Norma Técnica Ecuatoriana
LECHE Y PRODUCTOS LACTEOS.
DETERMINACION DE BACTERIAS PATOGENAS (SALMONELLA Y SHIGELLA)
INEN 720
1. OBJ ETO
1.1 Esta norma establece los métodos para determinar salmonella y shigella en leche y productos lácteos.
2. TERMINOLOGIA
2.1 Salmonella. Variedad de gérmenes entéricos integrado por microorganismos que forman colonias típi- cas sobre medios selectivos sólidos y poseen características bioquímicas y serológicas definidas.
2.2 Shigella. Género perteneciente a la familia entero bacteriacia, integrada por microorganismos de forma bacilar, inmóviles, gram negativos.
3. DISPOSICIONES GENERALES
3.1 Deberán cumplirse las disposiciones establecidas en la Norma INEN 17,
3.2 La determinación debe realizarse por duplicado sobre la misma muestra preparada.
4. INSTRUMENTAL Y EQUIPO
4.1 Area de trabajo. Limpia, bien iluminada, libre de corriente de aire, mesa nivelada, de superficie amplia y no porosa, desinfectada antes de cada análisis.
4.2 Incubador. Con regulador de temperatura, sensible ± 0,5°C.
4.3 Equipo de esterilización (autoclave).
4.4 Balanza analítica, sensible al 0,1 mg.
4.5 Utensilios, para preparación de los medios de cultivo de vidrio a base de borosilicato o materiales anti- corrosivos como acero inoxidable.
4.6 Pipetas, de 10 cm3, 1 cm3 con graduación de 0,1 cm3.
4.7 Porta pipetas, cajas de aluminio de acero inoxidable.
4.8 Frascos o tobos de dilución (de borosilicato con tapones de cristal, o con tapa de rosca y empaques que no produzcan compuestos tóxicos o bactericidas durante la esterilización).
Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN – Casilla 17-01-3999 – Baquerizo Moreno E8-29 y Almagro – Quito-Ecuador – Prohibida la reproducción
4.9 Cajas petri, de vidrio o pláticas (de 15 mm de altura X 100mm de diámetro), estériles.
4.10 Frascos de muestreo de borosilicato, con capacidad para contener el volumen necesario para el aná- lisis.
4.11 Refrigeradora, para almacenar medios de cultivo y guardar las muestras que lo requieran.
4.12 Baño de agua, con regulador de temperatura, para mantener el medio de cultivo ajustado a 45° ± 1°C.
4.13 Tubos de cultivo de 8 mm de diámetro x 160 mm de altura.
4.14 Tubos de cultivo, de 18 mm de diámetro x 180 mm de altura.
4.15 Tubos Durhan, de 5 mm de diámetro x 50 mm de altura.
4.16 Cilindro graduado del 100cm3.
4.17 Asa para cultivo.
5. REACTIVOS
5.1 Medios de cultivo, como reactivos para las pruebas bioquímicas, cuya composición y preparación se describen en el Anexo A.
6. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
6.1 Mezclar completamente el producto lácteo, agitando suavemente el recipiente que lo contiene varias veces, hasta que la muestra esté homogénea.
6.2 Si se forma grumos de crema, y éstos no se dispersan, calentar la muestra en baño de agua, a una tem- peratura entre 35°C - 40°C. Mezclar cuidadosamente e incorporar cualquier partícula de crema adherida al recipiente, y enfriar rápidamente a 18° ± 2°C.
6.3 Para la preparación de muestras de los productos, ver INEN 4. Leche y productos lácteos. Muestreo.
7. DETECCION DE SALMONELLA
7.1 Procedimiento
7.1.1 En condiciones asépticas, transferir 25 g de la muestra preparada dentro de un frasco de vidrio, de acuerdo a lo indicado en Anexo B para proceder a la homogenización, (ver 4,10) y agregar 225 cm3 de la solución A.1 (ver Anexo A). Homogeneizar, por un tiempo no más de 2,5 minutos (dilución 1:10) (ver Anexo B).
7.1.2 Siembra en medio selectivo pre-enriquecido. Transferir asépticamente 250 cm3 del liquido obtenido en 7.1.1, a un matraz Erlenmeyer de 500 cm3, dejar en reposo 60 minutos, controlar el pH a 6,8 ± 0,2, añadir 0,45 cm3 de la solución al 1% de bilis verde brillante. Colocar en la incubadora a 37°C ± 1°C, por el tiempo de 24 ± 1 hora.
7.1.3 Siembra en medio selectivo enriquecido. Transferir asépticamente 10 cm3 de la solución 7.1.2, a botellas o frascos de vidrio de borosilicato (ver 4.8) que previamente contendrá, la una 10 cm3 del caldo te-trationato (ver A.3), y la otra 10 cm3 de caldo cistina selenito (ver A.5) previamente calentado a 43°C. Incubar entre 42° ± 1°C por un tiempo de 48 horas.
7.1 4 Siembra en placas con agar selectivo. Preparar las cajas Petri, asépticamente y por duplicado, con los medios de cultivo selectivos, agar verde brillante rojo fenol (o agar salmonella shigella) (ver A.6 y A.15) y con el agar sulfito bismuto (ver A.7).
7.1.4.1 De cada uno de los cultivos en caldo tetrationato y en el caldo selenito cistina, tomar un inoculo y sembrar en la superficie de las cajas Petri que contienen el agar selectivo, y extender en forma de estrías para obtener colonias separadas.
7.1.4.2 Incubar invirtiendo las placas a 37° ± 1°C durante un tiempo de 24 horas. Si no aparecen colonias sospechosas de salmonella durante este tiempo, incubar otra vez y examinarla a las 48 horas.
7.1.4.3 Las colonias con agar verde brillante rojo fenol (ver A.6), se presentan en color que va del rosado al fuccia, transparente u opacas; en el medio o su alrededor, de rosado a rojo. Algunas salmonellas se presen-tan en colonias de color verde circulares si hay organismos que fermentan la lactosa o sacarosa; otros orga- nismos, que fermentan carbohidratos, producen colonias y zonas que son de color amarillo verdosas o ver- des; menos que 1% de la salmonella son atípicas y aquellas que fermentan la lactosa aparecen como colo- nias de color amarillo verdoso o verdes.
7.1.4.4 Las colonias en agar sulfito bismuto (ver A.7). Se presentan de un color café parduzco o negras y algunas veces con resplandor metálico. El medio circundante, en general, es café al comienzo, volviéndose negro conforme se incrementa el tiempo de incubación. Algunas cepas producen colonias verdes con oscu- recimiento o no del medio circundante.
7.1.4.5 Luego de examinadas las placas después de 24 h y 48 h, y en caso de presencia de colonias sospe- chosas de salmonella, viene la confirmación bioquímica y serológica.
7.1.5 Confirmación bioquímica. Seleccionar cinco colonias sospechosas de uno de los cultivos e inocular sobre las cajas Petri, con agar selectivo, en forma de estrías, con el fin de obtener colonias puras. Incubar durante 20 h y 24 h, a la temperatura de 37°C, invirtiendo las placas. Separar las colonias presuntivas e inocular las colonias separadas en los medios que a continuación se indican.
7.1.5.1 Agar triple azúcar hierro (TSI) (ver A.8). Las colonias que se hallan en el agar selectivo (ver 7.1.5), pasar al medio TSI (ver A.8) que se encuentra en tubos, en forma inclinada; entonces, inocular picando el fondo del tubo y luego deslizando el asa sobre la superficie inclinada del medio. Incubar los tubos a 37°C por el tiempo de 24 h, en caso de obtener resultados negativos, incubar por otras 24h00. Los cambios del medio se interpreta así:
Cultivo en el fondo del tubo
Amarillo Glucosa fermentada Rojo inalterado Glucosa no fermentada Negro Formación de gas sulfídrico Burbujas Gas formado por la glucosa
Cultivo en la superficie inclinada del medio
Amarillo Lactosa y/o sacarosa fermentada rojo inalterable Lactosa y/o sacarosa no fermentada
7.1.5.2 Agar urea. (ver A.9). En el medio que se encuentra ya preparado en los tubos y en forma inclinada, incubar las colonias en la superficie del medio valiéndose de una asa. Incubar a 37°C por 24 h y 48 h. Un color rojo indica reacción negativa para salmonella.
7.1.5.3 Caldo licina decarboxilasa (ver A. 10). Inocule justamente bajo la superficie del medio líquido las colonias. Incube a 37°C por un tiempo de 24 h. Un color púrpura después de crecer indica reacción positiva.
7.1.5.4 Reactivo B galactosidasa (ver A.11). En un tubo que contenga 0,25 cm3 de una solución salina estéril se hace una suspensión densa de las colonias que mostraron reacción típica en el agar TSI, se agrega una gota de tolueno, poner luego el tubo en el baño de agua a 37°C por varios minutos. Añadir 0,25 cm3 del reactivo B galactosidasa y mezclar. Poner nuevamente el tubo en el baño de agua a 37°C por 24 h. Un color amarillo indica una reacción positiva.
7.1.5.5 Medio VP (ver A.12). En dos tubos que contengan 2,0 cm3 del medio suspender las colonias en cada uno de ellos. Incubar un tubo a temperatura ambiente y el otro a 37°C, por un tiempo de 48 h. Añadir a cada tubo 0,6 cm3 de la solución alfa naftal al 5%, 0,2 cm3 de la solución de hidróxido de sodio al 40% y dos gotas de la creatina al 0,5%. Agitar después de la adición de cada uno de los reactivos y observar la reacción dentro de los 15 minutos. Un color rosado a rojo brillante indica reacción positiva.
7.1.5.6 Medio indol (ver A.13). Inocular en un tubo las colonias e incubar a 37°C por un tiempo de 24 h. Añadir 1 cm3 de reactivo de kovaes. (ver A.13.1). La formación de un color amarillo intenso indica reacción positiva.
Reacciones típicas de salmonella (Interpretación)
1. TS1 agar
Fondo del tubo - amarillo + (100%) fondo del tubo - negro + (91,6%) fondo del tubo - burbujas + (91,9%) tubo inclinado - rojo inalterado - (99,2%)
2. Urea agar
No hay cambio de color - (100%)
3. Lysina decarboxidasa
Color púrpura + (94,6%)
4. B galactosidasa
No hay cambio de color - (98,5%)
5. Reacción VP
No hay cambio de color - (100%)
6. Ensayo del indol
Color amarillo obscuro - (98,9%)
7.1.6 Confirmación serológica.
7.1.6.1 Para la identificación serológica de salmonellas, se recomienda partir de las colonias mantenidas en el medio agar nutritivo.
7.1.6.2 Los cultivos que por sus reacciones bioquímicas son sospechosos de salmonella, se ensayan con el antisuero monovalente 0 y el antisuero polivalente H. (ver A.21). Estos antisueros tienen anticuerpos que en conjunto representan a la mayoría de las salmonellas.
7.1.6.3 Los cultivos que dan reacciones positivas con estos dos antisueros polivalentes se ensayan nueva- mente con los antisueros 0 de grupo y H de mezcla de Spicer Edwards.
7.1.6.4 La prueba de lámina se efectúa transfiriendo en un tubo de ensayo una porción del cultivo en so- lución salina estéril, hasta formar una suspensión lechosa, luego se coloca en la lámina una gota de esta sus- pensión, se mezcla con una gota del antisuero a ser ensayado y se observa si se forma aglutinación. Si hay aglutinación, la reacción es considerada como positiva.
8. DETECCION DE SHIGELLA
8.1 Resumen
8.1.1 Se basa el método en el uso del medio XLD (agar xilosa-laina-desoxicolato) (ver A.14) o el medio ASS agar (salmonella shigella agar) (ver A.15). La presencia de xilosa es un agente que diferencia a la shi- gella porque no fermenta la xilosa y, en medio alcalino, presuntivamente aparecen colonias de color rojo.
8.2 Disposiciones generales
8.2.1 Deben cumplir las que se anotan en el numeral 3 de esta norma.
8.3 Instrumental
8.3.1 El instrumental será el mismo que se anota en el numeral 4 de esta norma.
8.4 Reactivos
8.4.1 Los medios de cultivo, como reactivos para las pruebas bioquímicas y serológicas, composición y pre- paración se describen en el Anexo A.
8.5 Preparación de la muestra
8.5.1 Se seguirá el mismo procedimiento que se anota en el numeral 6 de esta norma.
8.6 Procedimiento
8.6.1 Seguir el procedimiento que se anota en el numeral 7.1.1.
8.6.2 Tomar de la solución 8.6.1 un cm3 y colocar en el tubo de ensayo que debe contener 9 cm3 de agua peptonada (ver A.1), mezclar cuidadosamente y tendremos una dilución del 1:100; luego de esta solución, tomar 1 cm3 y transferir a otro tubo de ensayo que contendrá 9 cm3 de la solución agua peptonada (ver A.1), para tener una dilución del 1:1000 y así sucesivamente hasta obtener la dilución deseada (ver Anexo C).
8.6.3 Luego de cada una de las soluciones 8.6.2, transferir asépticamente y por duplicado 1 cm3 y colocar dentro de las cajas Petri que previamente deben contener 15 cm3 del medio de cultivo selectivo, ya sea el XLD (agar xilosa-lisina-desoxicolato) (ver A.14), o ya el medio ASS (agar salmonella shigella) (ver A.15).
8.6.4 Incubar a 37°C por el tiempo de 24 h, invirtiendo las cajas; luego examinarlas, contar el número de colonias presuntivas de shigellas que, si se ha usado el medio XLD, se obtendrán colonias de color rojo, pe- queñas y redondas, en cambio, si se ha usado el medio ASS, generalmente se presentarán colonias incoloras transparentes, de tamaño un poco menor que el de las colonias de salmonella en este medio. Las colonias shigella somei pueden ser más grandes, con su centro de color amarillo y ejes irregulares.
8.6.5 Se procede a confirmar a la shigella presuntivamente por reacciones bioquímicas y serológicas.
8.7 Confirmación bioquímica presuntiva
8.7.1 Proceder como se anota en el numeral 7.1.5, "Confirmación bioquímica para salmonella".
8.7.2 Los procedimientos estarán de acuerdo a lo anotado para salmonella, y los medios de cultivos y su confirmación serán los siguientes:
a) TSI (ver A.8). Color rojo en la superficie del tubo, amarillo en el fondo del tubo, ennegrecimiento del medio, no gas, no H2 S.
b) Ureasea (ver A.9) negativo, (no hay color rojo).
c) Motilidad (ver A. 16). No hay motilidad. SE inoculan varios tubos con el medio, a una temperatura de 35°C, durante uno o dos días y los organismos móviles crecen regándose en el agar a partir de la línea de inoculación.
d) Cianuro de potasio KCN (ver A.17). No hay crecimiento.
e) Medio indol (ver A.13). Positivo o negativo.
f) Medio VP (ver A.12). Negativo.
g) Citrato (ver A.18) No hay crecimiento.
h) Carbohidratos (ver A.19) No hay gas.
8.8 Confirmación serológica.
8.8.1 Para la identificación serológica de shigella se recomienda partir de las colonias mantenidas en el me-dio agar nutritivo.
8.8.2 Los cultivos que en sus reacciones bioquímicas son sospechosos de ser shigellas, se ensayan con los antisueros específicos estériles (ver A.20). Estos antisueros tienen anticuerpos que en conjunto representan a la mayoría de las sihigellas.
8.8.3 Los cultivos que dan reacciones positivas con los antisueros mono y polivalentes se ensayan con los antisueros.
8.8.4 La prueba de lámina se realiza transfiriendo en un tubo de ensayo una porción del cultivo en solución salina, hasta formar una superficie "lechosa", luego se coloca en la lámina una gota de esta suspensión, se mezcla con una gota del antisuero a ser ensayado (ver A.20) y se observa si se forma aglutinación y en cuál de los medios se produce la aglutinación. Si ocurre aglutinación, la reacción se considera como positiva.
8.8.5 Por otro lado, cultivos que en sus reacciones bioquímicas son sospechosos de ser shigellas y que han reaccionado en el serológico con aglutinamiento pobre o no, la suspensión debe ser calentada a ebullición por 15 a 30 min. Después de tal tratamiento, la suspensión es enfriada y reensayada por aglutinación.
9. INFORME DE RESULTADOS
9.1 Como resultado final, deben reportarse los resultados obtenidos en las determinaciones.
9.2 En el informe deben indicarse el método usado y el resultado obtenido. Debe mencionarse además cualquier condición no especificada en esta norma, o considerada como opcional, así como cualquier cir- cunstancia que pueda haber influido sobre el resultado.
9.3 En el reportaje debe incluirse la temperatura de incubación usada 35°C, 37°C, y en ciertos casos 43°C.
Además, debe incluirse todos los detalles requeridos para la completa identificación de la muestra.
ANEXO A
COMPOSICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
A.1 Agua peptonada
Peptona 1,0 g H2O destilada estéril 1 000 cm3
Disolver la peptona en 1 000cm3 de agua destilada estéril. Ajustar el pH a 6,8 ± 0,2. Colocar en el autoclave a 121ºC por el tiempo de 15 minutos.
A.2 Solución Buffer o solución stock para diluciones (Butterfield’s).
Fosfato ácido monopotásico 34 g Agua destilada 500 cm3 Solución de NaOH 1 N 175 cm3 Agua destilada estéril hasta obtener 1 000 cm3
El pH de esta solución debe ser de 7,2. Almacenar.
A.2.1 Diluyente. Tomar 1,25 cm3 de la solución A.2 en un balón aforado de 1 000cm3 y llevar a la marca con agua destilada estéril. Distribuir en frascos adecuados y esterilizar a 121ºC por un tiempo de 15 minutos.
A.3 Caldo tetrationato
Polipeptona 5,0 g Sales biliares 1,0 g Carbonato de sodio 10,0 g Tiosulfato de sodio 30,0 g Agua destilada estéril 1 000 cm3
Esterilizar en corriente a vapor durante 15 minutos y luego a cada 100 cm3 del medio tetrationato, adicionar asépticamente 2 cm3 de la solución de Yodo-Yoduro (ver a.4). El medio no puede ser calentado después de adicionar la solución yodada.
A.4 Solución Yodo-yoduro
Yodo 6,0 g Yoduro de potasio 5,0 g Agua destilada estéril 20,0 cm3
A.5 Caldo selenito cistina
Triptona 5,0 g Lactosa 4,0 g Fosfato disódico 10,0 g Selenito ácido de sodio 4,0 g Cistina 0,01 g Agua destilada 1 000 cm3
El pH final de be ajustarse a 7,0. No de esterilizarse al autoclave, sino debe colocarse en tubos y esterilizar en corriente de vapor durante 15 minutos.
A.6 Agar verde brillante rojo fenol.
Peptona 10,0 g Extracto de levadura 3,0 g Lactosa 10,0 g Sacarosa 10,0 g Cloruro de sodio 5,0 g Agar 20,0 g Verde brillante 0,0125 g Rojo fenol 0,08 g Agua destilada estéril 1 000 cm3
El pH final del medio debe ajustarse a 6,9 y esterilizarse a 121ºC durante 15 minutos.
A.7 Agar sulfito bismuto
Peptona o polipeptona 10,0 g Extracto de carne de vaca 5,0 g Glucosa 5,0 g Fosfato de sodio (Na2HPO4) 12 H2O 4,0 g Sulfato ferroso (FeSO4) 7 H2O 0,3 g Sulfato de bismuto (Bi2(SO3) 3 indicador 8,0 g Verde brillante 0,025 g Agar 20,0 g Agua destilada estéril 1 000 cm3
Mezclar y calentar con agitación ocasional, hervir durante un minuto hasta obtener una suspensión unifor me.
Si no se disolviera, calentar la suspensión entre 45ºC. La suspensión colocar en las Cajas Petri, aproxi-
madamente 20 cm3. Dejar solidificar durante dos horas, tapar las cajas. El pH del medio debe ser de 7,6 ± 0,1. No poner en autoclave.
A.8 Agar triple azúcar hierro (TSI).
Tiosulfato de sodio 0,20 g Polipeptona 20,0 g Cloruro de sodio 5,0 g Lactosa 10,0 g Sacarosa 10,0 g Dextrosa 1,0 g Sulfato férrico amoniacal 0,20 g Rojo fenol 0,025 g Agar 13,0 g Agua destilada estéril 1 000 cm3
El pH de la solución final debe ajustarse a 7,2. Debe colocarse en cada tubo suficiente cantidad del medio para obtener un buen espesor; se esteriliza a 118°C durante 15 min y se dejan enfriar los tubos en posición inclinada.
A.9 Agar urea
Peptona 1,0 g Cloruro de sodio 5,0 g Fosfato de potasio monobásico 2,0 g Glucosa 1,0 g Agar 20,0 g Rojo fenol 0,012 g Agua destilada estéril 1 000 cm3
El pH final debe ajustarse a 7,0; colocar el medio en recipiente adecuado y esterilizar a121°C durante 15 minutos. Enfriar a 50°C y añadir solución de urea al 20% previamente esterilizado por filtración.
A.10 Caldo licina decarboxilasa
L-lysina monohidrocloruro 5,0 g Extracto de levadura 3,0 g Glucosa 1,0 g Bromocresol púrpura 0,015 g Agua destilada estéril 1 000 cm3
Disolver el componente en agua estéril en ebullición. Ajustar el pH a 6,8 a 25°C. Transferir el medio en cantidad de 5 cm3 a tubos de ensayo, esterilizar el medio por calentamiento en autoclave por 15 minutos a121°C.
A.11 Reactivo B galactosidasa
A.11.1 Solución Buffer
Fosfato de sodio dihidrogenado (NaH2PO4) 6,9 g Hidróxido de sodio solución 0,1 mol/I de solución 3 cm3 Agua (volumen final) 50 cm3
Disolver el fosfato de sodio dihidrogenado en aproximadamente 45 cm3 de agua, ajuste el pH a 7,0 con so- lución de hidróxido de sodio, añadir el agua estéril y hacer a volumen; guardar en refrigeración.
A. 11.2 Solución ONPG
2 nitrofenil B-D galactopyranoside (ONPG) 80 mg Agua destilada estéril 15 cm3
Disolver el ONPG en agua calentada a 50°C, luego enfriar la solución.
A.11.3 Reactivo completo
Solución Buffer (ver 11.1) 5 cm3 Solución ONPG (ver 11.2) 15 cm3
Añadir la solución buffer a la solución ONPG, guardar en refrigeración a 4°C no más de un mes.
A.12 Medio Voges Proskaur
Peptona 7,0 g Glucosa 5,0 g Fosfato dipotásico ácido (K2HPO4) 5,0 g Agua destilada estéril 1 000 cm3
Disolver los componentes en agua, con calentamiento, si es necesario; ajustar el pH a 6,9; transferir 3 cm3 del medio a los tubos; esterilizar el medio por calentamiento en autoclave por 15 minutos a 121°C.
A.13 Medio indol
Triptona 10,0 g Cloruro de sodio 5,0 g DL triptofan 1,0 g Agua destilada estéril 1 000 cm3
Disolver los componentes en agua calentada a 100°C y filtrar; ajustar al pH de modo que después de la este- rilización a 25°C sea de 7,5; transferir 5 cm3 del medio a varios tubos; esterilizar el medio por calentamiento en autoclave por 15 minutos a 121°C.
A.13.1 Reactivo de Kovaes
Para dimetil amino benzo-aldehído 5,0 g Acido clorhídrico concentrado 25,0 g Alcohol amílico terciario 75,0 cm3
A.14 XLD Medio agar xilosa lisina desoxicolato
Xilosa 3,50 g L-lisina 5,00 g Lactosa 7,50 g Sacarosa 7,50 g Cloruro de sodio 5,00 g Extracto de levadura 3,00 g Rojo fenol 0,08 g Agar 13,50 g Desoxicolato de sodio 2,50 g Tiosulfato de sodio 6,80 g Citrato férrico amoniacal 0,80 g Agua destilada estéril 1 000 cm3
El pH final debe ajustarse a 7,4 y esterilizarse en corriente de vapor durante 15 minutos.
A.15 ASS. Agar salmonella shigella
Extracto de carne de res (o Lab-Lemco Powder) 5,0 g Peptona proteosa 5,0 g Lactosa 10,0 g Sales biliares 8,5 g Citrato de sodio 8,5 g Tiosulfato del sodio 8,5 g Citrato férrico 1,0 g Agar 13,5 g Verde brillante 0,33 g Rojo neutro 0,025 g Agua destilada estéril 1 000 cm3
El pH final debe ajustarse a 7,3; no debe esterilizarse en autoclave, por lo que se esteriliza en corriente de vapor durante 15 minutos.
A.16 Motilidad (Mo). Agar extracto de carne peptona
Extracto de carne 3,0 g Peptona 10,0 g Cloruro de sodio 5,0 g Agar 4,0 g Agua destilada estéril 1 000 cm3
El pH final debe ajustarse a 7,3; debe colocarse en tubos y esterilizarse a 121°C durante 15 minutos.
A.17 CNC. Cianuro de potasio
Peptona - proteosa 3,0 g Cloruro de sodio 5,0 g Fosfato de potasio monobásico 0,225 g Fosfato de sodio dibásico 5,64 g Agua destilada estéril 1 000 cm3
El pH final debe ajustarse a 7,6 debe colocarse en tubos y esterilizarse a 121°C durante 15 minutos; luego enfriar y al medio frío añadir 15 cm3 de solución al 0,5% de KCN.
A.18 Agar citrato
Cloruro de sodio 5,0 g Sulfato de magnesio 0,2 g
Fosfato de amonio 1,0 g Fosfato dipotásico 1,0 g Citrato de sodio 5,0 g Agar 20,0 g Azul de bromotinol 0,08 g Agua destilada estéril 1 000 cm3
El pH final debe ajustarse a 7,0; debe colocarse en tubos y esterilizarse a 121°C durante 15 minutos.
A.19 Carbohidratos medio base
Extracto de carne 1,0 g Triptona 10,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g Púrpura de bromocresol solución
Alcohólica al 10% 2,5 cm3 Agua destilada estéril 1 000 cm3
El pH final debe ajustarse a 7,2; colocarse en tubos a los que previamente se introduce un tubo de Durhan invertido y se esteriliza a 121°C, durante 15 minutos.
A.20 Antisueros específicos estériles
Antisalmonella typhosa Antiparatyphi A
Antiparatyphi B
Antishigella dysenteriae.
A.21 Antisuero monovalente O
Antisuero polivalente H
ANEXO B
DETECCION DE SALMONELLA
ANEXO C
ENUMERACION DE SHIGELLA
APENDICE Z
Z.1 NORMAS A CONSULTAR
INEN 17. Leche y productos lácteos. Examen microbiológico. Disposiciones Generales.
Z.2 BASES DE ESTUDIO
ISO 6579. Microbiology General guidance on methods for the detection of Salmonella. International Or- ganization for Standardization. Suiza. General. 1981.
Manual Oxoid. Medios de cultivo. Ingredientes para su preparación y otros elementos de laboratorio. SS Agar (modified). Salmonella shigella Agar Code CU 533. Fourth Edition, pp20. Oxoid Limited. Wade Road, Basingstoke Hampshire. England, 1981.
FÁO/food and nutrition paper. Manuals of food quality control 4. Microbiological analysis. M.R, Refai. FAO consultant faculty of veterinary medicine Giza. Egipt. Food and Agriculture organization of the United Nations, Rome, 1979.
FDA. Isolation and identification of salmonella and shigella. Division of Microbiology. Food and Drug Administration. Wallace H. Andres. Paul L. Poelma, Clyde R. Wilson, and Aida Romero. Washington, 1978.
AOAC. 46 Microbiological methods. Salmonella (3) Official final action Association of official Analytical chemists.
Washington, 1975.
Bacteriological Analytical Manual. Isolation of salmonella and Isolation of shigella. U.S. Department of health, education and welfare/Public Health service. Consumer Protection and Envirommental Health Service/food and Drug Administration/Division of microbiology, Washington, 1969.
Dr. D.A.A. Mossel. Control microbiológico de los alimentos. Detección de salmonellas. pp.50. Detección de shigellas pp 56. Instituto Central de alimentación T.N.O. Holanda, Ceiba. Lima, 1967.
(SALMONELLA Y SHIGELLA) . ORIGINAL:
Fecha de iniciación del estudio:
REVISIÓN:
Fecha de aprobación anterior por Consejo Directivo Oficialización con el Carácter de por Acuerdo No.
publicado en el Registro Oficial No.
Fecha de iniciación del estudio:
Fechas de consulta pública: 1983-04-18 a 1983-06-01
Subcomité Técnico: AL 03.01 Leche y productos lácteos
Fecha de iniciación: Fecha de aprobación: 1983-08-02 Integrantes del Subcomité Técnico:
NOMBRES:
Ing. Anibal Saltos Dr. Marco Morán
Sr. Federico Cordes Dra. Magdalena Báuz de Birga Dra. Yolanda de Fuentes Dra. Leonor Morales de Navas Dra. Rosa de León Dra. Mónica Sosa de Galárraga Dr. Patricio Jarrín
Dra. Leonor Orozco López
INSTITUCIÓN REPRESENTADA:
UNIVERSIDAD TECNICA DE AMBATO
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES NUTRICIO- NALES Y MEDICO SOCIALES – MINISTERIO DE SALUD
LA AVELINA
MINISTERIO DE SALUD INEDECA
IZQUIETA PEREZ – GUAYAQUIL IZQUIETA PEREZ – QUITO IZQUIETA PEREZ – QUITO IEOS
INEN
Otros trámites: ♦4 Esta norma sin ningún cambio en su contenido fue DESREGULARIZADA, pasando de OBLIGATORIA a VOLUNTARIA, según Resolución de Consejo Directivo de 1998-01-08 y oficializada mediante Acuerdo Ministerial No. 235 de 1998-05-04 publicado en el Registro Oficial No. 321 del 1998-05-20
El Consejo Directivo del INEN aprobó este proyecto de norma en sesión de 1985-02-08
Oficializada como: Obligatoria Por Acuerdo Ministerial No. 305 de 1985-05-14 Registro Oficial No. 202 de 1985-06-07
Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN
Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN ---- Baquerizo Moreno E8Baquerizo Moreno E8Baquerizo Moreno E8Baquerizo Moreno E8----29 y Av. 6 de Diciembre29 y Av. 6 de Diciembre29 y Av. 6 de Diciembre29 y Av. 6 de Diciembre Casilla 17
Casilla 17 Casilla 17
Casilla 17----01010101----3999 3999 3999 3999 ---- Telfs: (593 2)2 501885 al 2 501891 Telfs: (593 2)2 501885 al 2 501891 Telfs: (593 2)2 501885 al 2 501891 Telfs: (593 2)2 501885 al 2 501891 ---- Fax: (593 2) 2 567815Fax: (593 2) 2 567815Fax: (593 2) 2 567815Fax: (593 2) 2 567815 Dirección General: E
Dirección General: E Dirección General: E
Dirección General: E----Mail:Mail:Mail:Mail:[email protected]@[email protected] @inen.gov.ec gov.ec gov.ec Área Técnica de Normalización: E
Área Técnica de Normalización: EÁrea Técnica de Normalización: E
Área Técnica de Normalización: E----Mail:Mail:Mail:Mail:[email protected] @inen.gov.ec @inen.gov.ec @inen.gov.ec Área Técnica de Certificación: E
Área Técnica de Certificación: E Área Técnica de Certificación: E
Área Técnica de Certificación: E----Mail:Mail:Mail:certificacionMail:[email protected] @inen.gov.ec @inen.gov.ec @inen.gov.ec Área Técnica de Verificación: E
Área Técnica de Verificación: EÁrea Técnica de Verificación: E
Área Técnica de Verificación: E----Mail:Mail:Mail:verificacionMail:[email protected] @inen.gov.ec @inen.gov.ec @inen.gov.ec Área Técnica de Servicios Tecnológicos: E
Área Técnica de Servicios Tecnológicos: E Área Técnica de Servicios Tecnológicos: E
Área Técnica de Servicios Tecnológicos: E----Mail:Mail:Mail:inencatiMail:[email protected]@[email protected]@inen.gov.ec Regional Guayas: E
Regional Guayas: E Regional Guayas: E
Regional Guayas: E----Mail:Mail:Mail:Mail:[email protected] [email protected] @inen.gov.ec @inen.gov.ec Regional Azuay: E
Regional Azuay: E Regional Azuay: E
Regional Azuay: E----Mail:Mail:Mail:Mail:[email protected]@[email protected] [email protected] Regional Chimborazo: E
Regional Chimborazo: ERegional Chimborazo: E
Regional Chimborazo: E----Mail:inenMail:inenMail:inenMail:inenriobambariobambariobambariobamba@@@@ineninenineninen.gov.ec.gov.ec.gov.ec .gov.ec URL:www.inen.gov.ec
URL:www.inen.gov.ecURL:www.inen.gov.ec URL:www.inen.gov.ec
