que fue aprobada por. ÁT. IC. A. Y. CO. M. UNANIMIDAD, el 19 de Mayo del año 2014.. RM. Dr. Raúl Beltrán Orbegoso. MsC. Juan Carlos Rodríguez Soto SECRETARIO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. PRESIDENTE. Dr. Juan César Muro Morey VOCAL. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AC IÓ. N. DEDICATORIA. A mis padres DEMETRIO y MELECIA, por su entrega, humildad, infinito amor, paciencia, comprensión y apoyo incondicional, que me motivan a seguir luchando para lograr cada una de mis metas. Les estaré . eternamente agradecida, siempre les amaré.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M. UN IC. A DIOS por darme la vida, salud y fuerzas para seguir adelante con cada una de mis metas, ya que sin su ayuda no lo habría logrado.. A mis hermanos NANCY, LUZ, MOISÉS y ELIAS, por estar siempre a mi lado con su inmenso cariño, apoyando y escuchándome en todo momento.. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CO. M. UN IC. AC IÓ. N. A TODA MI FAMILIA que siempre me ha apoyado y ha seguido día a día mi carrera.. EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. A ERNESTO, por todo su amor que me brinda día a día, por su paciencia, cariño y mucha comprensión. Por todos los momentos compartidos.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. A todos mis AMIGOS, por estar conmigo siempre haciendo que vuelva a sonreír y no me dé por vencida… Los quiero mucho.. A mis pequeños SHADOW, GUIGUI, ROCCO, ADHARA y JASKY, por llenar cada uno de mis días de mucha alegría y amor. Los quiero mucho.. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AC IÓ. N. AGRADECIMIENTO. UN IC. Mi más sincero y profundo agradecimiento a mi asesor de tesis, el. M. profesor Dr. Juan César Muro Morey, porque siempre estuvo. Y. CO. presente para brindarme su apoyo incondicional, tanto en el. IC. A. desarrollo de esta tesis como a lo largo de mi vida universitaria; a la. RM. ÁT. vez agradecerle, por sus sabios consejos, su paciencia, tolerancia y. IN FO. críticas constructivas para lograr ser una mejor profesional. A la vez, aprovecho esta oportunidad para expresarle mi admiración, cariño,. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. respeto y gratitud.. Arely Estela Otiniano Matos. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AC IÓ. N. PRESENTACIÓN. M. UN IC. Señores miembros del Jurado Dictaminador:. CO. Dando cumplimiento a lo dispuesto en el reglamento de Grados y Títulos de la. Y. Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, me es. IC. A. honroso presentar y someter a vuestra consideración y elevado criterio el presente. IN FO. RM. ÁT. informe de tesis titulado:. “Efecto de tres concentraciones de extracto hidroalcohólico de Citrus limon. AS. DE. sobre el ciclo celular en meristemos radiculares de Allium cepa.”. Trujillo, 19 de Mayo del año 2014.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. Con el cual pretendo obtener el Título Profesional de Biólogo.. Br. Arely Estela Otiniano Matos. ix Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AC IÓ. N. INDICE. UN IC. AUTORIDADES UNIVERSITARIAS…………………………………………...ii JURADO DICTAMINADOR…………………………………………………....iii. CO. M. VºBº DEL ASESOR………………………………………………………………iv. Y. APROBACIÓN DE TESIS………………………………………………………..v. IC. A. DEDICATORIA………………………………………………………………….vi. ÁT. AGRADECIMIENTO…………………………………………………………..viii. RM. PRESENTACIÓN…...……………………………………………………………ix. IN FO. INDICE…………………………………………………………………………....x. DE. RESUMEN………………………………………………………………………..xi. SI ST. EM. AS. ABSTRACT……………………………………………………………………...xii. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………...1. N. DE. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………7. IO. RESULTADOS…………………………………………………………………..12. RE. CC. DISCUSIÓN……………………………………………………………………..25. DI. CONCLUSIONES……………………………………………………………….29 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS…………………………………………...30 ANEXOS…………………………………………………………………………37. x Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AC IÓ. N. RESUMEN. UN IC. En el presente trabajo se determinó el efecto de extracto hidroalcohólico (50ºGL). M. al 20% de cáscaras de Citrus limon a concentraciones de 0,25%, 0,50% y 0,75%. CO. sobre el ciclo celular en meristemos radiculares de Allium cepa. Para lo cual, se. A. Y. indujo el crecimiento de raicillas de 2 a 3 cm de longitud, después de la. ÁT. IC. emergencia y exposición de las raicillas a los tratamientos de acuerdo al diseño de. RM. investigación establecido se realizó el montaje y posterior lectura microscópica.. IN FO. Los resultados obtenidos evidenciaron una disminución significativa del índice mitótico (6.52%) a concentración 0,75% (T4) pero a la vez un incremento. DE. significativo del índice anafásico (18.94%) en el mismo tratamiento. Según el. de. media. estableció. la. conformación. de. cuatro. grupos. SI ST. comparación. EM. AS. análisis de varianza evidencio diferencias significativas y la prueba de. estadísticamente homogéneos en función a su efecto. El extracto hidroalcohólico. DE. de cáscaras de C. limon, tiene efecto citotóxico sobre el ciclo celular en. DI. RE. CC. IO. N. meristemos radiculares de A. cepa.. PALABRAS CLAVES: Citrus limon, limón, extracto hidroalcohólico, citotoxicidad, Allium cepa.. xi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. M. UN IC. AC IÓ. N. ABSTRACT. CO. In this study, was determined the effect of hydroalcoholic extract (50°GL) to 20%. Y. of shells of Citrus limon " lemon " at concentrations of 0.25%, 0.50% and 0.75 %. IC. A. on the cell cycle in root meristems of Allium cepa. For that which, the rootlets. RM. ÁT. growth was induced of 2 to 3 cm length, after emergence and exposure of rootlets. IN FO. to treatments according to established research design and subsequent mounting microscopic reading was performed. The results showed a significant decrease in. DE. mitotic index (6.52%) to 0.75% concentration (T4) but also a significant increase. AS. in anaphase rate (18.94%) in the same treatment. Analysis of variance evidenced. EM. significant differences and mean comparison test established forming four. SI ST. statistically homogeneous groups according to their effect. The hydroalcoholic. DE. extract of C. limon peel has cytotoxic effect on the cell cycle of A. cepa root. DI. RE. CC. IO. N. meristems.. KEYWORDS: Citrus limon, lemon, hydroalcoholic extract, cytotoxicity, Allium cepa.. xii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INTRODUCCIÓN. N. El género Citrus, pertenece a la familia Rutaceae, se considera un género. AC IÓ. cosmopolita, con abundante representación en la región tropical. Las plantas. UN IC. pertenecientes a este género son conocidas por el hombre, no solo por el consumo de sus frutos, con alta demanda a nivel mundial, sino también por sus propiedades. CO. M. curativas. Los cítricos deben su actividad biológica, en gran medida, a la presencia. Y. de metabolitos secundarios como los flavonoides, los cuales poseen actividad. IC. A. antioxidante. La mayoría de los trabajos publicados sobre las propiedades. ÁT. antioxidantes de los cítricos se centran en extractos obtenidos a partir de los. IN FO. RM. frutos.1,2. DE. El reconocimiento de los componentes fisiológicamente activos en los. AS. cítricos como la naranja, mandarina, limón y toronja; y su contribución a la salud. EM. humana, se ha convertido en un área de investigación en crecimiento. El género. SI ST. Citrus se caracteriza por una acumulación sustancial de glicósidos de flavona, los. DE. cuales no se encuentran en otras frutas. La vitamina C y los carotenoides, juegan. N. un papel importante en la prevención o retardo de las principales enfermedades. IO. degenerativas como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares y cataratas. DI. RE. CC. mediante la neutralización de procesos oxidativos.3. En la actualidad se ha encontrado que las cáscaras de los cítricos son principales fuentes de antioxidantes naturales, por lo que se ha propuesto utilizar estos subproductos de la industria como antioxidantes naturales.4,5 Citrus limon L.. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Var. Limón sutil “limón”, contiene 5% de ácido cítrico, glicósidos de flavonas, aceites esenciales: citral, linalol; peptina, ácido málico, candineno, felandreno, dlimoneno, citronelal, narcotina, quinolina, estaquidrina, carbohidratos, proteínas,. AC IÓ. N. sales de potasio, calcio, fósforo, sodio, hierro, magnesio, manganeso, vitaminas A,. UN IC. B1, B2, C y hesperidina.6,7,8. M. Los flavonoides como hesperidina y diosmina son abundantes en cáscaras. CO. de limón y mandarina.9 Otros metabolitos importantes en los cítricos son las. IC. A. Y. cumarinas y el ácido ascórbico.10 En general, los flavonoides pertenecen al grupo. antioxidante,. antimicrobiana,. RM. biológicas:. ÁT. de los compuestos fenólicos, tienen una amplia variedad de actividades antiinflamatoria,. antiviral,. IN FO. antiproliferativa, antimutagénica, anticarcinogénica, acciones vasodilatadoras, y. AS. DE. prevención de enfermedades coronarias y desordenes neurodegenerativos.11,12. EM. El D-limoneno se encuentra ampliamente en los cítricos, tiene propiedades. SI ST. anticancerígenas, la exposición a D-limoneno es citotóxico en células V79 de Cricetulus griseus “hámster chino” dependiente de la dosis. Demostrándose que. DE. tiene efecto directo sobre las células en división que impide el ensamblaje de. IO. N. microtúbulos del huso mitótico. Esto afecta tanto a la anafase y telofase, lo que. CC. resulta en la aneuploidía que a su vez puede conducir a la muerte celular o la. DI. RE. inestabilidad genómica.13 Estudios realizados empleando dicromato de potasio, jugo de Morinda citrifolia y extracto de Annona muricata evidenciaron también. efectos citotóxicos en células meristemáticas de Allium cepa.14,15,16. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Estudios realizados en una línea celular de cáncer colorrectal (LIM1863) para evaluar el efecto citotóxico del aceite esencial de cáscaras de Citrus limon L. reveló que tiene efecto citotóxico en la línea celular humana colorrectal carcinoma. AC IÓ. N. LIM1863 estudiado in vitro.17 Similares resultados se obtuvieron al evaluar el. efecto del jugo de Brassica oleracea “brócoli” sobre la citotoxicidad del sorbato. UN IC. de potasio,18 efecto protector del extracto etanólico de Annona muricata y Glycine. CO. IC. A. Y. potasio en células meristemáticas de Allium cepa.19,20. M. max sobre la citotoxicidad y genotoxicidad del sorbato de potasio y dicromato de. ÁT. Los compuestos polifenólicos más abundantes en los cítricos son los. RM. flavonoides y terpenos estos podrían ser considerados agentes quimiopreventivos. IN FO. o terapéuticos del cáncer debido a sus propiedades antialérgicas, antiinflamatorias,. DE. antioxidantes, antimutagénicas, antineoplásicas y moduladoras de los procesos. AS. enzimáticos.21 Inactivan especies reactivas de oxígeno evitando así la oxidación de. EM. las proteínas, los ácidos grasos poliinsaturados y el daño al ADN, promueven la. SI ST. detoxificación y eliminación sustancias promotoras del cáncer, inhibición de la proliferación celular pudiendo actuar con un mecanismo subyacente que podría. DE. evitar los procesos oxidantes de la xantina oxidasa, la ciclooxigenasa evitando así. IO. N. la promoción tumoral, interrupción del ciclo celular mediante la inhibición de las. DI. RE. CC. quinasas dependientes de ciclinas.22,23. El mayor consumo de cítricos se asocia significativamente con menores concentraciones de IL-18 (Interleucina-18) y TNF-R2 (Factor de Necrosis Tumoral R2); promueven una fermentación sana en el colon produciéndose. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. metabolitos de los flavonoides que son asimilados al mismo tiempo que decrece el pH evitando proliferación bacteriana negativa y favorece la excreción de. AC IÓ. N. sustancias tóxicas por vía fecal y de orina.24,25,26. UN IC. Para que exista crecimiento en cualquier tipo de tejido es necesario que las células atraviesen por una serie de eventos moleculares englobados en el ciclo. CO. M. celular.27,28 En este, intervienen una serie de genes que regulan positivamente el. Y. ciclo, como los que codifican a las proteínas del sistema de Ciclinas y Kinasas. IC. A. Dependientes de Ciclinas (CDK), las cuales hacen posible la formación de. ÁT. complejos moleculares como el denominado MPF (factor promotor de la fase M). RM. conformado por la Ciclina B - Cdk1, que a su vez permitirá el paso de las células. IN FO. desde la interfase hacía el período M, y el APC (complejo promotor de la anafase). DE. quien cumplirá un rol importante cuando las células pasen desde la metafase hacía. AS. la anafase, además de permitir que las células puedan salir de la mitosis e ingresar. SI ST. EM. a un nuevo ciclo celular.29,30. Se sabe que el ciclo celular no siempre termina en la división celular y que. DE. su regulación genética condiciona a cada una de las fases que lo conforman. Exige. IO. N. una transcripción y síntesis de proteínas específicas.31,32 Estas proteínas. CC. determinan el inicio del ciclo celular, la replicación, la finalización del período S,. DI. RE. el paso de G2 hacia la mitosis y el flujo de cada fase de esta última.33,34 De esta manera, este ciclo puede ser afectado por sustancias antimitóticas, citotóxicas y genotóxicas que alteren su normal desarrollo, induciendo la aparición de figuras mitóticas anormales e incluso produzcan daños a nivel cromosómico.35. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. El ciclo celular está regulado por una serie de moléculas, entre las cuales se encuentran las ciclinas y quinasas dependientes de las ciclinas entre otras, actúan fosforilando serinas y treoninas de proteínas diana para desencadenar. AC IÓ. N. procesos celulares. Estas vigilan cada uno de los pasos que realiza la célula para. UN IC. completar el ciclo, sino se cumplen las condiciones para pasar a la siguiente etapa, el ciclo se detiene. Existen cuatro transiciones principales: de G0 a G1 o iniciación. CO. M. de la proliferación; de G1 a S o iniciación de la replicación; de G2 a M o iniciación de la mitosis; y de la metafase a la anafase o iniciación de la segregación. ÁT. IC. A. Y. cromosómica.36. RM. En 1938 el uso de A. cepa se introdujo como un sistema de prueba. IN FO. biológico para evaluar los efectos citogenéticos de la colchicina; desde entonces,. DE. ha sido material de amplio estudio en pruebas de laboratorio, debido al rápido. AS. crecimiento de sus raíces y la respuesta de su genoma frente a la presencia de. EM. citotóxicos y genotóxicos potenciales en los líquidos ensayados.37,38 Sus. SI ST. meristemos son frecuentemente utilizados en estudios de dinámica celular, ya que constituyen un sistema in vitro ideal para estudiar los mecanismos regulatorios. DE. que puedan afectar el ciclo celular39,40; lo que nos hace pensar también que dichos. IO. N. agentes, tendrían el potencial de generar un efecto tóxico en los procesos de. CC. división celular de otro tipo de células eucariotas, debido a la universalidad del. DI. RE. código genético.41,42. Estudios indican que A. cepa es un biomonitor adecuado tanto para el análisis de citotoxicidad como de genotoxicidad, además presenta ventajas en. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. cuanto a costos, disponibilidad y sensibilidad. Cuando un bulbo de cebolla se rehidrata se produce una estimulación del crecimiento de los meristemos, lo cual permite la elongación de las raíces de la planta. Sin embargo, cuando la. AC IÓ. N. hidratación se lleva a cabo en presencia de sustancias tóxicas, la división celular. UN IC. de los meristemos radiculares puede inhibirse, ya sea retardando el proceso de mitosis o destruyendo las células. Este tipo de alteraciones generalmente impide el. IC. A. Y. CO. M. crecimiento normal de la raíz, y por tanto su elongación.43. ÁT. Por las consideraciones expuestas, en el presente trabajo, se determinó el. RM. efecto del extracto hidroalcohólico (50ºGL) de cáscaras de Citrus limon, a. IN FO. concentraciones de 0,25%, 0,50% y 0,75% sobre el ciclo celular en meristemos. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. radiculares de Allium cepa.. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MATERIALES Y MÉTODOS. Bulbos de Allium cepa L. Var. Roja Arequipeña, con un peso. AC IÓ. 1.1.. N. 1. MATERIAL BIOLÓGICO. UN IC. aproximado de 60-80 g cada uno, forma de perilla y condiciones fitosanitarias adecuadas (Anexo 1). Se adquirió 4 kg en el Mercado. A. Frutos de Citrus limon L. Var. Limón sutil, en condiciones. IC. 1.2.. Y. CO. M. “La Hermelinda” del distrito de Trujillo.. ÁT. fitosanitarias adecuadas, frutos de color verde y de tamaño uniforme. RM. (Anexo 2). Se adquirió 2 kg en el Mercado “La Hermelinda” del. DE. IN FO. distrito de Trujillo. Se excluyó los frutos de color amarillo.. EM. AS. 2. MÉTODOS Y TÉCNICAS. SI ST. 2.1. Obtención del extracto hidroalcohólico de Citrus limon. DE. Los frutos de C. limon se seleccionaron aproximadamente unos 8 a. DI. RE. CC. IO. N. 10, los cuales fueron bien lavados con agua potable, descascarados y las cáscaras obtenidas se cortaron en partes pequeñas. Se pesaron 20 gramos, y se colocaron en 100mL de alcohol 50º GL para su. maceración durante una semana, agitándose manualmente por un tiempo de 2 horas diarias. Después de este tiempo en maceración, se filtró la solución, para luego aforar el volumen a 100mL. con alcohol de 50º, con lo cual se inició la obtención del extracto hidroalcohólico. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. de cáscaras de C. limon al 20%. A partir de esta solución madre, se obtuvieron las concentraciones de 0,25%, 0,50% y 0,75%, tomando. AC IÓ. N. los mililitros respectivos para cada concentración (Anexo 3).. 2.2. Obtención de las raicillas de Allium cepa. UN IC. Se utilizaron 20 bulbos de A. cepa con un peso aproximado de 60 –. CO. M. 80 g cada uno; a cada bulbo, se le quitaron las catáfilas y raicillas. Y. secas. En la parte ecuatorial se introdujeron 3 mondadientes. IC. A. distribuidos equidistantemente para sostener el bulbo en la boca del. ÁT. vaso plástico de 100 mL, el cual previamente se llenó con 80 mL de. RM. agua. Esto hizo posible que el líquido se ponga en contacto con el. IN FO. disco germinativo. Para la aplicación de los tratamientos se. DE. seleccionaron 3 bulbos de cebolla (para cada tratamiento) teniendo. AS. en cuenta que tengan enraizamiento uniforme y un buen número de. SI ST. EM. raicillas (Anexo 4).. 2.3. Acondicionamiento del material biológico. DI. RE. CC. IO. N. DE. Las cebollas se mantuvieron a una temperatura ambiente en un sistema de soporte diseñado especialmente hecho de triplay; se utilizó un aireador SOBO de pecera, para proporcionar aireación constante a razón de 10 – 20 mL/min, la renovación del agua contenida en los vasos fue diaria; 72 horas después se seleccionaron aquellos bulbos con más de 10 raicillas cuya longitud promedio fue de 2 a 3 cm, a fin de asegurar la presencia de muestras con cinética. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. en la mitosis. El sistema fue colocado en ambiente oscuro. (Anexo 5).. AC IÓ. N. 2.4. Diseño experimental. UN IC. Se realizó un diseño completamente al azar con tres repeticiones para cada uno de los cuatro tratamientos. De acuerdo al siguiente. A. Y. CO. M. esquema.. T3. T4. 3 bulbos de Allium cepa. DE. de. 3 bulbos de Allium cepa. 3 bulbos de Allium cepa. Extracto hidroalcohólico de Citrus limon (0,50%) durante 14 horas.. Extracto hidroalcohólico de Citrus limon (0,75%) durante 14 horas.. SI ST. EM. AS. 3 bulbos Allium cepa. IN FO. RM. ÁT. IC. T2. T1. DI. RE. CC. IO. N. DE. Agua potable durante 14 horas.. Extracto hidroalcohólico de Citrus limon (0,25%) durante 14 horas.. Luego de aplicar el extracto hidroalcohólico de Citrus limon a diferentes concentraciones (durante 14 horas) se evaluó el índice mitótico y de fases. Finalmente se realizó las comparaciones estadísticas entre los diferentes tratamientos.. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.5. Obtención de preparados citológicos Finalizado los tratamientos, las raicillas fueron disectadas y colocadas en la solución fijadora de Carnoy`s. Luego se lavó tres. AC IÓ. N. veces en agua potable para retirar de esta manera los restos del. UN IC. fijador. Posteriormente se secaron con papel toalla para eliminar los restos de agua en la superficie. Por último, éstas fueron depositadas. CO. M. sobre una luna de reloj para su respectiva coloración de acuerdo a la. Y. técnica rápida de Tjio y Levan utilizadas por Andrioli, Wulff, y. A. Mudry al evaluar la toxicidad y genotoxicidad de metronidazol en. citológico. para. IN FO. 2.6. Análisis. RM. ÁT. IC. Allium cepa.41 (Anexo 6).. determinación. de. la. DE. citotoxicidad. la. AS. Los ápices coloreados fueron colocados entre una lámina porta y. EM. cubreobjetos para realizar el “squash” (aplastamiento). Los. SI ST. preparados citológicos se observaron con un microscopio compuesto con el objetivo de 40x. Posteriormente, se procedió a contar 2000. DI. RE. CC. IO. N. DE. células meristemáticas por cada uno de los diferentes tratamientos ensayados (Anexo 7)¸ lo cual se realizó por triplicado, utilizando la técnica de barrido. Para la evaluación de la citotoxicidad se estimaron los valores del índice mitótico y de fases. Los resultados obtenidos fueron expresados en porcentaje (Anexo 8).. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.7. Análisis estadístico Los datos obtenidos fueron organizados en tablas y figuras para realizar la comparación de los diferentes tratamientos ensayados. AC IÓ. N. mediante el análisis de varianza y la prueba de comparación de. media con una probabilidad de error de 0,05; utilizando el programa. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M. UN IC. Statgraphics Centurion versión 16.1.15 para Windows.44,45. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESULTADOS. N. En el presente trabajo, se evidenció que el extracto hidroalcohólico. AC IÓ. (50ºGL) de cascaras de Citrus limon, a concentraciones de 0,25%, 0,50% y 0,75%. UN IC. presenta efecto citotóxico sobre el ciclo celular en meristemos radiculares de. CO. M. Allium cepa “cebolla”.. Y. En la tabla 1, se observan los índices mitóticos y de fases en meristemos. IC. A. radiculares de Allium cepa. La tabla 2, muestra el análisis de varianza y prueba de. ÁT. comparación de media del índice mitótico. La figura 1, muestra el gráfico de. RM. barras del índice mitótico y comparación de media; en el cual se nota una. IN FO. disminución del mismo a la concentración de 0,75% de extracto hidroalcohólico. AS. DE. (50ºGL) de cáscaras de Citrus limon.. EM. En la tabla 3, muestra el análisis de varianza y prueba de comparación de. una. disminución. de. los. diferentes. tratamientos. de. extracto. DE. muestra. SI ST. media del índice prófasico. La figura 2, el gráfico de barras del índice profásico. N. hidroalcohólico (50ºGL) de cáscaras de Citrus limon con respecto a T1 (solamente. DI. RE. CC. IO. agua potable).. En la tabla 4, muestra el análisis de varianza y prueba de comparación de. media del índice metafásico. La figura 3, el gráfico de barras se observa que el índice metafásico muestra una disminución, en función a las concentraciones de extracto hidroalcochólico de cáscaras de Citrus limon.. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. En la tabla 5, muestra el análisis de varianza y prueba de comparación de media del índice anafásico. La figura 4, el gráfico de barras del índice anafásico. AC IÓ. N. muestra un incremento notorio, en función a las concentraciones de extracto. UN IC. hidroalcochólico de cáscaras de Citrus limon.. CO. M. En la tabla 6, muestra el análisis de varianza y prueba de comparación de. Y. media del índice telofásico. La figura 5, el gráfico de barras del índice telofásico. IC. A. se aprecia que no hay diferencias significativas en los diferentes tratamientos de. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. extracto hidroalcochólico de cáscaras de Citrus limon.. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) M UN IC AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla 1. Índices mitóticos y de fases de meristemos radiculares de Allium cepa Var. Roja Arequipeña expuestos a diferentes concentraciones de extracto hidroalcohólico (50ºGL) de cáscaras de Citrus limon (0,25%; 0,50%; 0,75%).*. CO. Parámetro Índice Profásico. Índice Metafásico. Índice Anafásico. Índice Telofásico. 12.95 ± 0.25. 46.16 ± 1.70666. 14.91 ± 1.8166. 11.00 ± 1.125. 27.93 ± 2.6411. 10.62 ± 0.202073. 45.08 ± 0.145717. 14.92 ± 0.522717. 12.86 ± 0.489524. 27.15 ± 0.205994. 8.68 ± 0.388373. 44.74 ± 0.276225. 13.43 ± 0.173205. 15.55 ± 0.482183. 26.28 ± 0.328075. 6.52 ± 0.32532. 43.19 ± 0.542248. 12.56 ± 0.158219. 18.96 ± 0.60918. 25.31 ± 0.277369. Y. Índice Mitótico. T4. IC. RM ÁT. IN FO. DE. T3. AS. T2. EM. T1. A. Tratamiento. ST. * Leyenda : Tratamientos:. SI. T1: Control, solamente agua potable 14 horas de exposición. DE. T2: 0,25% de extracto hidroalcohólico (50ºGL) al 20 % de cáscaras de Citrus limon 14 horas de exposición. O. N. T3: 0,50% de extracto hidroalcohólico (50ºGL) al 20 % de cáscaras de Citrus limon 14 horas de exposición. DI. RE. CC I. T4: 0,75% de extracto hidroalcohólico (50ºGL) al 20 % de cáscaras de Citrus limon 14 horas de exposición. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AC IÓ. N. Tabla 2. Análisis de Varianza y Prueba de Comparación de Medias del Índice Mitótico en meristemos radiculares de Allium cepa Var. Roja Arequipeña expuesta a los diferentes tratamientos de extracto hidroalcohólico (50°GL) de cáscaras de Citrus limon.. UN IC. ANOVA para INDICE MITOTICO según TRATAMIENTO. M. Analisis de Varianza. A. Y. CO. ----------------------------------------------------------------------------Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------Between groups 67.7092 3 22.5697 250.77 0.0000*. ÁT. IC. Within groups 0.72 8 0.09 ----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.) 68.4292 11. DE. IN FO. RM. *sifnificativo. EM. AS. Contraste Múltiple de Rango para INDICE MITOTICO según TRATAMIENTO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. -------------------------------------------------------------------------------Method: 95.0 percent Tukey HSD TRATAMIENTO Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------0.75 EHL LIMON 3 6.51667 a 0.5 EHL LIMON 3 8.68333 b 0.25 EHL LIMON 3 10.6167 c CONTROL 3 12.95 d --------------------------------------------------------------------------------. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AC IÓ. N. Tabla 3. Análisis de Varianza y Prueba de Comparación de Media del Índice Profásico en meristemos radiculares de Allium cepa Var. Roja Arequipeña expuesta a los diferentes tratamientos de extracto hidroalcohólico (50°GL) de cáscaras de Citrus limon.. UN IC. ANOVA para INDICE PROFASICO según TRATAMIENTO. M. Analisis de Varianza. Y. CO. ----------------------------------------------------------------------------Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------Between groups 12.8799 3 4.2933 5.20 0.0278*. ÁT. IC. A. Within groups 6.60853 8 0.826067 ----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.) 19.4884 11. DE. IN FO. RM. *significativo. AS. Contraste Múltiple de Rango para INDICE PROFASICO según TRATAMIENTO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. -------------------------------------------------------------------------------Method: 95.0 percent Tukey HSD TRATAMIENTO Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------0.75 EHL LIMON 3 43.1867 a 0.5 EHL LIMON 3 44.53 ab 0.25 EHL LIMON 3 45.0533 ab CONTROL 3 46.06 b --------------------------------------------------------------------------------. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AC IÓ. N. Tabla 4. Análisis de Varianza y Prueba de Comparación de Media del Índice Metafásico en meristemos radiculares de Allium cepa Var. Roja Arequipeña expuesta a los diferentes tratamientos de extracto hidroalcohólico (50°GL) de cáscaras de Citrus limon.. UN IC. ANOVA para INDICE METAFASICO según TRATAMIENTO. M. Analisis de Varianza. Y. CO. ----------------------------------------------------------------------------Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------Between groups 14.8757 3 4.95856 5.47 0.0244*. ÁT. IC. A. Within groups 7.2566 8 0.907075 ----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.) 22.1323 11. DE. IN FO. RM. *significativo. AS. Contraste Múltiple de Rango para INDICE METAFASICO según TRATAMIENTO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. -------------------------------------------------------------------------------Method: 95.0 percent Tukey HSD TRATAMIENTO Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------0.75 EHL LIMON 3 12.2633 a 0.5 EHL LIMON 3 13.43 ab CONTROL 3 14.9133 b 0.25 EHL LIMON 3 14.9167 b --------------------------------------------------------------------------------. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AC IÓ. N. Tabla 5. Análisis de Varianza y Prueba de Comparación de Media del Índice Anafásico en meristemos radiculares de Allium cepa Var. Roja Arequipeña expuesta a los diferentes tratamientos de extracto hidroalcohólico (50°GL) de cáscaras de Citrus limon.. UN IC. ANOVA para INDICE ANAFASICO según TRATAMIENTO Analisis de Varianza. CO. M. ----------------------------------------------------------------------------Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------Between groups 108.368 3 36.1227 68.52 0.0000*. IC. A. Y. Within groups 4.21773 8 0.527217 ----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.) 112.586 11. IN FO. RM. ÁT. *significativo. AS. DE. Contraste Múltiple de Rango para INDICE ANAFASICO según TRATAMIENTO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. -------------------------------------------------------------------------------Method: 95.0 percent Tukey HSD TRATAMIENTO Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------CONTROL 3 10.9433 a 0.25 EHL LIMON 3 12.8633 b 0.5 EHL LIMON 3 15.55 c 0.75 EHL LIMON 3 18.94 d --------------------------------------------------------------------------------. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AC IÓ. N. Tabla 6. Análisis de Varianza y Prueba de Comparación de Media del Índice Telofásico en meristemos radiculares de Allium cepa Var. Roja Arequipeña expuesta a los diferentes tratamientos de extracto hidroalcohólico (50°GL) de cáscaras de Citrus limon.. UN IC. ANOVA para INDICE TELOFASICO según TRATAMIENTO. M. Analisis de Varianza. Y. CO. ----------------------------------------------------------------------------Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------Between groups 11.5134 3 3.83781 2.13 0.1744*. ÁT. IC. A. Within groups 14.4049 8 1.80061 ----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.) 25.9183 11. IN FO. RM. *no significativo. AS. DE. Contraste Múltiple de Rango para INDICE TELOFASICO según TRATAMIENTO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. -------------------------------------------------------------------------------Method: 95.0 percent Tukey HSD TRATAMIENTO Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------0.75 EHL LIMON 3 25.3067 a 0.5 EHL LIMON 3 26.2833 a 0.25 EHL LIMON 3 27.1533 a CONTROL 3 27.9333 a --------------------------------------------------------------------------------. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) d. 14. c. 12. CO. b. 10. Y. a. IC. A. 8. RM ÁT. 6. 4. IN FO. % INDICE MITOTICO. M UN IC AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2. DE. 0. T2. T3. T4. AS. T1. ST. EM. TRATAMIENTOS. DE. SI. Las letras (a-d) representan los 4 grupos estadísticamente homogéneos según los test comparación múltiple de media. Los promedios relacionados con diferentes letras, presentan diferencias significativas entre ellos para un valor P<0.05. T1: Control, solamente agua potable 14 horas de exposición. O. N. T2: 0,25% de extracto hidroalcohólico (50ºGL) al 20 % de cáscaras de Citrus limon 14 horas de exposición. CC I. T3: 0,50% de extracto hidroalcohólico (50ºGL) al 20 % de cáscaras de Citrus limon 14 horas de exposición. RE. T4: 0,75% de extracto hidroalcohólico (50ºGL) al 20 % de cáscaras de Citrus limon 14 horas de exposición. DI. Figura 1. Índice Mitótico y comparación de media en meristemos radiculares de Allium cepa Var. Roja Arequipeña, expuestos a los diferentes tratamientos con extracto hidroalcohólico de cáscaras de Citrus limon. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) b. 50. ab. ab. a. CO Y RM ÁT. IC. A. 30. IN FO. 20. 10. DE. % INDICE PROFASICO. 40. M UN IC AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 0. T2. AS. T1. T3. T4. ST. EM. TRATAMIENTOS. DE. SI. Las letras (a-b) representan los 2 grupos estadísticamente homogéneos según los test comparación múltiple de media. Los promedios relacionados con la misma letra, no presentan diferencias significativas entre ellos para un valor P<0.05.. N. T1: Control, solamente agua potable 14 horas de exposición. O. T2: 0,25% de extracto hidroalcohólico (50ºGL) al 20 % de cáscaras de Citrus limon 14 horas de exposición. CC I. T3: 0,50% de extracto hidroalcohólico (50ºGL) al 20 % de cáscaras de Citrus limon 14 horas de exposición. RE. T4: 0,75% de extracto hidroalcohólico (50ºGL) al 20 % de cáscaras de Citrus limon 14 horas de exposición. DI. Figura 2. Índice Profásico y comparación de media en meristemos radiculares de Allium cepa Var. Roja Arequipeña, expuestos a los diferentes tratamientos con extracto hidroalcohólico de cáscaras de Citrus limon. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) M UN IC AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. b. 18. b. 16. CO. ab. Y. a. A. 12. RM ÁT. IC. 10 8 6. IN FO. % INDICE METAFASICO. 14. 4. DE. 2. AS. 0. T2. T3. T4. EM. T1. SI. ST. TRATAMIENTOS. DE. Las letras (a-b) representan los 2 grupos estadísticamente homogéneos según los test comparación múltiple de media. Los promedios relacionados con la misma letra, no presentan diferencias significativas entre ellos para un valor P<0.05.. N. T1: Control, solamente agua potable 14 horas de exposición. CC I. O. T2: 0,25% de extracto hidroalcohólico (50ºGL) al 20 % de cáscaras de Citrus limon 14 horas de exposición T3: 0,50% de extracto hidroalcohólico (50ºGL) al 20 % de cáscaras de Citrus limon 14 horas de exposición. RE. T4: 0,75% de extracto hidroalcohólico (50ºGL) al 20 % de cáscaras de Citrus limon 14 horas de exposición. DI. Figura 3. Índice Metafásico y comparación de media en meristemos radiculares de Allium cepa Var. Roja Arequipeña, expuestos a los diferentes tratamientos con extracto hidroalcohólico de cáscaras de Citrus limon. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) d. 20 18. Y. b a. A. 14. RM ÁT. IC. 12 10 8 6. IN FO. % INDICE ANAFASICO. CO. c. 16. M UN IC AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 4. DE. 2. AS. 0 T1. T2. T3. T4. SI. ST. EM. TRATAMIENTOS. N. DE. Las letras (a-d) representan los 4 grupos estadísticamente homogéneos según los test comparación múltiple de media. Los promedios relacionados con diferentes letras, presentan diferencias significativas entre ellos para un valor P<0.05.. O. T1: Control, solamente agua potable 14 horas de exposición. CC I. T2: 0,25% de extracto hidroalcohólico (50ºGL) al 20 % de cáscaras de Citrus limon 14 horas de exposición. RE. T3: 0,50% de extracto hidroalcohólico (50ºGL) al 20 % de cáscaras de Citrus limon 14 horas de exposición T4: 0,75% de extracto hidroalcohólico (50ºGL) al 20 % de cáscaras de Citrus limon 14 horas de exposición. DI. Figura 4. Índice Anafásico y comparación de media en meristemos radiculares de Allium cepa Var. Roja Arequipeña, expuestos a los diferentes tratamientos con extracto hidroalcohólico de cáscaras de Citrus limon. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) a a. a. ST. EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. Y. CO. a. M UN IC AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DE. SI. La letra (a) representa 1 grupo estadísticamente homogéneo según los test comparación múltiple de media. Los promedios relacionados con la misma letra, no presentan diferencias significativas entre ellos para un valor P<0.05. T1: Control, solamente agua potable 14 horas de exposición. O. N. T2: 0,25% de extracto hidroalcohólico (50ºGL) al 20 % de cáscaras de Citrus limon 14 horas de exposición. CC I. T3: 0,50% de extracto hidroalcohólico (50ºGL) al 20 % de cáscaras de Citrus limon 14 horas de exposición. RE. T4: 0,75% de extracto hidroalcohólico (50ºGL) al 20 % de cáscaras de Citrus limon 14 horas de exposición. DI. Figura 5. Índice Telofásico y comparación de media en meristemos radiculares de Allium cepa Var. Roja Arequipeña, expuestos a los diferentes tratamientos con extracto hidroalcohólico de cáscaras de Citrus limon. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. N. DISCUSION. AC IÓ. Al analizar los resultados obtenidos en condiciones de laboratorio y con. UN IC. las diferentes concentraciones de extracto hidroalcohólico (50°GL) de cáscaras de Citrus limon, se encontró que los valores del índice mitótico (IM) disminuye en. CO. M. relación al control (T1), sobre todo en el tratamiento expuesto a 0,75% (T4) de. Y. extracto hidroalcohólico de Citrus limon donde alcanzó un valor de 6.52% (Tabla. IC. A. 1, Figura 1). Esto se debería probablemente a que el extracto hidroalcohólico de. RM. ÁT. Citrus limon a la concentración y tiempo de exposición empleado, estaría actuando a nivel del segundo punto de control (G2) en el ciclo celular. IN FO. interfiriendo la formación del complejo Ciclina B – CdK1 (FPM: Factor Promotor. DE. de la Mitosis), que permite el paso a través de este punto hacia el período M, lo. AS. que ocasiona que las células no transiten normalmente de la fase G2 hacia la. EM. mitosis lo que trae como consecuencia la disminución del número de células en. SI ST. división.27,30,31 Similares resultados se obtuvieron empleando extracto de Annona. DE. muricata, extracto acuoso de Cyperus rotundus y sorbato de potasio en células. N. meristemáticas de Allium cepa.16,34,35 El análisis de varianza evidenció la. CC. IO. existencia de diferencias significativas entre los diferentes tratamientos ensayados. RE. y la prueba de comparación de media (Tabla 2), establece la conformación de. DI. cuatro grupos estadísticamente homogéneos en función a su efecto (T1, T2, T3 y T4).. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. En cuanto al índice profásico (IP) (Tabla 1 y Figura 2), se observó una disminución en los diferentes tratamientos, alcanzando (43.19 %) a 0,75% de extracto hidroalcohólico de Citrus limon (T4). Esto ocurriría debido a la acción de. AC IÓ. N. los flavonoides como hesperidina y diosmina, carotenoides, aceites esenciales D-. limoneno, citral, linalol, presentes en el extracto; alteran la formación del. UN IC. complejo Ciclina B – CdK1, traería como consecuencia que los procesos de. M. condensación del material genético y polimerización de microtúbulos para la. Y. CO. formación del huso se vean afectados.29,31,37 Similares resultados se obtuvieron al. A. evaluar el efecto citotóxico de aceite esencial de cáscaras de Citrus limon en una. ÁT. IC. línea celular humana colorrectal carcinoma LIM1863 in vitro.17 El análisis de. RM. varianza evidenció la existencia de diferencias significativas entre los diferentes. IN FO. tratamientos ensayados y la prueba de comparación de media (Tabla 3), establece. DE. la conformación de dos grupos estadísticamente homogéneos (T2,T3,T4 y. EM. AS. T1,T2,T3) en función a su efecto.. SI ST. La disminución del índice metafásico (IM) (Tabla 1 y Figura 3), hasta alcanzar valores de 12.56% a 0,75% de extracto hidroalcohólico de Citrus limon. DE. (T4), se debería a que los flavonoides como hesperidina y diosmina, carotenoides,. IO. N. aceites esenciales D-limoneno, citral, linalol, presentes en el extracto; actuarían. CC. inhibiendo los procesos regulados por el complejo Ciclina B - CdK1, el cual en. DI. RE. esta fase actúa sobre la formación de los centros de organización de microtúbulos. (COMT) que inducen el ensamblaje del huso mitótico; logrando que sólo un número reducido de células pasen a metafase.13,28,37 Similares resultados se obtuvieron empleando extracto etanólico de Lupinus mutabilis, jugo de Morinda. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. citrifolia, extracto etanólico de Annona muricata y Glycine max en células meristemáticas de Allium cepa.14,15,19,20 El análisis de varianza evidenció la existencia de diferencias significativas entre los diferentes tratamientos ensayados. AC IÓ. N. y la prueba de comparación de media (Tabla 4), establece la conformación de dos. UN IC. grupos estadísticamente homogéneos (T3,T4 y T1,T2,T3) en función a su efecto.. CO. M. El incremento en el índice anafásico (IA) (Tabla 1 y Figura 4),. Y. probablemente estaría ocurriendo por actividad de los flavonoides como. IC. A. hesperidina y diosmina, carotenoides, aceites esenciales D-limoneno, citral,. ÁT. linalol, presentes en el extracto hidroalcohólico de C. limon; estarían activando la. RM. conformación del complejo promotor de la anafase (APC); el cual se encarga de. IN FO. revisar que todos los cromosomas se hayan unido al huso mitótico. Si detecta que. DE. uno de los cinetocoros no se encuentra unido, manda una señal negativa al sistema. AS. de control inactivando proteínas implicadas en la separación de las cromátides. EM. hermanas, específicamente activa al conjunto APC-cdc20, lo que genera que la. SI ST. separasa, no degrade a las cohesinas impidiendo que las cromátides hermanas migren hacia los polos ecuatoriales. Esto traería como consecuencia que el. DE. número de células incrementen en anafase.13,27,29,37 El análisis de varianza. IO. N. evidenció la existencia de diferencias significativas entre los diferentes. CC. tratamientos ensayados y la prueba de comparación de media (Tabla 5), establece. DI. RE. la conformación de cuatro grupos estadísticamente homogéneos (T1, T2, T3 y T4) en función a su efecto.. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(40) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. La disminución del índice telofásico (IT) (Tabla 1 y Figura 5) se debería que los flavonoides como hesperidina y diosmina, carotenoides, aceites esenciales D-limoneno, citral, linalol, presentes en el extracto hidroalcohólico de Citrus. AC IÓ. N. limon no está afectando el proceso de segregación cromosómica también al incremento del número de células en anafase, lo que podría ocasionar una ligera. UN IC. disminución de células en telofase.30,31,36,38,43 Similares resultados se obtuvieron al. M. emplear extracto etanólico de Annona muricata en células meristemáticas de. Y. CO. Allium cepa.19 El análisis de varianza no evidenció la existencia de diferencias. IC. A. significativas entre los diferentes tratamientos ensayados y la prueba de. ÁT. comparación de media (Tabla 6), establece la conformación de un grupo. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. estadísticamente homogéneo en función a su efecto.. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(41) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CONCLUSIONES. N. Se determinó que el extracto hidroalcohólico de cáscaras de Citrus limon,. AC IÓ. si tiene efecto citotóxico, causando disminución de los valores del índice mitótico,. UN IC. profásico, metafásico e incrementando el índice anafásico sobre el ciclo celular en. CO. M. meristemos radiculares de Allium cepa.. A. Y. La concentración de 0,75% de extracto hidroalcohólico de cáscaras de. ÁT. IC. Citrus limon, presenta mayor efecto citotóxico sobre el ciclo celular en. IN FO. RM. meristemos radiculares de Allium cepa.. DE. El D-limoneno, uno de los componentes del extracto hidroacohólico de. AS. cáscaras de Citrus limon, afecta a la anafase incrementando el indice anafásico;. SI ST. EM. pero no afecta a la telofase sobre el ciclo celular en meristemos radiculares de. DI. RE. CC. IO. N. DE. Allium cepa.. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(42) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. AC IÓ. N. 1. Amin I, Norazaidah Y, Kie H. Antioxidant activity and phenolic. content of raw and blanched amaranthus species.. UN IC. Revista Food Chemical. 2006; 94(5):47-52.. M. 2. Schabra S, Ulso F, Mshin E. Phytochemical screening of. CO. Tanzanian medical plants. J Etnopharmacol. 1984;. IC. A. Y. 11(2):157-159.. ÁT. 3. Girard B, Mazza G. Functional grape and citrus products,. RM. Biochemical and Processing. Editorial Technomic.. IN FO. Pensilvania; 1998.. 4. Jiménez A, Rincón M, Calixto S. Lemon fruit Citrus limon as a. DE. new source of antioxidant dietary fiber. Journal of. EM. AS. agricultural and food chemistry. 2001; 49(2):5489-5493.. Caspi A, Libman I, Trakhtenberg S. Comparison of some biochemical characteristics of different citrus fruit. Journal of agricultural and food chemistry. 2001; 74(3):309-315.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. 5. Gorinstein S, Belloso O, Park S, Haruenkit R, Lojek A, Ciz M,. 6. Mostacero J, Mejia F, Ramirez R, Medina D, Pelaez F. Fundamento de la Fitogeografía y Recursos Naturales del Perú. Universidad Nacional de La Libertad. TrujilloPerú; 1990.. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(43) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 7. Del Río J, Fuster M, Porras I, García F, García L, Ortuño A. Componentes bioactivos del limón. Levante Agrícola.. AC IÓ. N. 2002; 62(3):323-326.. 8. Benavente O, Castillo J, Marín R, Ortuño A, Del Río J. Uses. UN IC. and properties of Citrus flavonoids. Journal of. CO. M. agricultural and food chemistry. 1997; 45(4):4505-4515.. 9. Kawaii S, Tomono Y, Katase E. Quantitative study of. Y. flavonoids in leaves of citrus plants. Journal of. ÁT. IC. A. agricultural and food chemistry. 2000; 48(2):3865-3871.. RM. 10. Ogawa K, Kawasaki A, Yoshida T. Evaluation of auraptene. IN FO. content in citrus fruits and their products. Journal of. DE. agricultural and food chemistry. 2000; 48(3):1763-1769.. 11. Rice C, Miller N, Paganga G. Antioxidant properties of. AS. phenolic compounds. Trends in Plant Science. 1997;. SI ST. EM. 2:152-159.. flavonoids.. Pharmacology. &. Therapeutics.. 2002;. 96(2):67-82.. DI. RE. CC. IO. N. DE. 12. Havsteen H. The biochemistry and medical significance of the. 13. Mauro M. Ensamblaje del huso mitótico y la citocinesis anormal inducida por D-limoneno en el cultivo de células de mamífero. Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biologiche Chimiche e Farmaceutiche. 2007; 21(4):20-25.. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(44) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 14. Fajardo K. Efecto protector del extracto etanólico de Lupinus mutabilis sobre la citotoxicidad y genotoxicidad del dicromato de potasio en meristemos radiculares de. AC IÓ. N. Allium cepa. Universidad Nacional de Trujillo. Tesis. UN IC. para optar el título de Biólogo. Trujillo – Perú; 2012.. 15. Cabrera Y. Efecto de tres concentraciones del jugo de Morinda. M. citrifolia “noni” sobre la citotoxicidad del dicromato de. CO. potasio en meristemos radiculares de Allium cepa.. Y. Universidad Nacional de Trujillo. Tesis para optar el. ÁT. IC. A. título de Biólogo. Trujillo – Perú; 2012.. RM. 16. Valderrama F. Efecto de diferentes concentraciones y tiempos de exposición de dos extractos de Annona muricata L. IN FO. “guanábana”. Universidad Nacional de Trujillo. Tesis. DE. para optar el título de Biólogo. Trujillo – Perú; 2009.. AS. 17. Samer A, Joma R. Efecto citotóxico del aceite esencial de. EM. cáscaras de Citrus limon L. en una línea celular de. DE. SI ST. carcinoma colorrectal LIM1863. Middle East Journal Of Cancer. 2012; 20(3):15-21.. DI. RE. CC. IO. N. 18. Saldaña J. Efecto de tres concentraciones del jugo de Brassica oleracea var. Itálica “brócoli” sobre la citotoxicidad del sorbato de potasio en meristemos radiculares de Allium cepa. Universidad Nacional de Trujillo. Trabajo de habilitación para ascenso de categoría de profesor auxiliar a asociado. Trujillo – Perú; 2013.. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(45) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 19. Araujo J. Efecto protector del extracto etanolico de Annona muricata sobre la citotoxicidad y genotoxicidad del sorbato de potasio en meristemos radiculares de Allium. AC IÓ. N. cepa. Universidad Nacional de Trujillo. Tesis para. UN IC. optar el título de biólogo. Trujillo – Perú; 2012.. 20. Díaz A. Efecto protector del extracto etanólico de Glycine max. M. sobre la citotoxicidad y genotoxicidad del dicromato de. CO. potasio en meristemos radiculares de. Allium cepa.. Y. Universidad Nacional de Trujillo. Tesis para optar el. ÁT. IC. A. título de biólogo. Trujillo – Perú; 2011.. RM. 21. Cartaya O, Reynaldo I. Optimización de la obtención del Complejo de Bioflavonoides del Limón. Revista. IN FO. Cubana de Química. IV Congreso Internacional de. DE. Química. 2001; 13(2):58-95.. AS. 22. Arnao B, Cano L, Acosta E. Estimación de la actividad. EM. antioxidante total en cítricos y su relación con el. 1998; 93(4):48-54.. DE. SI ST. contenido en vitamina C. Fruticultura Profesional.. C-glucosylflavone from lemon peel and antioxidative activity of flavonoid compounds in lemon fruit. Journal of agricultural and food chemistry. 1997; 45(12):46194623.. DI. RE. CC. IO. N. 23. Miyake Y, Yamamoto K, Morimitsu Y, Osawa T. Isolation of. 24. Park L, Avery M, Byers L, Nelson B. Identification of Bioflavonoides from citrus. Food Tecnology. 1983; 37(2):98- 105.. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..