UNIVERSIDAD REGIONAL AUTÓNOMA DE LOS ANDES UNIANDES
FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS
PROGRAMA DE MAESTRÍA EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL GRADO ACADÉMICO DE MAGÍSTER EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA
TEMA:
EFECTO IN VITRO DEL ACEITE ESENCIAL Y EXTRACTO ETANOLICO DE MANDARINA CITRUSRETICULATA FRENTE A STREPTOCOCCUS
MUTANS
AUTORA: BQF. SILVA LALANGUI VERONICA CONSUELO ASESORES: DR. VITERI RODRIGUEZ JUAN ALBERTO, MSC ING. OÑA CISNEROS FABIAN DAVID, MSC PHD (C)
APROBACIÓN DE LOS ASESORES DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
CERTIFICACIÓN:
Quien suscribe, legalmente CERTIFICA QUE: El presente Trabajo de Titulación realizado por la BQF. Verónica Consuelo Silva Lalangui, Maestrante del Programa de Maestría en Farmacia Clínica y Hospitalaria, Facultad de Ciencias Médicas, con el tema “EFECTO IN VITRO DEL ACEITE ESENCIAL Y EXTRACTO ETANOLICO DE MANDARINA CITRUS RETICULATA FRENTE A STREPTOCOCCUS MUTANS ”, ha sido prolijamente revisado, y cumple con todos los requisitos establecidos en la normativa pertinente de la Universidad Regional Autónoma de los Andes -UNIANDES-, por lo que apruebe su presentación.
Ambato, Mayo del 2018
DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD
Yo, Verónica Consuelo Silva Lalangui, maestrante del Programa de Maestría de Farmacia Clínica y Hospitalaria, Facultad de Ciencias Médicas, declaro que todos los resultados obtenidos en el presente trabajo de investigación, previo a la obtención del Grado Académico de MAGÍSTER EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA, son absolutamente originales, auténticos y personales; a excepción de las citas, por lo que son de mi exclusiva responsabilidad.
Ambato, Mayo 2018
______________________________ BQF. Verónica Consuelo Silva Lalangui CI. 0705043180
DERECHOS DE LA AUTORA
Yo, Verónica Consuelo Silva Lalangui, declaro que conozco y acepto la disposición constante en el literal d) del Art. 85 del Estatuto de la Universidad Regional Autónoma de los Andes, que en su parte pertinente dice: El patrimonio de la UNIANDES está constituido por: La propiedad intelectual sobre las Investigaciones, trabajos científicos o técnicos, proyectos profesionales y consultoría que se realicen en la Universidad o por cuenta de ella.
Ambato, Mayo 2018
BQF. Verónica Consuelo Silva Lalangui CI. 0705043180
DEDICATORIA
Este logro le dedico en primer lugar a Dios por darme la fortaleza necesaria para culminar esta meta propuesta en la vida.
A mis padres Ida y Luis, quienes con su paciencia han sabido enseñarme que con constancia, honestidad y sacrificio se pueden alcanzar todos los objetivos y metas que uno se propone, a ellos con profundo agradecimiento y amor todos mis logros.
A mis hermanas Elizabeth, Paola y María de los Ángeles por darme su apoyo incondicional y a mi novio Miguel que fueron mis ayudantes idóneos ya que gracias a ellos y su empuje pude terminar la maestría que tanto soñé, gracias por su paciencia, sacrificio y amor, y por estar en el momento que más necesite.
A mis abuelitos que supieron darme la fuerza necesaria para continuar adelante y regalarles este triunfo a ellos gracias de corazón, a mis maestros por la paciencia y comprensión ante situaciones ajenas a mi voluntad de corazón gracias.
A todos ustedes con infinito amor este logro más en la vida. Los amo mucho.
AGRADECIMIENTO
Agradezco a Dios quien me guio y dio la fortaleza para seguir adelante y permitirme llegar a este momento tan especial en mi vida. A mi familia, por brindarme su apoyo, confianza y comprensión en cada momento de mi formación. A los asesores por las orientaciones y aportes brindados en el desarrollo de la presente investigación.
A mi grupo de estudio con el que empecé y termine mi carrera, que de una u otra forma me brindaron su amistad su apoyo y que a pesar de todo lo que pasamos nunca dejaron de ser mis amigos los llevo por siempre en mi corazón porque son únicos y originales Valeria, Elizabeth y Mariuxi.
A la Universidad Regional Autónoma de los Andes, por la formación sustentada en valores y énfasis en la investigación.
A todos
Gracias
INDICE GENERAL
PORTADA
APROBACIÓN DE LOS ASESORES DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD
DERECHOS DE LA AUTORA
DEDICATORIA
AGRADECIMIENTO
INDICE GENERAL
ÍNDICE DE TABLAS
ÍNDICE DE GRÁFICOS
ÍNDICE DE ILUSTRACION
RESUMEN
ABSTRACT
INTRODUCCIÓN ... 1
Antecedentes de la investigación ... 1
Planteamiento del problema... 3
Formulación del problema ... 4
Delimitación del problema ... 4
Objeto de investigación ... 5
Campo de acción ... 5
Objetivo general ... 5
Objetivos específicos ... 5
Hipótesis ... 6
JUSTIFICACION DEL TEMA ... 6
METODOLOGIA ... 7
RESUMEN DE LA ESTRUCTURA DE LA TESIS ... 7
APORTE TEÓRICO ... 8
SIGNIFICACIÓN PRÁCTICA ... 8
NOVEDAD CIENTIFICA ... 8
CAPITULO I. ... 9
MARCO TEÓRICO ... 9
1.- MANDARINA Citrus reticulata ... 9
1.1.- Mandarina Historicidad ... 9
1.1.1.- Distribución geográfica... 9
1.1.2.- Taxonomía y Morfología ... 10
1.1.3.- Usos Medicinales ... 11
1.1.4.- Composición química del Aceite esencial de mandarina Citrus reticulata. 11 1.2.3.- Tamizaje fitoquímico de la cascara y semilla de la mandarina ... 12
1.2.- Enfermedades Dentales y Bucales ... 17
1.2.1.- Definición ... 17
1.2.1.2.- Caries ... 18
1.2.1.3.- Agentes etiológicos ... 18
1.2.1.4.- Endógenas ... 19
1.2.1.5.- Exógenas ... 19
1.2.2.- Microorganismos ... 20
1.2.2.1.- Streptococcus mutans ... 20
1.2.2.2.- Morfología ... 20
1.2.2.3.- Metabolismo ... 21
1.2.2.4.- Reproducción ... 24
1.2.2.5.- Clasificación del Streptococcus mutans ... 24
1.2.3.- Transmisión, colonización y estabilidad de Streptococcus mutans en cavidad oral ... 25
1.2.3.1.- Patogenicidad ... 25
1.2.3.2.- Mecanismo de Resistencia Antimicrobiana ... 26
1.2.3.3.- Resistencia Antimicrobiana del Streptococcus mutans ... 26
1.2.4.- Actividad Antimicrobiana ... 26
1.2.4.1.- Actividad antimicrobiana de los aceites esenciales ... 27
1.2.4.2.- Cepas de Control ... 27
1.3.- Métodos de extracción en fitoquímica ... 28
1.3.1.- Extracción sólido-líquido ... 28
1.3.2.- Maceración ... 29
1.3.4.- Extracción líquido-líquido ... 29
1.4.- CONCLUSIONES DEL CAPITULO ... 30
CAPITULO II ... 31
MARCO METODOLÓGICO Y PLANTEAMIENTO DE LA PROPUESTA ... 31
2.- Caracterización del sector ... 31
2.1.- Descripción del procedimiento metodológico ... 31
2.1.1.- Etapa I: Estudio etnofarmacológico ... 31
2.2.- Universo y muestra ... 32
2.2.1.- Etapa II: Obtención del extracto etanólico y aceite esencial ... 33
2.2.2.- Caracterización Botánica ... 33
2.2.3.- Pruebas analíticas ... 34
2.2.4.- Humedad ... 34
2.2.5.- Cenizas totales ... 35
2.2.5.1.- Cenizas Totales en Agua ... 35
2.2.5.2.- Cenizas Totales en Ácido Clorhídrico. ... 35
2.3.- Etapa III: Pruebas microbiológicas ... 36
2.4.- CONCLUSIONES DEL CAPITULO ... 39
CAPITULO III. ... 40
MARCO PROPOSITIVO ... 40
3.- ANÁLISIS DE RESULTADOS DE LA INVESTIGACIÓN ... 40
3.2.- Parámetros Físico-químicos de la cáscara de mandarina ... 54
3.3.- Análisis estadístico ANOVA ... 60
3.4.- CONCLUSIONES DEL CAPITULO ... 67
CONCLUSIONES GENERALES: ... 68
RECOMENDACIONES ... 69
BIBLIOGRAFÍA
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Composición del aceite esencial de mandarina. ... 12
Tabla 2 Resultados de las pruebas químicas preliminares realizadas al extracto de la cascara de mandarina y semilla de mandarina. ... 13
Tabla 3 Diluciones de Extracto etanólico de cáscara de mandarina ... 37
Tabla 4 Conoce alguna planta medicinal ... 41
Tabla 5 Plantas utilizadas con fines medicinales ... 41
Tabla 6 Nivel de uso significativo de las plantas utilizadas con fines medicinales de la encuesta etnofarmacológica. ... 44
Tabla 7 Indicación de la planta o fruto ... 45
Tabla 8 Índice del nivel de uso de las plantas utilizadas ... 46
Tabla 9 Personas quienes sugirieron el uso de plantas medicinales a las encuestadas. ... 47
Tabla 10 Forma en que se ha utilizado las plantas. ... 48
Tabla 11 Parte de la planta empleada para la preparación ... 49
Tabla 12 Estudio etnofarmacológico de las plantas medicinales Guayaquil, sector Prosperina ... 50
Tabla 13 Parámetros Físico-químicos de la cáscara de mandarina ... 54
Tabla 14 Promedios de halos de inhibición de aceite esencial Citrus reticulata frente a Streptococcus mutans... 56
Tabla 15 Frecuencia del promedio de Halos de inhibición del aceite esencial de Citrus reticulata. ... 57
Tabla 16 Promedios de halos de inhibición con el extracto etanólico frente a Streptococcus mutans. ... 58
Tabla 17 Frecuencia del promedio de Halos de inhibición del extracto alcohólico de Citrus reticulata ... 59
Tabla 18 Análisis de la varianza del aceite esencial ... 61
Tabla 19 Análisis del factor de dilución del aceite esencial ... 63
Tabla 20 Análisis del coeficiente estandarizado del extracto etanólico ... 64
ÍNDICE DE GRÁFICOS
Gráfico 1 Conoce alguna planta medicinal ... 41
Gráfico 2 Plantas con uso medicinal sector Prosperina Guayaquil ... 42
Gráfico 3 Personas que le sugirieron el uso de plantas medicinales. ... 47
Gráfico 4 Modo de uso de las plantas ... 48
Gráfico 5 Frecuencia del halo con aceite esencial Citrus reticulata ... 58
Gráfico 6 Frecuencia del extracto etanólico de mandarina Citrus reticulata .... 60
Gráfico 7 Coeficiente estandarizado del aceite esencial ... 62
Gráfico 8 Factor de dilución del aceite esencial ... 63
Gráfico 9 Coeficiente estandarizado del extracto etanólico ... 65
Gráfico 10 Factor de dilución del extracto etanólico ... 66
ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1 La Prosperina, Guayaquil, Ecuador ... 5
RESUMEN
Según la Organización Mundial de la Salud la medicina tradicional es la suma total de conocimientos, habilidades y experiencias; basada en teorías y creencias indígenas que han sido utilizadas para el buen mantenimiento de la salud.
Esta investigación se basó en 3 aspectos:
Estudio etnofarmacológico, donde se obtuvo para la mandarina (Citrus reticulata) un nivel de uso significativo del 47% e índice de valor de uso de 0.03 por lo que se considera aceptable desde el punto de vista cultural.
Dentro del estudio fitoquímico de la mandarina se estableció que los aceites esenciales son ricos en beta-pineno y limoneno, mientras que el extracto etanólico en compuestos polifenólicos y flavonoides.
La actividad antimicrobiana del aceite esencial y extracto etanólico de la mandarina en concentraciones de 25%, 50%, 75% y 100% fue probada sobre Streptococcus mutans a través de la técnica de difusión en disco por triplicado, mostrando un espectro amplio de actividad al 100%, con un promedio de halo inhibitorio de 11.11 mm del aceite esencial y 10.90 mm del extracto etanólico.
Según la escala de Duraffourd se obtuvo sensibilidad límite del aceite y extracto de la mandarina; para la estadística se realizó ANOVA, determinando diferencias significativas entre los valores promedio de los halos de inhibición, con un valor de P= ˂0.0001 para el extracto y el aceite esencial, por lo tanto se rechaza la no existencia de actividad antimicrobiana.
ABSTRACT
According to the World Health Organization, traditional medicine is the total sum of knowledge, skills and experiences that are based on indigenous theories and beliefs, which have been used for good health maintenance among communities.
This research proposes three phases:
Ethnopharmacological study, where a significant 47% usage level was obtained regarding tangerine (Citrus reticulata). Moreover, a usage value index of 0.03 was obtained, which is considered acceptable from the cultural point of view.
Tangerine essential oils are rich in beta-pinene and limonene, while the ethanolic extract is rich in polyphenolic and flavonoid compounds.
The antimicrobial activity of tangerine essential oil and ethanolic extract in concentrations of 25%, 50%, 75% and 100% was tested on Streptococcus mutans through triplicate disk diffusion. This showed a broad spectrum of activity at 100%, with an average inhibitory halo of 11.11 mm for the essential oil and 10.90 mm for the ethanolic extract.
According to the Duraffourd scale, limit sensitivity was obtained for oil and tangerine extract. ANOVA was performed, determining significant differences between the average values of the inhibition halos, with a value of P = <0.0001 for the extract and the essential oil. Hence, the absence of antimicrobial activity is rejected.
INTRODUCCIÓN
Antecedentes de la investigación
De acuerdo a la Organización Mundial de la Salud (OMS), la Medicina Tradicional y Complementaria (MTC) es una parte importante y con frecuencia subestimada de la atención de salud. Se la practica en casi todos los países del mundo, y la demanda va en aumento. La medicina tradicional de calidad, seguridad y eficacia comprobadas contribuye a asegurar el acceso de todas las personas a la atención de salud. Varios países reconocen actualmente la necesidad de elaborar un enfoque coherente e integral de atención de salud que facilite a los gobiernos, profesionales sanitarios y usuarios el acceso a la MTC de manera segura, respetuosa, asequible y efectiva. Una estrategia mundial destinada a promover la integración, reglamentación y supervisión apropiadas de la MTC será de utilidad para los países que desean desarrollar políticas dinámicas relativas a su uso(1).
La subsistencia del ser humano depende del acervo de conocimientos sobre las especies, resultado de su íntimo contacto con plantas y animales (2). Como destacan a partir de datos de la Organización Mundial de la Salud (OMS) (3) y la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación (FAO) más de dos tercios de la población mundial utilizan plantas medicinales para atender sus dolencias psicofísicas. Sin embargo, gran proporción de las plantas medicinales se encuentra en riesgo de extinción, afectadas por procesos de pérdida de recursos en sus poblaciones naturales (4).
Las plantas son una importante fuente de productos biológicamente activos, varios de los cuales han servido como modelo para la síntesis de un gran grupo de fármacos, mundialmente se estima que cerca del 25 % de todos los medicamentos modernos son derivados de plantas medicinales (5).
estudios han demostrado una significativa reducción del riesgo de desarrollo de
enfermedades crónicas, por ejemplo el cáncer, enfermedades
cardiovasculares, diabetes y Alzheimer asociada al consumo de frutas y vegetales (9).
Por este motivo, se plantea el uso alternativo de alimentos que contengan antibacterianos naturales, considerándose como opción la mandarina (Citrus reticulata), de la cual se ha reportado características antifúngicas, antimicrobianas y fitoterapéuticas, las cuales hacen de esta una especie promisoria para su uso en actividades farmacéuticas, control de plagas en el sector agrícola y la preservación de los alimentos evitando la proliferación de microorganismos causantes de enfermedades (10). Existe una gran variedad de reportes en los cuales se utilizan diferentes vegetales como preservantes de alimentos (11).
Existen varios estudios sobre el efecto antimicrobiano del aceite esencial y el extracto etanólico obtenidos de la mandarina Citrus reticulata en distintos microorganismos, entre ellos los siguientes:
Según un estudio cuyo objetivo fue la determinación de la concentración mínima inhibitoria y concentración mínima bactericida del aceite esencial de Citrus reticulata variedad satsuma (mandarina), en el crecimiento de Pseudomonas aeruginosa y de Staphylococcus aureus consigna como resultado una concentración mínima inhibitoria de 7% para Staphylococcus aureus y 15% para Pseudomona aeruginosa. El aceite esencial de Citrus reticulata variedad Satsuma mandarina resultó ser más eficaz contar cultivos de Staphylococcus aureus que contra los cultivos de Pseudomonas aeruginosa (12).
En el desarrollo de un antimicrobiano se requiere de ensayos preclínicos y clínicos, dentro de los primeros, se distinguen dos grupos encaminados a investigar diferentes efectos del compuesto: ensayos toxicológicos y estudios de actividad, para asegurar una eficacia demostrada in vitro (13).
medicinas alternativas como los fitofármacos que ayuden a combatir microrganismos patógenos (14).
Según los antes mencionado se realizará los principales objetivos del presente estudio: (i) extraer el aceite esencial de la mandarina Citrus reticulata por destilación por arrastre de vapor y preparar su extracto etanólico (ii) evaluar la actividad antimicrobiana del aceite esencial de mandarina Citrus reticulata en Streptococcus mutans y (iii) evaluar la actividad antimicrobiana del extracto etanólico de mandarina en Streptococcus mutans.
Planteamiento del problema
La OMS estima que gran parte de la población de países en desarrollo con bajo acceso a medicina moderna dependen exclusivamente de plantas medicinales y prácticas tradicionales en los cuidados básicos de la salud. La Asamblea Mundial de la Salud urge a los países miembros, que con motivo de evaluar el sistema tradicional de salud, se elabore un listado de plantas que puedan ser incorporadas en las Farmacopeas Nacionales, pero que se ajusten a los estándares de seguridad, eficacia y calidad recomendados (15).
La resistencia a los antimicrobianos (RAM) pone en peligro la eficacia de la prevención y el tratamiento de una serie cada vez mayor de infecciones por virus, bacterias, hongos y parásitos. La RAM supone una amenaza cada vez mayor para la salud pública mundial y requiere medidas por parte de todos los sectores del gobierno y la sociedad. La prolongación de la enfermedad, la necesidad de más pruebas y la utilización de fármacos más caros aumentan el costo de la atención sanitaria a los pacientes con infecciones resistentes en comparación con el de los pacientes con infecciones no resistentes (16).
La posibilidad de utilización de la Fitoterapia en las prácticas terapéuticas, con sustento científico, exige acciones multisectoriales que involucren desde la producción primaria de plantas medicinales hasta el establecimiento de los procesos de control de calidad de las materias primas y medicamentos. La Fitoterapia podría transformarse entonces, de ser actualmente un indicador de dependencia, en un factor real de desarrollo para la agroindustria farmacéutica de Latinoamérica si fuera encarada por las políticas de ciencia y tecnología regionales y nacionales con un criterio más moderno y en consonancia con las necesidades de la población (17).
Streptococcus mutans es una bacteria Gram-positiva que reside en la boca humana y, más específicamente, en la biopelícula dental (18). La mayoría de los sujetos con caries exhiben altos niveles de Streptococcus mutans. En otros estudios, especies adicionales se han asociado con la enfermedad cuando Streptococcus mutans estaba ausente, incluidas las especies de Lactobacillus (19).
El potencial cariogénico de Streptococcus mutans se debe a su capacidad para producir grandes cantidades de glucanos y ácido, que exceden las capacidades de amortiguación salival, les da a las bacterias una ventaja para superar las especies comensales no cariogénicas en ambientes de pH bajo (20).
Formulación del problema
¿Cuál será el efecto antimicrobiano del aceite esencial y del extracto etanólico de la mandarina Citrus reticulata sobre Streptococcus mutans?
Delimitación del problema
La presente investigación se llevará a cabo en la ciudad de Guayaquil, Ecuador en el sector la Prosperina con una población total de 37.396 según el Centro de estudios e Investigaciones Estadísticas ICM-ESPOL (50).
Figura 1 La Prosperina, Guayaquil, Ecuador Objeto de investigación
Efecto antimicrobiano del aceite esencial y extracto etanólico de mandarina frente Streptococcus mutans.
Campo de acción
Estudio etnofarmacológico, obtención del extracto etanólico y aceite esencial de la mandarina Citrus reticulata y análisis microbiológico frente a
Streptococcus mutans.
Identificación de la línea de investigación
Estudios microbiológicos
Objetivo general
Evaluar la actividad antimicrobiana del aceite esencial y extracto etanólico de Mandarina frente a Streptococcus mutans.
Objetivos específicos
Determinar mediante el estudio etnofarmacológico el índice del
Determinar los parámetros físico-químicos de la cascara de mandarina.
Extraer el aceite esencial de la mandarina mediante la destilación por arrastre con vapor de agua y su extracto etanólico por maceración.
Evaluar la actividad antimicrobiana del aceite esencial y extracto etanólico de la mandarina Citrus reticulata en Streptococcus mutans.
Realizar un análisis estadístico para comprobar la hipótesis de investigación.
Hipótesis Hipótesis nula
El aceite esencial y extracto etanólico de Mandarina (Citrus Reticulata) no presenta efecto antimicrobiano frente a la cepa de Streptococcus mutans.
Ho: µ = 0 Hipótesis alterna
El aceite esencial y extracto etanólico de Mandarina (Citrus Reticulata) presenta efecto antimicrobiano frente a la cepa de Streptococcus mutans.
Hi: µ ≠ 0 JUSTIFICACION DEL TEMA
El interés mundial por la utilización de las plantas medicinales ha provocado una creciente demanda de las mismas. Son innumerables las personas que recurren diariamente al poder curativo de la naturaleza. El 80 % de la población mundial depende de los medicamentos elaborados con metabolitos secundarios provenientes de las plantas, ya que las sustancias bioactivas sintéticas no están al alcance de todos debido al precio de venta al público (21)
científicas, el valor de estos productos dentro del marco de la terapia medicamentosa moderna tiene cada día mayor relevancia, y se puede afirmar que en el ámbito mundial han alcanzado un interés mayor al observado en cualquier momento anterior de la historia de los medicamentos(22).
De acuerdo con la información publicada por la OMS, se estima que aproximadamente del 60% a 90% de los escolares tienen caries dental. En América Latina se observa desde la década de los setenta, la disminución de la enfermedad de caries, debido a dos principales factores, en relación directa con la masificación del uso de fluoruros y la implementación de programas de prevención y promoción de salud bucal. (23)
En virtud de lo expuesto y con la finalidad de promover la creación de nuevos fitofármacos como fuente de agentes antimicrobianos ha ido en aumento, estudios previos han demostrado que extractos de plantas pueden inhibir la proliferación bacteriana en la cavidad oral.
METODOLOGIA
El presente trabajo de investigación se realizó en tres fases: El estudio etnofarmacológico aplicando las encuestas como instrumento y es de tipo transversal y descriptivo, la segunda fase es la obtención del aceite esencial y el extracto etanólico de la mandarina mediante la destilación por arrastre con vapor de agua y maceración respectivamente. La tercera fase es el análisis microbiológico mediante la técnica de difusión en disco por triplicados embebidos en concentraciones de 25%, 50%, 75% y 100%, con un control positivo la clorhexidina al 2% y con el control negativo agua destilada. Finalmente, el análisis de resultados será desarrollado con métodos estadísticos que permitirán establecer la discusión final.
RESUMEN DE LA ESTRUCTURA DE LA TESIS
APORTE TEÓRICO
El aporte teórico de la presente investigación consistirá en fortalecer los conocimientos de la acción antimicrobiana del aceite esencial y extracto etanólico de la mandarina Citrus reticulata frente a Streptococcus mutans, apartir del análisis de los resultados de una gran variedad de metabolitos secundarios valiosos y la revisión bibliográfica en libros, artículos científicos, revistas en la cual se consultará la información teórica con el fin de proveer un marco de trabajo a los investigadores interesados en la temática expuesta para el desarrollo de fármacos y para futuras investigaciones.
SIGNIFICACIÓN PRÁCTICA
El presente trabajo servirá para futuras investigaciones y creación de nuevas formas farmacéuticas de origen natural apartir de los metabolitos secundarios de la Citrus reticulata.
Por otra parte, el obtener el extracto etanólico y el aceite esencial de la mandarina Citrus reticulata permite conocer aún más los recursos naturales con que se cuenta y así darles un mejor aprovechamiento; proporcionándoles un mayor valor agregado al comercializarlas como productos puros o extractos.
NOVEDAD CIENTIFICA
CAPITULO I. MARCO TEÓRICO 1.- MANDARINA Citrus reticulata
1.1.- Mandarina Historicidad
Las mandarinas en todas sus formas son probablemente descendientes de naranjas silvestres que crecieron en el noreste de la India hace ya 3.000 años. Desde la India las mandarinas hicieron su camino hacia la China y de la China a Europa, África del Norte y Australia antes de llegar a otras partes del mundo (24).
Las primeras de estas fueron llevadas a Inglaterra desde la China en 1805. Desde Inglaterra la mandarina pudo llegar a Italia en la siguiente década, y desde Italia llegó y se diseminó a otros países del Mediterráneo, incluyendo algunos de África del Norte. Desde la China la mandarina fue introducida en Australia en 1820 (24).
La mandarina ganó su nombre cuando fue introducida a Inglaterra. Donde el mandarín indicaba la lengua de oficiales públicos y otras personas educadas de la China. Las túnicas usadas por estas personas del Imperio Chino en aquella época eran de un anaranjado profundo de modo que este color se llamó como mandarín (24).
Las mandarinas fueron introducidas en Estados Unidos en 1840 por el Cónsul Italiano en Nueva Orleans. Desde Nueva Orleans la mandarina se diseminó a Florida y California (24).
Diversas variedades de mandarinas que son de color anaranjado profundo tomaron el nombre de tangerinas cuando fueron importadas en grandes cantidades dentro de los Estados Unidos en el siglo XIX desde Marruecos. Estas mandarinas provenían de la ciudad marroquí de Tánger (24).
1.1.1.- Distribución geográfica
alcanzado su máximo desarrollo en las áreas subtropicales (30-40º latitud N y S). En estas áreas la producción es estacional y la calidad del fruto para el consumo en fresco es excelente. La producción de mandarinas muestra un ritmo creciente más acusado que el de las naranjas (25).
Hay un gran interés por las variedades precoces de clementina (Marisol, Clemenpons y otras) y en general por las clementinas de calidad (Clemenules y otras). Las variedades de clementina de maduración tardía también son muy apreciadas. En las regiones tropicales (desde el Ecuador hasta 23-24º latitud N y S) la calidad el fruto es muy variable, dependiendo de los microclimas y de la altitud.
La producción es casi continua a lo largo del año y generalmente los frutos no
alcanzan su color amarillo intenso característico.
En áreas semitropicales (23-24º a 30º latitud N y S) los frutos tienen unas características intermedias: son muy jugosos, con un elevado contenido en azúcares y pueden ser destinados tanto al consumo en fresco como a la elaboración de zumo; y actualmente los cítricos son los frutos de mayor producción en el mundo (25).
1.1.2.- Taxonomía y Morfología
-Familia: Rutaceae. -Subfamilia: Aurantioidea. -Género: Citrus.
-Especie: Existen numerosas especies: Citrus reticulata, C. unshiu, C, reshni (clementinas, satsumas y comunes).
Figura 2 Citrus reticulata
-Porte: menor que el naranjo y algo más redondeado.
-Raíz: sólida, blanca y, bajo condiciones de cultivo, posee gran cantidad de pelos radiculares.
-Hojas: unifoliadas y de nerviación reticulada, con alas rudimentarias pequeñas.
-Flores: solitarias o en grupos de 3 ó 4.
-Fruto: llamado hesperidio. Existen variedades muy semilladas y otras partenocárpicas (25).
1.1.3.- Usos Medicinales
El aceite esencial de mandarina extraído de Citrus reticulata tiene grandes propiedades para ayudar a aliviar el stress y problemas digestivos, pero es mayoritariamente utilizado para incrementar la circulación en la piel, reducir la retención de fluido y ayudar a prevenir estrías. El aceite de mandarina es un calmante del sistema nervioso central y tiene un efecto tónico en el sistema digestivo, ayudando en la flatulencia, diarrea y constipación (26).
1.1.4.- Composición química del Aceite esencial de mandarina Citrus reticulata.
Los aceites esenciales (AEs) son mezclas de varias sustancias químicas que provienen del metabolismo secundario de las plantas. Éstos son muy empleados en medicina tradicional debido a que poseen diversas actividades biológicas: antimicrobiana, antioxidante, antiinflamatoria, hipolipemiante y anticancerígena (27).
enzima limitante (HMG-CoA reductasa) como en otras etapas de dicha vía. Esta modulación genera variados efectos, tales como la disminución de los niveles de colesterol y la inducción de apoptosis, que se asocian con la actividad antiproliferativa de los AEs (27).
Tabla 1 Composición del aceite esencial de mandarina.
Pico N° Tiempo de
retención
Porcentaje total de cada pico (%)
Nombre
1 5.013 4.4 Alfa-pineno
2 5.685 11.2 (±) Beta-pineno
4 6.758 70.8 Limoneno
5 7.036 8.3 Gamma-terpineno
6 7.424 0.9 Terpinoleno
7 7.559 2.3 Linalool
8 8.936 1.1 Alfa-terpineol
9 9.084 0.9 Decanal
1.2.3.- Tamizaje fitoquímico de la cascara y semilla de la mandarina
Tabla 2 Resultados de las pruebas químicas preliminares realizadas al extracto de la cascara de mandarina y semilla de mandarina.
CÁSCARA DE
MANDARINA
SEMILLA DE
MANDARINA
Lieberman-Buchard
+
+
Baljet
+
-
Hidroxamato
Férrico
+
+
Shinoda
+
-
Cloruro Férrico
+
+
Antrona
+
+
Dragendorff
-
-
En la prueba de Lieberman-Buchard sobre los extractos de las cáscaras y semillas de la mandarina estos se tornaron de un color verde, dando un resultado positivo para esta prueba e indicando la presencia de esteroides y triterpenos. Este cambio de coloración se debe a que el anhídrido acético reacciona con el grupo hidroxilo ubicado en la posición 3 del esteroide o triterpenos, produciendo un éster. Adicionalmente ocurre una deshidratación cuando el esteroide contiene una insaturación en la posición 5, haciendo que ocurra el cambio de coloración.Los triterpenos encontrados posiblemente son del tipo limonoides como la limonina y el limonol, pues son característicos de las rutáceas. Estos se extraen con solventes de baja polaridad, como el éter de petróleo y acetona. Otros esteroides posiblemente encontrados en los extractos son el campesterol y el estigmasterol debido a que son fitoesteroles muy comunes y poseen el doble enlace en el C5 que hace que la prueba química de un resultado positivo (28).
Los fitoesteroles tienen una función estructural ya que forman parte de las membranas celulares, estando involucrados en la permeabilidad de estas y en la transducción de señales. También desempeñan funciones metabólicas ayudando a la diferenciación y proliferación de tejidos meristemáticos y semillas, razón por la cual los fitoesteroles se encuentran en abundancia en las semillas.
Los extractos de cáscara se tornaron de un color naranja oscuro al aplicar el reactivo de Baljet, mientras que los de semilla permanecieron de un color naranja claro, similar al del control. El cambio de color indica la presencia de glicósidos cardiotónicos y/o sesquiterpenlactonas en la cáscara. Este cambio se debe a que el ácido pícrico (componente del reactivo de Baljet) forma un complejo con las lactonas α, β y γ insaturadas presentes en estos compuestos. (28).
glucosa, rabinosa y sacarosa son abundantes en los frutos, haciendo que la prueba de Baljet resultara positiva en los extractos obtenidos. (28).
La prueba del hidroxamato férrico arrojó un resultado positivo tanto en el extracto de la cáscara como en la semilla debido a que la muestra se tornó de color marrón. Este cambio de color se debe a que la hidroxilamina convierte las lactonas en ácidos hidroxámicos, los cuales, junto con Fe3+ en un medio ácido, forma el hidroxamato férrico, el cual tiene el color característico marrón y violeta.
A pesar que la prueba del hidroxamato férrico se hace principalmente para sesquiterpenlactonas y ésta fue positiva, es inevitable dudar este resultado ya que anteriormente se había mencionado que las rutáceas no presentan (ó en poca cantidad) sesquiterpenlactonas. Este fenómeno puede deberse a que la hidroxilamina puede reaccionar también con las cumarinas, las cuales son compuestos derivados de la lactona, haciendo que la pruebe arroje un resultado positivo (28).
En la prueba de Shinoda, la solución del extracto de cáscara se tornaron rojos ó anaranjados, además de observarse el desprendimiento de un gas, mientras que en la semilla no hubo cambio de coloración a pesar de que se liberó gas. Estos dos fenómenos diagnósticos de la prueba se deben a la reacción del Magnesio con el HCl, dando como producto H2 (el gas que se desprende) y MgCl2 el cual reacciona con los flavonoides, otorgando la coloración característica. (28).
Las soluciones del extracto de cáscara y semilla se tornaron de color marrón al agregar Cloruro férrico, indicando la presencia de fenoles derivados del catecol en los extractos. Este cambio de coloración también puede deberse a la presencia de otros compuestos similares, como los hidroxibenzalaldehidos o las cetonas, los cuales adquieren coloraciones oscuras que van desde el rojo al púrpura (28).
La prueba de antrona dio un resultado positivo para el extracto de cáscara y semilla al formarse un anillo de color verde en la interfase. Este cambio de coloración se debe a una deshidratación de los azúcares y formación de furfurales o derivados de estos, los cuales reaccionan con la antrona junto con el ácido sulfúrico (28).
También pueden encontrarse carbohidratos como las pentosas y las hexonas, las cuales están en los tejidos vegetales. Algunos de estos son la glucosa, arabinosa, fructosa y galactosa, que también reaccionan con la antrona haciendo que se dé un resultado positivo.
La prueba de Dragendorff dio un resultado negativo debido a que no se formó precipitado al adicionar el reactivo de dragendorff, demostrando la ausencia de alcaloides en los extractos (28).
También se ha encontrado que las plantas del género Citrus producen varios alcaloides pero estos sólo se acumulan en pocos órganos, como en los estambres de las flores y en las hojas (28).
Finalmente la prueba de saponinas dio un resultado negativo, pues no hubo formación de espuma después de agitar las soluciones de extracto y semilla. Esta prueba se fundamenta en que las saponinas tienen la capacidad de disminuir la tensión superficial del agua, lo que hace que al agitar la solución se forme espuma estable.
presencia de terpenos(64). Las manchas grandes moradas observadas en la cromatografía de cáscaras indica la presencia de un compuesto muy abundante, el cual muy posiblemente sea Limoneno, pues varios autores reportan que es el terpeno más abundante en las cáscaras de los cítricos, pues su abundancia es muy superior a los demás terpenos encontrados (28).
En las cromatografías de las fracciones etanólicas pueden identificar varias manchas florescentes pertenecientes a los fenoles encontrados en los extractos, pues los fenoles son aromáticos y por esto fluorescen. Con la vainillina se identifican manchas de color amarillo-marrón, correspondientes a los fenoles y violetas correspondientes a flavonoides. De esta manera con estas cromatografías se corrobora la presencia de estos compuestos en los extractos.
1.2.- Enfermedades Dentales y Bucales 1.2.1.- Definición
Son enfermedades que afectan la boca, los dientes y encías; tales como: caries, gingivitis, piorrea (29).
1.2.1.1.- Placa Bacteriana
La placa bacteriana es un tipo de biopelícula que se define como una comunidad microbiana diversa que se encuentra en la superficie dental embebida en una matriz de polímeros de origen bacteriano y salival. La formación de la placa involucra la interacción entre las bacterias colonizadoras primarias y la película adquirida del esmalte. (30).
ecológica”) describe la relación entre las bacterias de la placa y el huésped en la salud y en la enfermedad. Implícito en esta hipótesis se encuentra el concepto de que las enfermedades pueden prevenirse no sólo inhibiendo directamente los patógenos, sino también interfiriendo con los factores ambientales que favorecen la aparición selectiva y crecimiento de estas bacterias. De este modo, podrían establecerse estrategias holísticas para el control y tratamiento de las enfermedades orales. (30).
La progresión y desarrollo de la placa dental puede elevar la probabilidad de caída del diente (la destrucción localizada de tejidos del diente por el ácido producido de la degradación bacteriana del azúcar fermentable) y problemas periodontales tales como gingivitis y periodontitis (31). Por esto es importante quebrantar la masa bacteriana y removerla (32). El control y la remoción de la placa dental pueden ser alcanzados con un correcto cepillado, así como el uso de otros recursos tales como el hilo dental o cepillos interdentales (30).
La higiene oral es importante debido a que la placa dental puede volverse ácida y causar desmineralización del diente, o en su defecto causar cálculo dental (también conocido como sarro); el cual no puede ser removido por cepillos de dientes o interdentales, sino solamente a través de una limpieza profesional (31).
1.2.1.2.- Caries
La caries dental es una ruptura del diente debido a los ácidos producidos por bacterias (33). Las cavidades ocasionadas en las caries pueden ser de diversos colores que van del amarillo al negro (34). Los síntomas pueden incluir dolor y dificultad para comer (34) (35). Las complicaciones pueden incluir inflamación del tejido alrededor de los dientes, pérdida del diente, infección y formación de absceso (34).
1.2.1.3.- Agentes etiológicos
través de los tiempos se han preconizado diversas teorías acerca de la naturaleza etiológica de la caries, las cuales pueden resumirse en dos grupos:
- Endógenas - Exógenas (36)
1.2.1.4.- Endógenas
La teoría enzimática de las fosfatasas (enzimas que participan en el metabolismo de fósforo y del calcio que está relacionado con la calcificación y descalificación de los tejidos) sostiene que el proceso carioso es causado por un trastorno bioquímico que determina que las fosfatasas de la pulpa actúen sobre los glicerofosfatos, estimulando la producción de ácido fosfórico, el cual disuelve los tejidos calcificados (36).
1.2.1.5.- Exógenas
Concepto que sostiene que el proceso de caries se fundamenta en las características de los llamados factores básicos, primarios o principales: dieta, huésped y microorganismos, cuya interacción se considera indispensable para vencer los mecanismos de defensa del esmalte y consecuentemente para que se provoque enfermedad, ya que de otro modo será imposible que ésta se produzca (36).
causa necesaria; vale decir son imprescindibles para que se dé la enfermedad; sin embargo, por si solos, no llegan a constituir causa suficiente para ocasionarla. Pues para ello es crucial la intervención adicional de otros agentes, citados antes como factores etiológicos modulares (36).
1.2.2.- Microorganismos
1.2.2.1.- Streptococcus mutans
El Streptococcus mutans es un coco, anaerobio facultativo, gram positivo;
comúnmente encontrado en la cavidad oral humana, siendo un contribuidor
significante a la caries dental (37) (38). El microorganismo fue descrito por
primera vez por J Kilian Clarke en 1924 (39).
1.2.2.2.- Morfología
1.2.2.3.- Metabolismo
La caries dental es una enfermedad dental transmisible en la cual los estreptococos del grupo mutans juegan un papel principal. Como en muchas enfermedades infecciosas, se requiere la colonización de un patógeno antes de que ocurra la infección. Hay un rango de factores de virulencia importante para el establecimiento de Streptococcus mutans en la compleja comunidad microbiana de la biopelícula dental. Estudiar los factores de virulencia de S. mutans y su correlación con la biodiversidad de especies es fundamental para entender el papel que juega en la colonización por los diferentes genotipos en el mismo individuo y la expresión de las características que puedan o no influenciar su capacidad de virulencia y su habilidad para sobrevivir bajo diferentes condiciones ambientales (40).
El papel de los estreptococos del grupo mutans, especialmente Streptococcus mutans y Streptococcus sobrinus, en la etiología de la caries dental ha sido extensamente investigado y claramente demostrado (40).
los primeros dientes. Hay dos factores que sugieren que S. mutans pueda aparecer durante la etapa predental:
1) Streptococcus mutans y Streptococcus sobrinus son capaces de colonizar superficies mucosas.
2) Algunos niños desarrollan lesiones de caries poco después de la erupción dental. La colonización temprana de la cavidad oral (antes de la erupción dental) por S. mutans puede aumentar el riesgo de caries y hacer que su desarrollo se produzca a edades más tempranas (40).
Se han identificado unos 52 genotipos diferentes en niños pero las madres trasmiten cerca de 16 de ellos. Se observa una tendencia hacia la estabilidad de los genotipos transmitidos por las madres, en parte, porque la colonización del genotipo materno pueda interferir con la colonización de otros genotipos. Se ha observado que los niños albergan de uno a cinco genotipos diferentes de S. mutans en diferentes edades. La diversidad genotípica de S. mutans en cuatro sitios de muestreo (saliva, dorso de la lengua, mucosa alveolar y biopelícula dental) de niños parece ser homogénea, sin embargo, la biopelícula dental es un lugar muy importante dado el gran número de genotipos de S. mutans y las cepas aisladas.
Se ha demostrado un alto grado de homología entre cepas de S. mutans recuperadas de miembros de la misma familia indicando tanto la transmisión vertical y horizontal y una persistente colonización de S. mutans adquiridos previamente hasta la adultez temprana (40).
Se ha aceptado que las glucosiltransferasas (Gtfs) de S. mutans desempeñan papeles críticos en el desarrollo de la placa dental virulenta. Las Gtfs se adsorben para producir glucanos in situ sobre el esmalte, proporcionando los sitios para la colonización ávida por microorganismos y una matriz insoluble para la formación de la placa. Las Gtfs también se adsorben a las superficies de otros microorganismos orales convirtiéndolos en productores de glucanos. S. mutansexpresa 3 Gtfs genéticamente distintas; cada una parece desempeñar un papel diferente pero que se superpone en su papel en la formación de la placa virulenta. GtfC se adsorbe dentro de la película mientras que la GtfB se liga ávidamente a las bacterias promoviendo una apretada fusión celular incrementando la cohesión de la placa. La GtfD forma un polisacárido soluble, fácilmente metabolizable y sirve de iniciador de la GtfB. El comportamiento de Gtfs solubles no refleja lo observado con enzimas adsorbidas en la superficie. Además, la estructura de la matriz de polisacárido cambia con el tiempo a consecuencia de la acción de mutanasas y dextranasas dentro de la placa. Las Gtfs en diferentes lugares ofrecen blancos quimioterapéuticos para prevenir la caries dental. Sin embargo, los agentes que inhiben las Gtfs en solución, con frecuencia tienen efecto reducido o ninguno sobre las enzimas adsorbidas. Se han identificado otros productos bacterianos solubles usando técnicas inmunológicas, entre otros, fructosiltransferasa, Glucosiltranferasa (Gtf) y ácido lipoteicoico en la película formada in vitro e in vivo a partir de saliva entera. Se ha observado que las enzimas cuando se insolubilizan permanecen muy activas en una amplia gama de valores de pH. Está claro que la presencia de Gtf activa dentro de la película dental facilita la formación de glucanos in situ, proporcionando así, distintos sitios de unión para los microorganismos orales (40).
como la dieta especialmente el consumo de sacarosa que puede influir también en la proporción de las distintas especies bacterianas que constituyen la película, la cual es fermentada por S. mutans y C. albicans, produciendo un entorno acidogénico favorable para ambos (40).
1.2.2.4.- Reproducción
El Streptococcus mutans se reproduce asexualmente por fisión binaria, que es la división celular que produce dos células hijas idénticas. El cromosoma dentro de la célula se adhiere a la membrana plasmática, cuando se une el cromosoma se replica. Después de que el cromosoma se replica, los dos cromosomas hijas se unen a diferentes sitios en la membrana plasmática. Se forma un anillo contráctil de fibras FtsZ entre los dos cromosomas. Las fibras FtsZ son el principal componente del citoesqueleto de las bacterias. A medida que el anillo FtsZ se cierra, el citoplasma se divide en dos y se completa la división (41).
1.2.2.5.- Clasificación del Streptococcus mutans
1.2.3.- Transmisión, colonización y estabilidad de Streptococcus mutans en cavidad oral
La presencia de microorganismos acidogénicos, en especial el S. mutans son los primeros relacionados con el inicio de la caries dental. Estas bacterias pueden transmitirse entre los individuos. El medio de transmisión se puede dar de manera directa a través de la saliva de las personas que rodean al niño y de manera indirecta, mediante el uso de objetos contaminados que el niño lleva a la boca como el cepillo de dientes, chupones, mamaderas, tenedores y cucharas contaminadas con esta flora bacteriana. Cuando las madres dan de comer a sus hijos es muy común que pasen el cubierto por su boca, que prueben la temperatura del alimento antes de dárselo a su hijo y que limpien el chupón o el biberón con su saliva cuando cae al suelo. En todos estos casos si la madre tiene dientes cariados, el intercambio de saliva puede transmitir las colonias del agente infeccioso (42).
La colonización de S. mutans incrementa con la edad, los factores asociados son los fluidos dulces ingeridos antes de dormir, exposición frecuente al azúcar, ingesta de bocadillos, compartir comida con los adultos. En contraste no se ha asociado colonización del S. mutans con el cepillado dental; encontrándose además que la colonización del S. mutans en infantes se da prioritariamente desde que nacen hasta los 24 meses de edad (43).
1.2.3.1.- Patogenicidad
Streptococcus mutans es un microorganismo capaz de adquirir nuevas propiedades que permiten la expresión de determinantes de patogenicidad que determinan su virulencia en condiciones ambientales específicas (44).
1.2.3.2.- Mecanismo de Resistencia Antimicrobiana
La resistencia antimicrobiana es la habilidad de los microorganismos de resistir los efectos de las drogas, esto implica que no sean destruidos y que su crecimiento no sea detenido. Aunque algunas personas estén a un riesgo mayor que otras, nadie puede completamente evitar el riesgo de resistencia a infecciones de antibióticos (45).
Las infecciones con organismos resistentes son difíciles de tratar, requiriendo muchas veces alternativas tóxicas y costosas (45).
1.2.3.3.- Resistencia Antimicrobiana del Streptococcus mutans
Recientemente los sistemas reguladores de la transducción de la señal bacteriana específica, llamada sistema de dos componentes (TCSs por sus siglas en inglés), aparecen enfocados en detectar y adaptarse al ambiente donde son descubiertos (46).
El S. mutans es una bacteria oral comensal y aunque sus factores de virulencia han sido bien demostrados, el mecanismo de adaptación de las especies a la cavidad oral aún no es muy entendido. El S. mutans tiene 15 conjuntos de TCSs, y dentro de ellos se ha demostrado que están involucrados en tolerancia ácida, competencia y formación de biofilm (46).
Recientemente junto con estos hallazgos se ha demostrado que 5 TCSs estaban asociados con la producción de bacteriocina (toxina inhibidora de otras bacterias). Seis de quince TCSs están asociados con los agentes antimicrobianos, implicando esto que el S. mutans puede sobrevivir en la cavidad oral resistiendo varios péptidos antimicrobianos (46).
1.2.4.- Actividad Antimicrobiana
Las drogas antimicrobianas químicamente interfieren con la función de síntesis de los componentes vitales de los microorganismos. Pudiendo solamente eliminarlos o previniendo su crecimiento. Existen varios caminos en el cual estos agentes exhiben su actividad. Inhibiendo:
2. Síntesis de proteínas.
3. Síntesis de ácidos nucleicos.
4. Actividad enzimática.
5. Metabolismo del folato
O en su defecto causar daño a la membrana citoplasmática (47).
1.2.4.1.- Actividad antimicrobiana de los aceites esenciales
La actividad antimicrobiana de los aceites esenciales está especialmente enfocada en el tratamiento de las cepas resistentes a los antibióticos convencionales. Los aceites esenciales pueden actuar como potenciadores de la actividad antimicrobiana, de ese modo pueden incrementar el perfil para el antibiótico cuya acción esté limitada por un mecanismo de resistencia a múltiples drogas (48).
La ventaja del uso de la actividad antimicrobiana de un aceite esencial, en comparación con un antibiótico sintético, yace en el hecho de que la actividad farmacológica no puede ser atribuida solamente a un componente, debido a que muchos componentes pueden interactuar sinérgicamente en la promoción de esta actividad (48).
1.2.4.2.- Cepas de Control
Cada estándar provee rangos de control para la concentración mínima inhibitoria (MIC) para estas cepas contra algunos de todos los microorganismos de interés (49).
La cepa de control recomendada será incluida en cada análisis; si alguna de estas cae dentro del rango de control el análisis es válido; en cambio sí está fuera de este rango el análisis debe considerarse inválido y será realizado nuevamente (49).
1.3.- Métodos de extracción en fitoquímica
Cuando se da inicio a un estudio fitoquímico se debe tener claro qué tipo de metabolitos es posible determinar en la especie que está siendo estudiada y aún más en concreto, en la parte de la planta de la que se va a realizar el extracto, ya que de estos factores depende el método de extracción que se debe utilizar para el material vegetal. En la mayoría de los estudios se hace la extracción del material vegetal seco y pulverizado para que se logre mayor permeabilidad del solvente y por lo tanto mayor rendimiento en la extracción y porque en la mayoría de los casos los compuestos a estudiar son parte del metabolismo secundario, permanecen sin descomponerse en la estructura de la planta y no se volatilizan fácilmente, no obstante en algunos estudios como en los que tienen que ver con aromas es absolutamente necesario la utilización del material vegetal fresco. La polaridad de los compuestos a extraer es un factor determinante en el tipo de solvente que se debe emplear, por ende si se quieren extraer mayoritariamente compuestos como esteroles, se debe utilizar un solvente como éter de petróleo, cumarinas con hexano y alcaloides con uno como etanol y posteriormente con un ácido diluido. La extracción con etanol es muy común ya que con este se extraen sustancias de todas las polaridades, además este es un solvente estable (poco reactivo) y económico, también se puede evaporar fácilmente (50).
1.3.1.- Extracción sólido-líquido
portadora sólida sería el material vegetal, el soluto sería el extracto obtenido a través del disolvente (50).
1.3.2.- Maceración
El principio de la maceración consiste en la obtención de extractos gracias al duradero tiempo de contacto que el solvente debe tener con el material vegetal que debe estar pulverizado o molido para lograr una mayor superficie de contacto con el solvente, este proceso es realizado a temperatura ambiente. Es conveniente realizar agitaciones frecuentes para la homogenización del procedimiento y así tratar de influenciar el rendimiento de la extracción, el poder de extracción del solvente va disminuyendo a medida que pasa el tiempo de contacto con el material vegetal; para la realización de este tipo de extractos es conveniente la protección del recipiente de extracción de la luz solar, ya que esta puede llegar a descomponer sustancias fotolábiles. Después de la realización del extracto por medio de un filtrado es necesario lavar el material vegetal restante con más solvente para la obtención del extracto total (50).
1.3.3.- Percolación o lixiviación
Consiste en el paso del disolvente a temperatura ambiente sin la aplicación de presión (solo por la acción de la gravedad) a través del material vegetal finamente molido, el 46 hecho de que el solvente pase detenidamente por las partículas del sólido hace que disuelva la mayor cantidad de metabolitos que le es posible y debido a que es continua la adición de solvente se logra una extracción muy efectiva utilizando esta técnica (50).
1.3.4.- Extracción líquido-líquido
1.4.- CONCLUSIONES DEL CAPITULO
La Citrus reticulata posee en su cáscara compuestos polifenólicos que además de tener la conocida actividad antioxidante, también tienen actividad antimicrobiana sobre bacterias Gram positivas y negativas
La cáscara de mandarina tiene un alto contenido de limoneno en lo referente a triterpenos y polifenoles totales extraíbles el valor es 7,6 g/100g, la concentración más alta en relación a la naranja que es 4.33 g/100g y la toronja 5.1 g/100 g
Los polifenoles con catequinas pueden transformarse en una herramienta para sustituir los antibióticos promotores de crecimiento, proveyendo un producto de origen natural inocuo para la salud humana.
El Streptococcus mutans es una bacteria cariogénica que habita en la boca, especialmente en el biofilm.
Streptococcus Mutans es un microorganismo capaz de adquirir nuevas propiedades que permiten la expresión de determinantes de patogenicidad que determinan su virulencia en condiciones ambientales específicas (44)
El etanol es un solvente estable muy adecuado para extraer sustancias de todas las polaridades, y se puede evaporar fácilmente.
CAPITULO II
MARCO METODOLÓGICO Y PLANTEAMIENTO DE LA PROPUESTA 2.- Caracterización del sector
El presente trabajo de investigación se desarrolló en modalidad cualitativa y cuantitativa, con diseño cuasi experimental. Por su alcance es una investigación correlacional.
Se realizó el estudio etnofarmacológico de plantas medicinales en el sector la Prosperina de la ciudad de Guayaquil, cuenta con una población total de 37.396 según el Centro de estudios e Investigaciones Estadísticas ICM-ESPOL (50), siendo su temporada de cosecha el cuarto trimestre del año, fueron adquiridas en el Mercado de Sauces 9, al Norte de la ciudad; las mandarinas crecen preferentemente en zonas subtropicales con un área de sembrado de 14.950.00 ha en el país de acuerdo al Ministerio de Agricultura y Ganadería. Guayaquil, es la ciudad más grande y habitada de Ecuador, está ubicada a 4.0 msnm, localizada a 2°11´00´Sur y 79°53´00´ Oeste.
2.1.- Descripción del procedimiento metodológico
Esta investigación se realizó en tres etapas:
Estudio etnofarmacológico
Obtención del extracto etanólico y aceite esencial
Estudio microbiológico
2.1.1.- Etapa I: Estudio etnofarmacológico Criterios de inclusión
Para las entrevistadas se incluyeron a mujeres que se ubican en un
grupo etario de 30 a 60 años de edad, madres de familia y abuelas, conocedoras del uso ancestral de plantas para tratar dolencias.
Criterios de exclusión
Información de las personas que no pertenecían a la zona de estudio. Información de las personas menores de edad.
Materiales y métodos:
Encuesta impresa
Mediante el estudio del tipo transversal y descriptivo se aplicó las encuestas etnofarmacológicas de plantas medicinales en la ciudad de Guayaquil en el sector la Prosperina. Es descriptivo porque se describió la utilización de plantas medicinales por mujeres y es transversal porque se estudia de forma simultánea en un momento dado.
Las encuestadas fueron muestreados por el método no probabilístico del tipo cuotas, ya que tienen que cumplir con todos los criterios de inclusión.En primer lugar, por medio de encuestas se verificará los usos potenciales de la planta en base al conocimiento popular de los informantes.
2.2.- Universo y muestra
El sector la Prosperina de la ciudad de Guayaquil cuenta con una población total de 37.396 población total según el Centro de estudios e Investigaciones Estadísticas ICM-ESPOL (50).
La muestra utilizada fue de 1980 personas que se ubican en un grupo etario de mujeres de 30 a 60 años de edad, se aplica la siguiente ecuación:
𝑛 = K
2NPQ
e2(N − 1) + K2PQ
Dónde:
N= Población
P=Probabilidad de éxito=0.5
K=Coeficiente de Nivel de Confianza del 95% =2
E=10% =0.1
Reemplazando valores tendremos:
𝒏 = (2)21980 (0.5)(0.5)
(0.1)2(1980 − 1) + (2)2(0.5)(0.5)
𝒏 = 1980
20.79
El tamaño de la muestra es:
𝒏 = . =
Resultando la muestra 95 mujeres que serán encuestadas, se ubican en un grupo etario de mujeres de 30 a 60 años de edad, madres de familia y abuelas, conocedoras del uso ancestral de plantas para tratar dolencias.
2.2.1.- Etapa II: Obtención del extracto etanólico y aceite esencial 2.2.2.- Caracterización Botánica
Se realizó la identificación botánica del fruto Citrus reticulata en el Herbario de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad de Guayaquil, anexo 1.
Criterios de inclusión:
Frutas frescas, adultas, con cáscara de color amarillo intenso y uniforme
Criterios de exclusión:
Futas pequeñas que no han llegado a la adultez y menores al tamaño; atacadas por insectos, ennegrecidas, viejas o descompuestas.
Materiales y métodos:
Balón de extracción Cilindros 250ml Balón 250 ml Rotavapor
Maceración
Una vez colectadas los frutos se separaron las cascaras con criterio de inclusión y se secaron a 40°c luego se trituraron manualmente, logrando una cantidad de 72g.
Se prefiere etanol como solvente porque los compuestos alcohólicos rompen la membrana celular y así se logra extraer grandes cantidades de material endocelular, además de ser un disolvente que puede solubilizar un amplio rango de metabolitos. (51).
Pesar 25 g. de droga seca, molida y extraerlos con 200 ml de éter etílico por maceración durante 48 horas. Se obtiene el extracto y el residuo sólido (secar y pesar). A la droga agotada con el éter etílico, extraer por maceración con etanol al 75% (tres veces el peso del residuo en volumen) durante 48 horas se obtiene el extracto y el residuo sólido (secar y pesar).
2.2.3.- Pruebas analíticas
Para todas las pruebas analíticas se trabajó las muestras por triplicado.
2.2.4.- Humedad
Llevar al horno secador las cáscaras para extraer la humedad de las mismas a 60ºC durante 4 horas(52).
Porcentaje de humedad de la muestra: % H = (p – p”)/ p x 100
2.2.5.- Cenizas totales
Con la ayuda de 2 crisoles previamente tarados, pesamos 2 gr. de muestra vegetal seca y molida en cada crisol, y llevamos a la mufla por el lapso de 3 horas a 750ºC, pasado este tiempo dejar en secador y pesar (52).
C= 2 100
M2 = Masa de crisol con cenizas
M1 = Masa de crisol con muestra de ensayo
M = Masa de crisol vacío
2.2.5.1.- Cenizas Totales en Agua
Pesar 2 g de muestra vegetal seca y molida en dos crisoles respectivamente, llevar a la Estufa por 3 horas a 750ºC, pasado este tiempo dejar en secador y pesar (52).
M2 = Masa de crisol con cenizas
M1 = Masa de crisol con muestra de ensayo
M = Masa de crisol vacío
C= 2 100
2.2.5.2.- Cenizas Totales en Ácido Clorhídrico.
queden transparente. Luego de esto poner el papel filtro con residuo en el crisol correspondiente para llevarlo a la mufla por 2 horas. A 750 ºC (52).
Obtención del aceite esencial
Destilación por arrastre con vapor de agua
Se toman 100 mandarinas, de las cuales se trabajarán con las que cumplan el criterio de inclusión, se procede a pelar y tomar las cáscaras, luego se quita el albedo y se conserva el flavedo hasta que queden aptas para ser troceadas en pedazos pequeños. Se conservan en refrigeración por un máximo de 2 horas, previo a la destilación.
Colocar en el balón A agua destilada, en el balón B las cáscaras de mandarina humedecidas, ensamblar el equipo de destilación para arrastre de vapor y proceder a recoger el destilado, verificar que el lugar tenga ventilación adecuada. Una vez colectado el líquido que debe tener un color blanco lechoso, se procede a sangrarlo con Cloruro de Sodio y extraerlo con cloroformo. Guardar el aceite esencial obtenido en frascos ámbar de tapa rosca. Repetir el procedimiento hasta agotar las frutas. El proceso llevará alrededor de 3-5 días.
2.3.- Etapa III: Pruebas microbiológicas
Criterios de inclusión: La cepa a utilizar será la correspondiente al Streptococcus mutans (ATCC 25175); dicha cepa no ha presentado previo contacto alguno con bacteria o solución antimicrobiana; se tomarán en consideración las normas de Bioseguridad para la manipulación de las mismas.
El aceite esencial y el extracto etanólico de Citrus reticulata serán embebido
en discos de papel filtro; el medio donde se cultivará el Streptococcus mutans (ATCC 25175) será el agar Mueller Hinton para posteriormente colocar los discos de papel en sus respectivas diluciones (25, 50, 75 y 100%).
Materiales y métodos
Incubadora de convección natural
Autoclave
Estufa
Reverbero
Mechero
Cajas de Petri
Asa de platino
Sensidiscos
Varilla de vidrio
Matraz Erlenmeyer de 500ml
Diluciones del aceite esencial y extracto etanólico
Para realizar el trabajo microbiológico se procede a realizar las diluciones del aceite esencial y el extracto etanólico a concentraciones al 25%, 50%, 75% y 100 %, aplicando la siguiente ecuación:
V1C1=V2C2
Tabla 3 Diluciones de Extracto etanólico de cáscara de mandarina EXTRACTO
ETANOLICO
Peso inicial g
ETANOL DE 75° GL %
VOLUMEN FINAL Ml
25 g extracto seco 25 100 ml
50 g extracto seco 50 100 ml
75 g extracto seco 75 100 ml
