JOURNAL OF
BIOENGINEERING AND
BIOMEDICINE
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Ingenieros Bioquímicos, A.C, that publishes relevant and recent knowledge of elds of interest in Biochemical Engineering and Biomedical Research.
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Universidad Nacional Autónoma de México, México.
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ISSN: 2594-052X, ambos otorgados por el Instituto Nacional del Derecho de Autor. Responsable de la última actualización de este Número, José Alberto Romero León Prolongación de Carpio y Plan de Ayala s/n, Col. Santo Tomás,
Alcaldía Miguel Hidalgo, C.P. 11340, Ciudad de México fecha de última modicación 31 de enero de 2021 Quarterly publication:
Edited and distributed by Colegio Mexicano de Ingenieros Bioquímicos, A.C.
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Technical editor:José Alberto Romero León
Prolongación de Carpio y Plan de Ayala s/n, Col. Santo Tomás, Alcaldía Miguel Hidalgo, C.P. 11340, Ciudad de México
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legal
Volume 5
Number 1
January
April
Mexico
2021
2019 - 2022
IBQ. Raúl Chávez Alvircio
President
Dr. Mario Alberto Rodríguez Casas
Vicepresident
M.en C. Felipe Neri Rodríguez Casasola
Secretary
M.en C. Yadira Fonseca Sabater
Treasurer
IBQ. Paula Parra Chavero
Subtreasurer
Area Authors Pages MICROBIOLOGY
Bacterial isolates from mucus of corals cultured ex-situ as resource of enzymes and potential probiotics
Salvador Embarcadero-Jiménez, Flor N. Rivera-Orduña, En Tao Wang
1-21
Bacterias provenientes de la mucosa de corales cultivados ex-situ como fuente de enzimas y potenciales probióticos
ENVIRONMENTAL AND SUSTAINABILITY
Degradación de ácido cianúrico por una comunidad microbiana en un reactor de lecho empacado
Silva-Lemus Irvin Alfonso, Sandoval-Carrasco Carlos Alberto, Salmerón-Alcocer Angélica, Ahuatzi-Chacón Deilia
22-34
Cyanuric acid degradation by a microbial community in a packed bed reactor
FOOD SCIENCE
Effect of probiotic microorganisms on strains of
Helicobacter pylori
Gonzalez-Magallanes B., Avilés-Jiménez, F., Hernández-Sánchez H.
35-42 Efecto de microorganismos probióticos sobre
cepas de Helicobacter pylori
BIOMEDICINE AND HEALTH
Assessment of broblasts inside dermal substitute for use skin tissue engineering
Barrera-Chong Alex, Garciadiego-Cazares David, Porras-Zamora Karla, Márquez Erick, González-Torres Maykel, Ibarra Clemente, Velasquillo Cristina, Ruvalcaba-Paredes Erika
Bacterial isolates from mucus of corals cultured ex-situ
as resource of enzymes and potential probiotics
Bacterias provenientes de la mucosa de corales cultivados
ex-situ como fuente de enzimas y potenciales probióticos
Salvador Embarcadero-Jiménez
1*, Flor N. Rivera-Orduña
2, En Tao Wang
21 Laboratorio de Corrosión Microbiológica, Instituto Mexicano del Petróleo, Mexico City, Mexico.
2 Laboratorio de Ecología Microbiana, Departamento de Microbiología, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas,
Instituto Politécnico Nacional, Mexico City, Mexico.
*Corresponding author: [email protected]
Recibido: 6 de octubre de 2020 / Aceptado: 24 de noviembre de 2020 / Publicado en línea: 31 de enero de 2021
Abstract.Focused on exploring the diversity and bioengineering potential of the cultivable bacteria associated with propagated corals in captivity, 63 bacterial strains were isolated from the external mucus of 5 coral species: Discosoma sp., Fungia sp., Xenia sp., Ricordea florida, and Seriatopora hystrix. Phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene classified these strains into the phyla Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes and Proteobacteria, and some of them represented potential novel taxa. The genera Vibrio, Alteromonas and Pseudoalteromonas were isolated from all the five coral species, while many others were isolated from only one or two species. In the phenotypic characterization, fourteen strains (22%) showed antimicrobial activity against at least one indicator pathogenic bacteria. The strains of Pseudoalteromonas ruthenica inhibited 6 of the 7 indicator bacteria, including the corals and fish pathogens Aeromonas bestiarum, Serratia marcescens, and Vibrio fortis. Starch hydrolysis and nitrate reduction were the common metabolic activities among the strains, suggesting that the coral-associated bacteria may be involved in the nutrient C and N recycling. All the results indicate that the corals harboured valuable bacteria with potential for biotechnological applications and potential probiotics, which may reduce the breakdown of coral reefs. As far as we know this is the first report about the culturable microbiota of Discosoma sp. and R. florida, which enlarges our knowledge about the coral-associated microorganisms and their beneficial interactions.
Keywords. Cultured corals, coral-associated bacteria, antimicrobial activity, enzymatic activities.
Resumen. Con el objetivo de explorar la diversidad y potencial biotecnológico de las bacterias cultivables asociadas a corales propagados en cautividad se aislaron 63 cepas bacterianas a partir de la mucosa externa de 5 especies de coral: Discosoma sp., Fungia sp., Xenia sp., Ricordea florida y Seriatopora hystrix. El análisis filogenético con base en las secuencias del gen 16S rRNA permitió clasificar a estas cepas en los phyla Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes y Proteobacteria, donde algunas de las secuencias representan potenciales nuevos taxa. Las cepas clasificadas en los géneros Vibrio, Alteromonas y Pseudoalteromonas fueron aisladas en las 5 especies de coral, mientras que otras solo fueron recuperadas a partir de uno o dos especies de coral. La caracterización fenotípica mostró que 14 cepas (22 %) mostraron actividad antimicrobiana contra al menos una bacteria patógena indicadora. Las cepas de Pseudoalteromonas ruthenica inhibieron 6 de las 7 bacterias indicadoras probadas, incluyendo Aeromonas bestiarum, Serratia
marcescens y Vibrio fortis, los cuales son patógenos de corales y peces. La hidrólisis de almidón y la reducción de nitrato fueron las actividades metabólicas más comunes entre las cepas, lo cual sugiere que las bacterias recuperadas podrían estar involucradas en el reciclaje de C y N. Todos los resultados indican que los corales estudiados albergan valiosas bacterias con potencial biotecnológico y como agentes de control biológico. Hasta donde sabemos este es el primer reporte sobre la microbiota cultivable de los corales R. florida y Discosoma sp., lo cual aumenta nuestro conocimiento sobre los microorganismos asociados a los corales y sus interacciones benéficas.
Palabras clave. Corales cultivados, bacterias asociadas al coral, actividad antimicrobiana, actividades
enzimáticas.
INTRODUCCIÓN
Los corales (phylum Cnidaria) han sido considerados holobiontes modelo al estar constituidos por animales (pólipos de coral), dinoflagelados fotosintéticos (Symbiodinium spp.), hongos filamentosos, levaduras, bacterias,
arqueas y virus.1 Estos microorganismos son
indispensables en el crecimiento, salud y evolución de sus hospederos, al mismo tiempo que generan una intrincada red de relaciones biológicas cuya máxima expresión son los arrecifes de coral, los cuales son ecosistemas altamente productivos con una gran diversidad biológica. La gran mayoría de los corales formadores de arrecifes se desarrollan en aguas pobres en nutrientes, por lo que la fotosíntesis, fijación del nitrógeno, y el reciclaje de nitrógeno y carbono mediados por microorganismos son procesos clave que
permiten la existencia de estos ecosistemas.2 Las
comunidades microbianas asociadas al coral se encuentran localizadas en numerosos sitios, tales como el esqueleto calcáreo, gastrodermis, epidermis y la capa externa de mucosa que protege al coral
de la desecación y de ataques químicos y físicos.3
Los microorganismos que establecen asociaciones con los corales desarrollan la fijación de nitrógeno,4
regulan la cantidad de nitrógeno biodisponible,5
sintetizan vitaminas esenciales como B126 y
desarrollan actividades antimicrobianas en contra de bacterias patógenas a través de mecanismos como la competencia por espacio físico, secuestro
de nutrientes, disrupción de señales quorum-sensing y producción de metabolitos con actividad
antimicrobiana. 2,3,7,8,9 En general, todos aquellos
microrganismos capaces de promover la salud de
los corales pueden considerarse como probióticos.10
Por otra parte, los corales pueden representar una interesante fuente de cepas bacterianas con potencial biotecnológico al producir enzimas hidrolíticas, compuestos antimicrobianos, fungicidas, moléculas con actividad inhibidora de bioensuciamiento (biofouling), entre otras. 7,9,11,12
Así mismo, algunos compuestos activos obtenidos a partir de los tejidos del coral, como toxinas o antimicrobianos son realmente sintetizados parcial o totalmente por microorganismos asociados a los
corales.13 Aunque una limitada proporción de los
microorganismos asociados a los corales pueden ser cultivados en el laboratorio, este enfoque es atractivo para investigar su eco-fisiología, variación genética, evolución y potencial biotecnológico. En la mayoría de los estudios se han caracterizado los microorganismos presentes en corales colectados directamente en el mar. En contraste existe información limitada acerca de las comunidades bacterias de corales mantenidos en cautiverio dentro de sistemas cerrados sin comunicación con el océano (ex situ). Esta práctica ha derivado en la acuacultura de corales en cautiverio, la cual es una creciente actividad que permite la restauración de arrecifes en coral que han sufrido daño por las
actividad humana o por el cambio climático. Al mismo tiempo representa una fuente de organismos ornamentales para la industria de los acuarios marinos, con lo que se reduce la depredación de
corales salvajes.14 Al mismo tiempo, la acuacultura
de corales ha permitido la obtención de biomasa para el descubrimiento y producción industrial
de fármacos.14 Aunque la composición de las
comunidades microbianas puede cambiar cuando los corales son transferidos de su ambiente natural a un sistema cerrado,15 existe evidencia que sugiere
que los grupos bacterianos que son específicos para cada especie de coral se establecen desde los primeros estadios de desarrollo y persisten
durante el ciclo de vida del organismo.4, 16 Por lo
tanto el estudio de los microorganismos asociados a corales mantenidos en cautiverio permite conocer sus relaciones simbióticas con los corales, por ejemplo al prevenir enfermedades infecciosas, al mismo tiempo que se puede explorar su potencial biomédico y biotecnológico.7, 11, 12
Con base a lo anterior, el objetivo de este trabajo fue llevar a cabo un estudio descriptivo para estimar el papel ecológico y potencial biotecnológico de las bacterias cultivables asociadas a cinco especies de corales acuacultivados. Para ello, los aislados fueron identificados mediante la secuenciación del gen 16S rRNA; se evaluó su capacidad para producir exo-enzimas, desnitrificar y evaluó su potencial antagónico sobre bacterias patógenas indicadoras.
MATERIALES Y MÉTODOS
Descripción del tanque y recolección de muestras Los corales empleados en este trabajo fueron mantenidos en un sistema constituido por un tanque principal de 45 L y un refugio (tanque secundario) de 10 L. El sistema ha estado funcionando por más de 6 años consecutivos, y ha sido empleado como acuario de exhibición y propagación de corales mediante fragmentación manual y reproducción
asexual espontánea. El sistema de filtración consiste en roca viva (esqueletos de coral cubiertos por alga coralina incrustante e invertebrados sésiles) la cual actúa como filtro biológico. El 5 % del volumen de agua es cambiado cada semana empleando la mezcla de sal marina artificial Red Sea Coral Pro (Red Sea Aquatics Ltd, Israel). El sistema de iluminación está integrado por una lámpara con tubos fluorescentes T5 HO, uno de ellos de luz actínica (temperatura de color de 12,000 K) y otro de luz diurna (6500 K) El ciclo de iluminación al que estaba sometido el tanque fue de 8 h de luz y 16 h de oscuridad. Los especímenes de coral muestreados fueron 3 individuos clonales de Xenia sp. (Alcyonacea: Xeniidae), una colonia de 5 individuos de Ricordea florida (Corallimorpharia: Ricordeidae), 3 individuos clonales de Discosoma sp. (Corallimorpharia:Discosomidae), 3 fragmentos clonales de Seriatopora hystrix (Scleractinia: Pocilloporidae), y un espécimen de Fungia sp. (Scleractinia: Fungiidae). Estos organismos fueron seleccionados debido a que previamente se documentó su asociación con bacterias
cultivables.17,18 Estas especies de coral son
relativamente robustas, su reproducción asexual no es complicada y son de gran interés entre los acuaristas. La identificación de cada organismo se
llevó a cabo con la guía taxonómica de Borneman19.
Al momento de realizar el muestreo, las características fisicoquímicas del agua eran las siguientes: temperatura 26 °C, gravedad específica
1.026, alcalinidad 107 ppm como CaCO3, pH 8.4,
nitrato y fosfato indetectables mediante métodos colorimétricos. La mucosa de cada espécimen fue recuperada con la ayuda de una micropipeta, recolectando entre 100 a 500 μL de muestra. Adicionalmente, se emplearon asas microbiológicas desechables para recolectar la muestra al raspar ligeramente la superficie del coral. Una vez recolectada la muestra cada asa fue sumergida y agitada en tubos con 1 mL de agua marina artificial estéril (AMA), la cual fue preparada con la mezcla
de sales Red Sea Coral Pro. Adicionalmente se recuperaron 15 mL de agua del tanque con la finalidad de determinar el número de bacterias cultivables presentes en la columna de agua. Cuantificación y aislamiento de los
microorganismos
Para cuantificar las bacterias presentes en la mucosa colectada y en la columna de agua se prepararon diluciones seriadas de las muestras
con un factor de 10 hasta la dilución 10-5,
empleando para ello AMA como diluyente. Se tomaron alícuotas de 50 μL de cada dilución y se sembraron por triplicado mediante el método de dispersión en Agar Marino 2216 (AM 2216), el cual se preparó siguiendo la formulación de Difco. El medio estaba suplementado con glicerol al 1 % (v/v) como fuente complementaria de carbono. Cada dilución se sembró por triplicado.
Las placas se incubaron a 28 °C y se mantuvieron en observación hasta por 96 h. Para el aislamiento de los microorganismos, 50 a 100 μL de cada muestra de mucosa fueron inoculadas mediante la técnica de dispersión en superficie y estría cruzada en cajas Petri con medio AM 2216. Este medio se suplementó con glicerol al 1 % (v/v). Las cajas fueron incubadas a 28 °C hasta por 96 h. Al mismo tiempo se inocularon cajas con
medio Gause17 (sin antibióticos), las cuales
se incubaron hasta por 10 días. Este medio está diseñado para el aislamiento de bacterias filamentosas del phylum Actinobacteria. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se seleccionó una colonia bacteriana de cada morfotipo identificado, la cual se volvió a sembrar mediante estría cruzada en placas con AM 2216, esto con la finalidad de obtener cultivos axénicos, los cuales fueron conservados mediante criopreservación.
Extracción del ADN, amplificación por PCR y secuenciación del gen 16S rRNA bacteriano Para la extracción del ADN genómico, se procedió a cultivar cada cepa en un vial con 5 mL de medio caldo marino 2216 (CM 2216). Las cepas se incubaron a 28 °C por 24 - 48 h. Enseguida se recuperó el paquete celular
mediante centrifugación (7155 ×g por 5 min).
La extracción del ADN se realizó de acuerdo al
protocolo descrito por Hoffman y Winston.20
La integridad del ADN total se verificó por medio de electroforesis en un gel de agarosa al 1 % (p/v),
empleando regulador TAE 1×. Para observar las
bandas de ADN los geles se tiñeron en bromuro de etidio y se observaron bajo luz UV en un transiluminador AlphaImager (Alpha Innotech, EE. UU.), equipado con una cámara digital. El gen 16S rRNA de cada cepa fue amplificado con los iniciadores 27F (5 ́-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 ́) y 1492R (5 ́-TAC GGY TAC CTT
GTT ACG ACTT-3 ́).21 La amplificación se llevó a
cabo en un volumen de 25 μL de reacción, con 25
a 50 ng de ADN molde, 10 pMol de cada iniciador y 1 U de la polimerasa DreamTaq (ThermoFisher Scientific, EE.UU.). La amplificación se llevó a cabo en un termociclador Veriti de 96 pozos (Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific, EE. UU.). La calidad e integridad de los productos de PCR se verificó mediante electroforesis. Los productos de PCR fueron purificados empleando el kit GeneJET (ThermoFisher Scientific, EE. UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los amplicones fueron enviados a Macrogen Inc. (Seul, Corea del Sur), para su secuenciación. Análisis filogenético
Las secuencias obtenidas fueron comparadas en
la base de datos del NCBI GenBank (https://blast.
ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), mediante búsqueda BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).
A continuación se realizó un alineamiento múltiple con el programa CLUSTAL X versión
2.122 de las secuencias problema y de las
secuencias de referencia que mostraron los mayores porcentajes de identidad.
A continuación se eliminaron sitios ambiguos en el alineamiento empleando el software Seaview
versión 4.4.2.23 Con este conjunto de datos se
realizó un análisis de inferencia filogenética por Máxima Verosimilitud en la plataforma PhyML (http://atgc.lirmm.fr/phyml/),24 y el modelo
de sustitución nucleotídica se estimó con el software jModeltest versión 2.1.7 con base en
el criterio de información de Akaike (AIC).25 El
modelo seleccionado para el árbol filogenético fue el GTR+I+G, con una proporción de sitios invariantes (I) de 0.340, y una distribución gamma
(Γ) de 0.777; con A=0.250, C=0.230, G=0.315,
T = 0.205. La robustez de cada nodo del árbol fue probada por el método de bootstrap a través de 1000 pseudo-réplicas. Como grupo externo se empleó a Anabaena variabilis ATCC 29413 (Figura 1). Las similitudes entre las secuencias fueron calculadas con el software MatGAT
versión 2.01.26 La asignación taxonómica fue
determinada siguiendo los criterios de
Roselló-Mora.27 Todas las secuencias del gen 16S rRNA
fueron depositadas en el GenBank del NCBI bajo los números de acceso KP843663-KP843722 y KR108215-KR108217.
Ensayo de inhibición microbiana
Debido a que los microorganismos marinos son considerados potencialmente productores de nuevos antibióticos, y no solo para patógenos de animales acuáticos, la actividad antibacteriana y antifúngica de cada aislado fue probada en contra de los siguientes microorganismos indicadores de importancia clínica: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Kocuria rhizophila ECOM1, Serratia marcescens DZM, Escherichia coli
ECOM3, Pseudomonas aeruginosa ECOM2 y Candida albicans ATCC 10231. Asimismo, se incluyeron dos cepas de patógenos potenciales para animales acuáticos: Aeromonas bestiarum D12 y Vibrio fortis VSP. Para evaluar la actividad inhibidora o antagónica se empleó el método de la
gota.28 Para ello cada aislado y microorganismo
indicador fue cultivado por separado en viales conteniendo 5 mL de CM 2216 e incubado por 24 h a 28 °C en cultivo sin agitación hasta alcanzar
una DO600=1.0. Entonces cada bacteria indicadora
fue sembrada empleando un hisopo estéril en cajas con AM 2216 (se añadieron 100 μL por placa).
Posteriormente, se colocaron gotas de 5 μL de
cada aislado por triplicado sobre el medio sólido previamente inoculado con el microorganismo indicador, y enseguida fueron incubadas por 24 a 36 h a 28°C. Como control negativo se colocaron gotas del medio CM 2216 estéril. Una zona libre de crecimiento bacteriano alrededor de cada aislado fue considerada
como inhibición positiva (Figura 2).
Los índices de inhibición fueron calculados al dividir el diámetro de la zona de inhibición entre el diámetro de la colonia formada por cada cepa probada. Subsecuentemente se preparó un medio de cultivo libre de células y extractos orgánicos con los aislados que presentaron halos de inhibición sobre los microorganismos indicadores. Para ello, cada aislado fue cultivado sin agitación en un matraz con 30 mL de CM 2216, los cuales fueron incubados por 2 a 4 días a 28 °C, hasta que
alcanzaron una densidad óptima (DO600=1.0).
Transcurrido el tiempo, 5 mL del cultivo fue centrifugado a 10,000 ×g y pasado a través de un filtro estéril desechable CORNING con
poros de 0.22 μm de diámetro (Corning Inc,
Alemania), esto con la finalidad de remover las células bacterianas. La actividad antibacteriana del sobrenadante libre de células fue evaluada
Fig. 1. Árbol filogenético de las secuencias del gen 16S rRNA de las cepas recuperadas a partir de la mucosa externa de los corales. El árbol fue construido mediante el método de máxima verosimilitud. A) Filogenia de los phyla Actinobacteria, Firmicutes y
Bacteroidetes. B) Filogenia de las secuencias clasificadas en el phylum Proteobacteria. Los valores de Bootstrap mayores al 50 %
fueron indicados en los nodos. Las secuencias acompañadas con el triángulo negro corresponden a las cepas que presentaron actividad antimicrobiana contra una o más bacterias indicadoras. La barra inferior representa 20 sustituciones pro cada 100 nucleótidos.
Firmicutes Actinobacteria
Bacteoidetes
FunM7 (KP843710)
Labrenzia aggregata HNS063 (JQ738393) Stappia conradae MIO (NR_115950) Labrenzia alba 5OM6 (NR_042378)
Tropicibacter phthalicus KU27E1 (AB636139)
Rf17 (KP843678) Ponticoccus litoralis CLGR66 (NR_044174) Rf5 (KP843666) Tropicibacter naphthalenivorans C02 (NR_041596) Tropicibacter mediterraneus M17 (NR_125557) ShZ3 (KP843700) Tropicibacter multivorans MD5 (NR_108509) ShZ1 (KP843699) Ruegeria mobilis NBRC 101030 (NR_116521) Sh2 (KP843693) Ruegeria atlantica NBRC15792 (NR_112615) Paracoccus stylophorae KTW16 (NR_117275) Rf16 (KP843677)
Paracoccus carotinifaciens E-396 (NR_024658)
Paracoccus marcusii MH1 (NR_044922) Alcanivorax dieselolei B-5 (NR_043106)
Alcanivorax venustensis ISO4 (NR_025145) Rf17-1 (KP843679)
Microbulbifer variabilis Ni-2088 (NR_041021)
Microbulbifer mediterraneus UST040317-067 (DQ096579)
Rf9 (KP843670)
Microbulbifer epialgicus F_104 (NR_041493)
Spongiibacter tropicus CL-CB22 (NR_116117) Sh4 (KP843695)
Spongiibacter marinus HAL40b (NR_042454) X14 (KP843689)
Halomonas subterranea ZG16 (NR_044116) Halomonas janggokensis M24 (NR_042489)
FunM2 (KP843705)
Halomonas venusta GSP24 (AY553074) X13 (KP843688)
Halomonas variabilis NY-10 (JN903904) Halomonas arcis AJ282 (NR_044115) Chromohalobacter nigrandesensis LTS-4N (NR_042011) Chromohalobacter israelensis (NR_025431) Chromohalobacter salexigens DSM (NR_074225) Rf6 (KP843667) Marinobacter mobilis CN46 (NR_044456) Rf13 (KP843674)
Marinobacter xestospongiae UST0904181611 (NR_109066) Idiomarina abyssalis KMM 227 (NR_024891) Idiomarina fontislapidosi F23 (NR_029115)
Idiomarina baltica OS145 (NR_027560) Rf3 (KP843665)
Alteromonas sp. S89 (JN654450) Sh5 (KP843696) Rf1 (KP843663) Fun3 (KP843714)
Alteromonas sp. KU27F1 (AB636144)
Alteromonas sp. AKA07-1 (AB571941)
Aestuariibacter halophilus L-08 (HG315013) Fun4 (KP843715) Alteromonas marina MR32c (HQ439507) Alteromonas tagae BCRC 17571 (NR_043977) Alteromonas macleodii 107 (NR_037127), FunM4 (KP843707), FunM6 (KP843709), Sh3 (KP843694), Disc3 (KP843718), Rf10 (KP843671), Sh6 (KP843697) Sh7 (KP843698), FunM1 (KP843704), Rf11 (KP843672) Pseudoalteromonas arabiensis k53 (NR_113230) Pseudoalteromonas ruthenica KMM300 (NR_025140) Rf2 (KP843664) Sh1 (KP843692) Disc4 (KP843719) X11 (KP843687) Photobacterium lutimaris DF42 (NR_043902) Photobacterium rosenbergii CC1 (NR_042343) X7 (KP843685) Photobacterium damselae NBRC15633 (NR_113783) Photobacterium leiognathi L1 (NR_029253) XLum (KP843691)
Vibrio halioticoli HDD1-2 (AY426978) Vibrio ezurae HDS1-1 (NR_ 025779) Vibrio owensii DY05 (NR_117424) Fun2 (KP843713) Vibrio aestivus M22 (NR_108873) Vibrio sp. JZ08ML52 (HM117125) Rf7 (KP843668) Vibrio nigripulchritudo (NR_121769) X10 (KP843686) X15 (KP843690)
Vibrio harveyi BTD O111 (JN871700)
Disc1 (KP843716) Disc2 (KP843717)
Vibrio maritimus R-40493 (NR_117551) Vibrio nereis ATCC 25917 (NR_118092)
Vibrio xuii R15052 (NR_025478)
X4 (KP843682)
Vibrio atypicus HHS02 (NR_116535) Vibrio tubiashii ATCC 19109 (NR_118093)
X6 (KP843684) X5 (KP843683) X1 (KP843680) Fun1 (KP843712) Marinomonas brasilensis R-40503 (NR_40503) Marinomonas arenicola KMM3893 (NR_112826) FunM5 (KP843708)
Marinomonas pollencensis IVIA-Po-185 (NR_116231) Amphritea atlantica VSD616 (KC534278)
Amphritea sp. Ap52 (HE818222) Amphritea sp. MEBiC05461T (GU289646)
Rf12 (KP843673)
Anabaena variabilis ATCC 29413 (NR_074300)
100 100 97 52 89 81 100 92 100 89 75 76 87 100 99 100 97 99 100 100 100 61 67 100 66 99 100 58 65 77 64 100 100 100 96 100 96 100 100 100 71 100 100 100 82 89 86 100 98 95 100 66 82 99 100 99 100 83 100 81 67 71 90 70 68 92 55 89 100 82 59 100 69 71 100 100 100 100 75 99 100 91 100 0.2 Alphaproteobacteria Gammaproteobacteria
Pseudoalteromonas flavipulchra NCIMB 2033 (NR_025126)
Pseudoalteromonas luteoviolacea NCIMB 1893 (NR_026221) FunVF5 (KR108216) RfVR18 (KR108217) 97 100 73 100 80 61 100 Disc 5 (KR108215) B)
como se describió previamente. Por otro lado, para extraer posibles moléculas con actividad antimicrobiana, 25 mL del medio restante fueron
mezclados con un volumen de acetato de etilo,29
el cual se dejó evaporar a temperatura ambiente. A continuación, el residuo se resuspendió en
500 μL de una mezcla de agua y etanol (7:3). Se
depositaron 10 μL de cada extracto sobre discos de
papel filtro esterilizado (6 mm de diámetro). Los discos húmedos se dejaron secar a temperatura ambiente y se colocaron por triplicado sobre placas de medio AM 2216 donde se inoculó por dispersión cada cepa indicadora. Después de 24 h de incubación se realizaron las observaciones. Caracterización fenotípica y perfil exoenzimático de los aislados
A todos los aislados se les realizó tinción Gram para determinar su morfología celular y afinidad por los colorantes. La actividad desnitrificadora fue probada en tubos de ensayo con 10 mL de caldo nitratos para bacterias marinas, el cual contenía peptona de caseína 5 g/L, extracto de
levadura 1 g/L, FeSO4 0.01 g/L, tioglicolato
de sodio 0.05/L g, KNO3 0.5, g/L. Todos los
componentes se agregaron a 1 L de AMA. Cada tubo contenía una campana de Durham con la finalidad de capturar las especies de nitrógeno producidas durante la desnitrificación.
Los tubos fueron incubados a 28 °C por hasta 7 días. Para observar la reducción de nitratos
fue empleado el reactivo de Griess.30 Para la
degradación de enzimática de los sustratos se
empleó un medio basal (KH2PO4 0.3 g, Na2CO3
0.25 g, MgSO4.7H2O 0.275 g, extracto de levadura
0.1 g, agar 15 g, AMA 1 L, con pH ajustado a 8.2). Los sustratos probados en el medio basal fueron carboximetil-celulosa (CMC) a una concentración de 5 g/L, almidón, 10 g/L y quitina coloidal, 10
g/L.31 Para observar la degradación del CMC y el
almidón los medios de cultivo se suplementaron
con rojo Congo (0.01 g/L). Cada cepa fue inoculada por triplicado. La degradación positiva de estos carbohidratos fue identificada como un
halo amarillo pálido alrededor de la colonia.32 En
el caso de que la degradación de almidón fuera poco visible se empleó una solución de Lugol para poner de manifiesto los halos transparentes de hidrólisis alrededor de la colonia bacteriana. Para observar la degradación de quitina, las placas fueron inoculadas por el método de picadura e incubadas a 28 °C hasta por 7 días.
La observación de una zona clara alrededor de la colonia fue considerada como degradación
positiva.31 Todos los índices de degradación
fueron calculados al dividir el diámetro de la zona de hidrólisis entre el diámetro de la colonia. Finalmente, se investigó la producción de sideróforos entre las cepas que mostraron inhibición en contra de al menos uno de los microorganismos indicadores. Esto se realizó en medio AM 2216 suplementado con el reactivo
Chromo Azurol.33 Las cepas se inocularon las
cepas por triplicado y se incubaron a 28 °C por 24 a 72 h. Se consideró que la cepa era productora de sideróforos al observar un halo amarillo o naranja alrededor de la colonia bacteriana.
RESULTADOS
Cuantificación e identificación de los microorganismos El número de bacterias viables recuperadas a partir de la mucosa de los corales estuvieron
en el intervalo de 6.0 × 103 en Xenia sp. a 1.33
× 105 UFC/mL en R. florida. La cuenta viable
de las muestras del coral Fungia sp. fue de 1.0
× 104; para Discosoma sp. fue de 3.08 × 104,
y S. hystrix presentó 3.33 × 104 UFC/mL. En
contraste la cuenta viable en la columna de agua
fue de 2.92×103 UFC/mL. El número bacterias
cultivables presentes en la mucosa externa de los corales fue más grande que en la columna de agua.
Un total de 63 cepas bacterianas fueron recuperadas a partir de las cinco especies de coral, incluyendo 18 cepas de la capa mucosa de R. florida, 12 de Xenia sp., 12 de S. hyxtrix, 13 de Fungia sp. y 8 de Discosoma sp. (Tabla 1 y Figura 1). A partir del análisis de las secuencias del gen 16S rRNA las bacterias aisladas fueron asociadas con miembros de 27 géneros situados dentro de los phyla Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes y Proteobacteria. Dentro de este último phylum la clase Gammaproteobacteria fue predominante (44 aislados, 69.8 %), incluyendo 13 aislados (20.6 %) clasificados en el género Vibrio, 2 (3.2 %) en Photobacterium, 9 (14.3 %) en Alteromonas y 6 (9.5 %) dentro del género Pseudoalteromonas. En la clase Alphaproteobacteria destacan 3 (4.8 %) cepas del género Tropicibacter, 1 de Ruegeria mobilis y 1 de Ponticoccus litoralis. Por otra parte, dentro del phylum Actinobacteria sobresalen dos aislados de la especie Rhodococcus equi, uno de Mycobacterium poriferae, uno de Microbacterium oxydans y uno clasificado dentro del género Streptomyces. Este último aislado fue recuperado en el medio Gause. En el phylum Bacteoridetes se recuperaron cuatro aislados, mientras que en el phylum Firmicutes solo se recuperaron dos. A partir de la muestra proveniente del coral R. florida se aisló el mayor número de especies bacterianas (16 especies y 18 cepas), incluyendo dos aislados (Rf14 y Rf15) que por su secuencia del 16S rRNA representan un nuevo género putativo relacionado con el género Luteibaculum, dentro del phylum Bacteroidetes (esto fue deducido debido a que sus secuencias tuvieron menos del 90 % de similitud con respecto a la secuencia de referencia). Las otras cuatro especies de corales tuvieron entre 7 a 11 especies de bacterias representadas por 8 a 13 aislados.
La mayoría de las especies de bacterias fueron recuperaras a partir de un solo coral, pero algunas pudieron aislarse a partir de diferentes hospederos. Entre ellas destacan los aislados de Alteromonas
macleodii, los cuales se recuperaron a partir de 4 de las especies de coral (excepto de Xenia sp.), Pseudoalteromonas ruthenica se recuperó a partir de 4 corales (excepto de Fungia sp.), y Pseudoalteromonas luteoviolacea que se recuperó a partir de los corales Fungia sp. y Ricordea florida. Caracterización enzimática
Los resultados en la Tabla 1 muestran que 30 de los aislados (47.6 %), los cuales están distribuidos en 17 géneros fueron capaces de reducir nitrato. La hidrólisis de almidón se detectó en 29 (46 %) de los aislados, donde las especies con mayor índice de degradación fueron A. macleodii, P. ruthenica, Microbulbifer epialgicus, M. oxydans, Halomonas arcis, Vibrio tubiashii y Vibrio owensii. La cepa con el mayor índice fue P. ruthenica Sh1, al presentar un valor de 5.5 (Figura. 2 y Tabla 2). Solo 5 aislados mostraron una discreta actividad quitinolítica, mientras que 2 cepas presentaron débil actividad al degradar CMC. Adicionalmente Persicobacter diffluens ShZag mostró actividad agarolítica después de 48 h de incubación.
Fig. 2. Ensayo de inhibición bacteriana realizado con 4 cepas recuperadas a partir de la mucosa del coral S. hystrix. La cepa indicadora empleada en esta prueba fue S. aureus ATCC 25923. 1) P. ruthenica Sh1. 2) R. mobilis Sh2. 3)
Cepa Identidad taxonómica Porcentaje de similitud (%) con la secuencia más cercana del 16S rRNA
calculado con MatGat Hidrólisis de quitina Hidrólisis de almidón Hidrólisis de CMC
Actividad desnitrifi-cante
Aislados de Ricordea florida
Rf1 Alteromonas sp. Alteromonas sp. KU27F1 (97.0) + - -
-Rf2 Pseudoalteromonas ruthenica -97 - + - -Rf3 Idiomarina fontislapidosi -97.3 - - - -Rf5 Ponticoccus litoralis -97.1 - - - + Rf6 Chromohalobacter salexigens -99.6 - - - + Rf7 Vibrio sp. Vibrio sp. JZ08ML52 (95.7) - + - + Rf8 Microbacterium oxydans -97.4 + + - -Rf9 Microbulbifer epialgicus -98.8 - + - + Rf10 Alteromonas macleodii -97.4 - + - -Rf11 Alteromonas macleodii -97.1 - + -
-Rf12 Amphritea sp. Amphritea sp. Ap52 (96.4) - + - +
Rf13 Marinobacter xentospongiae -98.5 - - -
-Rf14 Flavobacteriales bacterium Luteibaculum oceani (84.7) - - -
-Rf15 Flavobacteriales bacterium Luteibaculum oceani (87.3) - - -
-Rf16 Paracoccus marcusii -97.2 - - - +
Rf17 Tropicibacter phthalicus -97.8 - - - +
Rf17-1 Alcanivorax sp. Alcanivorax venustensis (96.1) - - - +
RfVR18 Pseudoalteromonas luteoviolacea -99.5 - + - + Aislados de Xenia sp. X1 Vibrio tubiashii. -99.5 - - - + X3 Staphylococcus epidermidis -98.6 - - - + X4 Vibrio atypicus -98.4 - - - + X5 Vibrio tubiashii -97.5 - - - + X6 Vibrio tubiashii -99.6 - - - + X7 Photobacterium rosenbergii -97.8 - - - + X10 Vibrio nigripulchritudo -97 - + - + X11 Pseudoalteromonas ruthenica -97.2 - + - -X13 Halomonas arcis -98.8 - + - + X14 Spongiibacter marinus -98.5 - - - -X15 Vibrio nigripulchritudo -99.8 - + - +
XLum Photobacterium leiognathi -97.6 - - -
-Aislados de Seriatopora hystrix
Sh1 Pseudoalteromonas ruthenica -99 - + - -Sh2 Ruegeria mobilis -97.4 - - - -Sh3 Alteromonas macleodii -98.3 - + - -Sh4 Spongiibacter marinus -98.2 - - - -Sh5 Alteromonas sp. Alteromonas sp. S89 (97.9) - + - -Sh6 Alteromonas macleodii -97.2 - + - -Sh7 Alteromonas macleodii -98.6 - - - -ShZ1 Tropicibacter multivorans -97.5 - - - -ShZ3 Tropicibacter multivorans -97.7 - - - -ShZ4 Micrococcus luteus -97.3 - - - -ShZ7 Planococcus rifietoensis -97.7 - - -
-ShZAg Persicobacter diffluens -97.1 - - + +
Aislados de Fungia sp.
FunM1 Alteromonas macleodii -97.9 - + -
-FunM2 Halomonas janggokensis. -99.9 - - - +
FunM3 Zunongwangia profunda. -97 - + -
-FunM4 Alteromonas macleodii -99 - - -
-FunM5 Marinomonas sp. Marinomonas pollencensis (94.5) - - - +
FunM6 Alteromonas macleodii -98 - + - +
FunM7 Labrenzia aggregata -98.1 - - - +
FunMAct Streptomyces sp. Streptomyces griseoplanus (96.3) + + +
-Fun1 Vibrio tubiashii -99.6 - + - +
Fun2 Vibrio owensii -99.9 - + - +
Fun3 Alteromonas sp. Alteromonas sp. KU27F1 (97.2) - + -
-Fun4 Aestuariibacter sp. Aestuariibacter halophilus (95.9) - - -
-FunVF5 Pseudoalteromonas luteoviolacea -99.3 - + - +
Aislados de Discosoma sp.
Disc1 Vibrio harveyi -98.6 - + - +
Disc2 Vibrio maritimus -97.1 - + - +
Disc3 Alteromonas macleodii -97.2 - + -
-Disc4 Pseudoalteromonas ruthenica -99.5 - + -
-Disc5 Vibrio sp. Vibrio tubiashii (94.0) - + - +
DiscAct2 Mycobacterium poriferae -99 - - -
-DiscAct3 Rhodococcus equi -97.3 + - - +
DiscAct4 Rhodococcus equi -97.2 + - -
Cepa Identidad taxonómica Degradación de quitina Degradación de almidón Degradación de CMC Aislados de Ricordea florida
Rf1 Alteromonas sp. 1.1 (±0.0) - -Rf2 Pseudoalteromonas ruthenica - 2.5 (±0.12) -Rf7 Vibrio sp. - 1.9 (±0.38) -Rf8 Microbacterium oxydans 1.2 (±0.0) 2.5 (±1.0) -Rf9 Microbulbifer epialgicus - 2.1 (±0.23) -Rf10 Alteromonas macleodii - 2.2 (±0.28) -Rf11 Alteromonas macleodii - 2.3 (±0.0) -Rf12 Amphritea sp. - 1.2 (±0.0) -RfVR18 Pseudoalteromonas luteoviolacea - 1.5 (±0.0) -Aislados de Xenia sp. X10 Vibrio nigripulchritudo - 2.1 (±0.14) -X11 Pseudoalteromonas ruthenica - 2.7 (±0.14) -X13 Halomonas arcis - 2.3 (±0.45) -X15 Vibrio nigripulchritudo - 1.3 (±0.0)
-Aislados de Seriatopora histrix
Sh1 Pseudoalteromonas ruthenica - 5.5 (±0.4)
-Sh3 Alteromonas macleodii - 3.2 (±0.14)
-Sh5 Alteromonas sp. - 1.6 (±0.0)
-Sh6 Alteromonas macleodii - 1.5 (±0.0)
-ShZAg Persicobacter diffluens - - 1.3 (±0.0)
Aislados de Fungia sp.
FunM1 Alteromonas macleodii - 1.5 (±0.0)
-FunM3 Zunongwangia profunda - 2.0 (±0.0)
-FunM6 Alteromonas macleodii - 1.7 (±0.0)
-FunMAct Streptomyces sp. 1.1 (±0.0) 1.1 (±0.0) 1.3 (±0.0)
Fun1 Vibrio tubiashii - 3.1 (±0.18)
-Fun2 Vibrio owensii - 3.3 (±0.58)
-Fun3 Alteromonas sp. - 1.2 (±0.0)
-FunVF5 Pseudoalteromonas luteoviolacea - 1.2 (±0.0)
-Aislados de Discosoma sp.
Disc1 Vibrio harveyi - 2.8 (±0.49)
-Disc2 Vibrio maritimus - 3.0 (±0.2)
-Disc3 Alteromonas macleodii - 1.7 (±0.23)
-Disc4 Pseudoalteromonas ruthenica - 3.6 (±1.24)
-Disc5 Vibrio sp. - 3.2 (±0.0)
-DiscAct3 Rhodococcus equi 1.1 (±0.0) -
-DiscAct4 Rhodococcus equi 1.1 (±0.0) -
-Tabla 2. Índices degradativos desarrollados por los microorganismos aislados a partir de los corales. Lo valores entre paréntesis corresponden a la desviación estándar de los índices de degradación.
Actividad inhibidora de los aislados
Entre los 63 aislados, 14 (22 %) mostró inhibición en contra de una o más bacterias indicadoras, aunque ninguna inhibió a C. albicans ATCC 10231 (Tabla 3). Una amplia actividad inhibidora fue observada en los aislados Rf2, X11, Sh1 y Disc4 de P. ruthenica, los cuales inhibieron 6 de las 7 bacterias indicadoras, incluyendo los patógenos humanos S. aureus ATCC. 25923 y los patógenos de especies acuáticas A. bestiarum D12 y V. fortis VSP. Por otro lado, los aislados R. mobilis Sh2 y M. oxydans Rf8 inhibieron a 3 de las 7 bacterias. Finalmente los aislados Tropicibacter phtalicus Rf17, Photobacterium leiognathi XLum, P. litoralis Rf5 y Vibrio maritimus Disc2 inhibieron solamente una de las bacterias indicadoras.
Es importante mencionar que la bacteria indicadora P. aeruginosa ECOM2 fue inhibida solamente por P. luteoviolacea RfVR18. En contraste, K. rhizophila ECOM1 fue inhibida por 12 de las cepas probadas. No se observó actividad antimicrobiana en los ensayos con caldo de cultivo libre de células o en los extractos obtenidos con acetato de etilo. Exceptuando a los dos aislados de P. luteoviolacea, el resto de las bacterias con actividad inhibitoria presentaron una discreta producción de sideróforos, con índices no mayores a 1.5 (datos no mostrados).
DISCUSIÓN
La microbiota bacteriana cultivable de diversas especies de coral ha sido estudiada en años
recientes en ambientes naturales,7,18,28,34,35,36,37
sin embargo el conocimiento sobre los microorganismos cultivables presentes en corales mantenidos en sistemas cerrados es
escaso.17 En el presente estudio reportamos
63 aislados bacterianos recuperados a partir de la mucosa superficial de cinco especies de
coral propagadas y mantenidas ex situ, lo cual proporciona información novedosa acerca de las interacciones entre corales y bacterias en sistemas artificiales, al mismo tiempo que se exploró su potencial como fuente de enzimas y posible fuente de compuestos con actividad antimicrobiana, por lo que podrían emplearse como probióticos en la acuacultura e industria de los acuarios marinos. El gran número de bacterias cultivables presentes en la mucosa externa de los corales, comparado con el número de bacterias en la columna de agua se atribuye a la presencia de polisacáridos, proteínas, lípidos y otros nutrientes secretados por los corales.18,28,37
En la literatura se ha descrito que la mucosa externa de los corales puede presentar una concentración de carbono y nitrógeno 2 a 4 veces
más alta que el agua circundante,38 por lo que
estos nutrientes permitirían el desarrollo de un gran número de bacterias capaces de formar una compleja biopelícula, donde los microorganismos desarrollan diversas actividades como la fijación
de nitrógeno,4 brindan protección a su hospedero
a través de la producción de metabolitos con actividad antimicrobiana e inhiben la
colonización de microorganismos patógenos.7,9,34
La identificación de las 63 cepas aisladas genera invaluable información acerca de las comunidades bacterias presentes en la mucosa de corales mantenidos en un ambiente cerrado y artificial. La predominancia de bacterias de la clase Gammaproteobacteria fue similar a la observada
en la mucosa de corales como Fungia scutaria,18
Mussismilia hispida,40 Acropora millepora,34
corales de la familia Pennatulidae,28 entre otros.
En contraste, es importante mencionar que en otras especies de corales los grupos dominantes cultivables fueron miembros del phylum Firmicutes, siendo Bacillus el género más abundante en corales
del orden Alcyonacea como Alcyonium digitatum36
Tabla 3. Índices de inhibición desarrollados por de las bacterias aisladas a partir de la mucosa de los corales. Coral hospedero Cepa Staphylococcus aureus ATCC 25923 Kocuria rhizophila ECOM1 Pseudomonas aeruginosa ECOM2 Escherichia coli ECOM3 Serratia marcescens DZM Aeromonas bestiarum D12 Vibrio fortis VSP Candida albicans ATCC 10231 R. florida Alteromonas sp. Rf1 - 2.2±0.34 - - - - Pseudoalter-omonas rutheni-ca Rf2 2.3±0.25 5.0±0.0 - 2.38±0.19 2.32±0.13 1.65±0.05 1.93±0.11 -Ponticoccus litoralis Rf5 - - - - 2.44±0.19 - - -Microbacterium oxydans Rf8 2.36±0.26 5.0±0.0 - 2.15±0.01 - - - -Tropicibacter phthalicus Rf17 - 2.2±0.34 - - - - Pseudoal-teromonas luteoviolacea Rf VR18 2.0±0.0 - 1.19±0.05 - - - - -Xenia sp. Pseudoalter-omonas rutheni-ca X11 2.16±0.28 5.44±0.76 - 1.21±0.1 2.83±0.28 2.36±0.22 2.0±0.0 - Photobacteri-um leiognathi XLum - 1.16±0.0 - - -
-S. hystrix Pseudoalter-omonas
rutheni-ca Sh1 2.55±0.09 5.0±0.0 - 2.33±0.28 2.5±0.0 2.64±0.27 1.11±0.0 -Ruegeria mobil-is Sh2 - 2.38±0.09 - 1.5±0.11 1.88±0.19 - - -Fungia sp. Streptomyces sp. FunMAct - 2.33±0.0 - - - - Pseudoal-teromonas luteoviolacea Fun VF5 - 1.2±0.0 - - - -
Discoso-ma sp. Vibrio mariti-mus Disc2 - 1.41±0.14 - - -
- Pseudoalter-omonas rutheni-ca Disc4
-negros del género Antipathes.42 Esto podría
ser efecto de la composición particular de las comunidades microbianas que albergan estas especies de coral, aunque también podría estar influenciado por los medios de cultivo empleados durante el aislamiento. En este trabajo la mayoría de los aislados corresponden a géneros clasificados dentro del phylum Proteobacteria, (Figura 1) siendo los géneros Alteromonas, Pseudoalteromonas y Vibrio los que englobaron al mayor número de cepas.
Estos microorganismos han sido caracterizados en otros trabajos como parte de la microbiota de la mucosa externa de los corales. A. macleodii es un microorganismo capaz de consumir diversos compuestos orgánicos en la mucosa de
los corales,38 mientras que algunas especies de
Pseudoalteromonas han sido identificadas como productoras de compuestos antibacterianos,
toxinas y enzimas de interés biotecnológico.8,43,44
Por otra parte, los miembros del género Vibrio son ubicuos en ambientes marinos y pueden desarrollar actividades benéficas y negativas al interactuar con corales y otros invertebrados. Entre los aislados destaca V. owensii (cepa Fun2), un patógeno que ha causado brotes infecciosos y alta mortalidad de
corales silvestres del género Montipora.45. También
destaca Vibrio nigripulchritudo (aislados X10 y X15), el cual es un patógeno que produce pérdidas
en granjas camaroneras.46
En contraste, Vibrio harveyi (cepa Disc1) ha sido identificado como un microorganismo fijador
de nitrógeno asociado a corales,40 y también
como patógeno cuando forma consorcios con
otras especies de Vibrio.47 El género Ruegeria
se caracteriza por englobar diversas especies de bacterias productoras de metabolitos secundarios con actividad antagónica en contra de microorganismos patógenos para ciertas especies de peces, por lo cual tienen potencial como microorganismos probióticos para la industria
acuícola.48 En el phylum Actinobacteria destaca
el aislamiento de la cepa de Streptomyces sp. FunMAct, la cual desarrolló inhibición contra una de las cepas indicadoras. La búsqueda de Actinomicetos asociados a corales y otros invertebrados se ha visto favorecida en los últimos años debido a que pueden sintetizar un gran número
de metabolitos con actividad antimicrobiana.35
Entre los corales empleados en este trabajo, los
del género Fungia han sido los más estudiados
en acuarios y ambientes naturales. Este género se encuentra distribuido en amplias regiones
de los océanos Índico y Pacífico.49 Debido a su
atractivo, es popular entre los aficionados a los acuarios marinos. Es notable que a partir de su mucosa se recuperaron cepas de A. macleodii, V. tubiashii, V. owensii y género Marinomonas, todos ellos aislados previamente en diversas especies
de Fungia colectadas en el mar.18,38,50 Nuestros
resultados sugieren que Fungia podría conservar diversas especies de su microbiota nativa en condiciones de cautiverio. Por otro lado, S. hystrix es un importante coral constructor de arrecifes, el cual está ampliamente distribuido en el océano Pacífico.19 Por su rápido crecimiento en cautiverio,
la especie ha sido empleada como un organismo modelo en el estudio del ciclo de vida de los corales
que depositan CaCO3 al formar su esqueleto.51
En la literatura existe un reporte donde se analizó mediante métodos moleculares la microbiota de esta especie, y se observó que los grupos dominantes estaban agrupados dentro de las
clases Alpha y Gammaproteobacteria.52 En el
presente trabajo la mayoría de aislados fueron del género Vibrio, así como también se recuperaron cepas de P. rhuthenica y P. leiognathi que mostraron actividad antimicrobiana (Tabla 3). Por otro lado, los corales del género Xenia además de que hasta hace poco tenía cierta demanda dentro de la industria de los acuarios marinos, son una importante fuente de moléculas con actividad
anticancerígena;53 en cambio su microbiota ha
sido pobremente estudiada. Existe el reporte de una cepa de Stenotrophomonas aislada a partir de Xenia, la cual presentó actividad antimicrobiana.7
Hasta donde sabemos, este el primer estudio referente a la microbiota cultivable de R. florida, y Discosoma sp., ambos clasificados dentro del orden Corallimorpharia. R. florida es endémica del Mar
Caribe,54 mientras que el género Discosoma está
ampliamente distribuido en los Océanos Atlántico,
Índico y Pacífico.19 Además de su importancia
dentro de la industria de los acuarios marinos, estos corales representan una fuente de proteínas fluorescentes con aplicaciones biomédicas y
biotecnológicas.55 Los resultados de este estudio
mostraron que ambas especies comparten especies como A. macleodii y P. ruthenica. En cuanto al número de especies, R. florida tuvo 16, mientras que Discosoma presentó 7 (Tabla 1).
La detección de cepas capaces de degradar almidón, quitina, y CMC indica que los microorganismos obtenidos a partir de los corales estudiados representan una fuente de enzimas hidrolíticas con una potencial aplicación biotecnológica, y contribuye a confirmar la creciente importancia de las bacterias marinas como fuente de novedosas
enzimas.56 Se observó que entre los 29 aislados
que mostraron actividad amilolítica (Tabla 2), los que presentaron un mayor índice de degradación fueron P. ruthenica, A. macleodii y diversas especies de Vibrio. En la literatura se ha descrito la caracterización y expresión heteróloga de la amilasa de una cepa de A. macleodii, cuya estabilidad térmica y halotolerancia la vuelve
prometedora para su uso en bioprocesos.57
Por otro lado, la habilidad para reducir nitrato en nitritos observada en 30 de las cepas tiene importancia como posible mecanismo de respiración anóxica durante las fluctuaciones de oxígeno que ocurren en la mucosa externa
de los corales. Al mismo tiempo este proceso de desnitrificación ha sido planteado como un mecanismo que controla la concentración del nitrógeno biodisponible.
Se ha documentado que estas bacterias transforman el nitrato en amonio, el cual puede ser aprovechado por las microalgas zooxantelas simbiontes del coral. Por otro lado, cuando existe un exceso de nitrógeno, estas bacterias pueden realizar la desnitrificación completa
hasta nitrógeno molecular.5 Debido a esto, las
bacterias marinas desnitrificantes ha cobrado importancia biotecnológica tanto en acuarios marinos particulares como en sistemas de crianza a gran escala, en donde se promueve su crecimiento agregando fuentes de carbono como alcoholes y carbohidratos simples para fomentar proliferación, o se inoculan cepas seleccionadas para que se incorporen al filtro biológico encargado de regular la cantidad de nitrógeno
presente en los sistemas cerrados.58
En este estudio se observó que las especies P. ruthenica, A. macleodii y V. tubiashii estaban presentes en dos o más especies de coral, lo cual podría deberse a que estas bacterias forman parte del microbioma central de estos organismos, los cuales han sido transferidos a lo largo de generaciones. Otra posibilidad es que las bacterias recientemente han migrado y colonizado a otros hospederos como consecuencia de su vida en cautiverio dentro de un sistema cerrado. Para aclarar esto, se requiere un estudio más exhaustivo, donde se pueda comparar la microbiota de estas mismas especies de coral recolectadas en su hábitat natural.
Considerando el impacto negativo que las actividades humanas han provocado a los arrecifes de coral, ha sido necesario documentar y comprender las interacciones benéficas entre microorganismos y sus corales hospederos, esto con la finalidad de mitigarlas o revertirlas. Al
mismo tiempo, la evolución de cepas bacterianas de importancia clínica resistentes a diversos antibióticos ha provocado la búsqueda de compuestos antimicrobianos en ambientes
marinos.12,36 Diversas investigaciones han
documentado la actividad antimicrobiana por
parte de la microbiota de los corales, 7,17,28,34 al
mismo tiempo que se ha propuesto inocular cepas nativas con actividad probiótica en los arrecifes
afectados por enfermedades bacterianas.59
En el presente estudio se encontró que 14 cepas presentaron actividad antibacteriana contra al menos una de las bacterias indicadoras. Es remarcable que los aislados de P. ruthenica tuvieron los mayores índices de inhibición en contra de las bacterias indicadoras, así como también es importante destacar que P. luteoviolacea RfVR18 fue el único aislado capaz de inhibir a P. aeruginosa ECOM2. Al respecto, los miembros del género Pseudoalteromonas han sido previamente
reconocidos por sus actividades antimicrobianas,8.43
y por formar parte de la microbiota de numerosas
especies de invertebrados marinos.60 Así mismo,
P. luteoviolacea ha sido una de las especies más estudiadas del género debido a que puede producir numerosos compuestos con actividad antimicrobiana.61 En cuanto a la especificidad de la
inhibición microbiana, se observó que los 4 aislados de P. ruthenica, P. litoralis Rf5 y R. mobilis Sh2 inhibieron a S. marcescens DZM (Tabla 3). Esta observación es importante, ya que diversas cepas de S. marcescens han sido reportadas como agentes causales de la enfermedad “White-pox” o viruela blanca, una agresiva enfermedad que provoca la muerte masiva de corales alrededor del
mundo.62 Así mismo, los aislados de P. ruthenica
presentaron antagonismos contra A. bestiarum D12 y V. fortis VSP. Estos microorganismos se emplearon en este trabajo ya que han sido identificados como microorganismos patógenos
de peces.63,64 Para combatir a estos bacterias
patógenas tanto en sistemas cerrados como en el océano, se ha sugerido el empleo de microorganismos probiticos, aislados a partir de sus hospederos naturales y que tengan actividad
antimicrobiana comprobable,59 sobre todo en
aquellas cepas donde los metabolitos producidos sean difíciles de aislar e identificar, tal como ocurrió con las 14 cepas de este trabajo los cuales presentaron actividad antimicrobiana en cultivo activo, mientras que en los caldos de cultivo libres de células y en los extractos orgánicos no se observó actividad antimicrobiana.
Es posible que los metabolitos responsables estén unidos a la estructura celular tal
como lo sugieren algunos autores,7,28 o que
se encuentren localizados al interior de las células bacterianas. En una investigación
previa61 se encontró la enzima L-aminoácido
oxidasa en extractos obtenidos por sonicación de células de P. luteoviolacea. El producto de la reacción catalizada por esta enzima fue peróxido de hidrógeno, el cual presenta actividad antimicrobiana. Es importante mencionar que P. luteoviolacea presenta vistosas colonias debido a la presencia de violaceína, un compuesto color violeta poco soluble en agua que se acumula en el lado interno de las membranas celulares y que ha
demostrado tener actividad antimicrobiana.65.
Otra posibilidad que explica la ausencia de actividad microbiana en los ensayos con extractos es que la síntesis de los metabolitos es inducida solamente en presencia de bacterias antagónicas, o que los compuestos son en
extremo volátiles y lábiles.43 Por lo tanto sería
necesario optimizar las condiciones para la producción y extracción de los compuestos. Recientemente, se han planteado estrategias como la minería genética para la búsqueda rápida de los genes que intervienen en la síntesis
Finalmente, es importante mencionar que algunos compuestos son sintetizados en muy baja concentración pero pueden inhibir el crecimiento de bacterias patógenas a través del secuestro de nutrientes claves como el hierro. En el presente estudio observamos la producción de sideróforos en 12 de las cepas con actividad antagónica. La síntesis de sideróforos por bacterias benéficas es una característica deseable que puede ayudar a la prevención y control de
patógenos en sistemas de crianza acuícola,67 por
lo que algunas de las cepas recuperadas en este trabajo tendrían potencial para ser empleadas como probióticos. Por supuesto, sería necesaria una mayor investigación al respecto.
CONCLUSIONES
El presente trabajo permitió realizar el estudio prospectivo de las bacterias cultivables asociadas a 5 especies de coral propagadas y mantenidas en cautiverio. Nuestros resultados revelaron la presencia de diversos grupos bacterianos capaces de desarrollar actividad antimicrobiana contra bacterias indicadoras de importancia biomédica. Los microorganismos que presentaron esta actividad pertenecen a los géneros Pseudoalteromonas, Alteromonas, Vibrio, Photobacterium, Ruegeria, Tropicibacter, Ponticoccus y Streptomyces. Diversos aislados desarrollaron actividades exo-enzimáticas, siendo la más interesante la actividad amilolítica.
Los resultados de este trabajo contribuyen al conocimiento de las bacterias asociadas al coral y sus posibles roles ecológicos en especies de coral escasamente estudiadas. Al mismo tiempo estos resultados inspiran a la realización de futuros estudios con el objetivo de buscar aplicaciones biotecnológicas de estos microorganismos, tales como la obtención de enzimas y probióticos. De manera similar a los corales obtenidos de ambientes naturales
los corales mantenidos y reproducidos en cautiverio también son una importante fuente de recursos biotecnológicos.
FINANCIACIÓN Y AGRADECIMIENTOS
Los autores desean agradecer a los profesores de los laboratorios de Ecología Microbiana y Micología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional por proporcionar las bacterias indicadoras S. aureus ATCC 25923, K. rhizophila ECOM1, Pseudomonas aeruginosa ECOM2, E. coli ECOM3 y la levadura C. albicans ATCC 10231 empleadas en las pruebas de inhibición. Durante el desarrollo de este trabajo S.E.J. recibió beca doctoral por parte del CONACyT (beca 230841).
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