UNIVERSIDAD REGIONAL AUTÓNOMA DE LOS ANDES UNIANDES
FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS
PROGRAMA DE MAESTRÍA EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL GRADO ACADÉMICO DE MAGÍSTER EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA
TEMA:
EFECTO IN VITRO ANTIMICROBIANO DEL ACEITE ESENCIAL Y EXTRACTO ETANÓLICO DE ZANAHORIA (Daucus carota) FRENTE A
STREPTOCOCCUS MUTANS
AUTOR: Q.F TUMBACO LINO PAUL LEONEL
ASESORES: DR. VITERI RODRIGUEZ JUAN ALBERTO, MSc. ING. OÑA CISNEROS FABIAN DAVID, MSC PHD(C).
APROBACIÓN DE LOS ASESORES DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
CERTIFICACIÓN:
Quienes suscribimos, legalmente CERTIFICA QUE: El presente Trabajo de Titulación realizado por el Q.F Paul Leonel Tumbaco Lino, maestrante del Programa de Maestría en Farmacia Clínica y Hospitalaria, Facultad de Ciencias Médicas, con el tema “EFECTO IN VITRO ANTIMICROBIANO DEL ACEITE ESENCIAL Y EXTRACTO ETANÓLICO DE ZANAHORIA (Daucus carota) FRENTE A STREPTOCOCCUS MUTANS ”, ha sido prolijamente revisado, y cumple con todos los requisitos establecidos en la normativa pertinente de la Universidad Regional Autónoma de los Andes -UNIANDES-, por lo que apruebe su presentación.
Ambato, Mayo del 2018
___________________________________ _______________________________
Dr. Viteri Rodríguez Juan Alberto. Ing. Oña Cisneros Fabián David.
DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD
Yo, Q.F Paul Leonel Tumbaco Lino, maestrante del Programa de Maestría de Farmacia Clínica y Hospitalaria, Facultad de Ciencias Médicas, declaro que todos los resultados obtenidos en el presente trabajo de investigación, previo a la obtención del Grado Académico de MAGÍSTER EN FARMACIA CLINICA Y HOSPITALARIA, son absolutamente originales, auténticos y personales; a excepción de las citas, por lo que son de mi exclusiva responsabilidad.
Ambato, Mayo 2018
______________________________ Q.F. Paul Leonel Tumbaco Lino CI. 1312677931
DERECHOS DEL AUTOR
Yo, Q.F Paul Leonel Tumbaco Lino, declaro que conozco y acepto la disposición constante en el literal d) del Art. 85 del Estatuto de la Universidad
Regional Autónoma de los Andes, que en su parte pertinente dice: El patrimonio de la UNIANDES está constituido por:” La propiedad intelectual
sobre las Investigaciones, trabajos científicos o técnicos, proyectos
profesionales y consultoría que se realicen en la Universidad o por cuenta de
ella;
Ambato, Mayo 2018
______________________________ Q.F. Paul Leonel Tumbaco Lino CI. 1312677931
DEDICATORIA
El presente proyecto de investigación se la dedico a mi Mamá (Gladys Lino), a mi Hermano (Freddy Tumbaco), a mi Esposa (Denisse Moran), A mi hijo (Ian Tumbaco), quiénes supieron guiarme por el buen camino, darme fuerzas para seguir adelante y por ayudarme a enfrentar las adversidades sin perder nunca la esperanza, ni rendirme en el intento.
RESUMEN
La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que el 80 por ciento de la población mundial utiliza actualmente hierbas medicinales para algún aspecto de la atención primaria. Por la cual se evaluará el efecto in vitro antimicrobiano de aceite esencial y extracto etanólico de Daucus carota frente a Streptococcus mutans. La misma se basó en tres etapas: estudio etnofarmacológico, preparación de extracto y aceite esencial, y análisis microbiológico. La presente investigación indagó, a través de una encuesta aplicada en la ciudad de Guayaquil con una población de 2450 personas, dando como resultado un tamaño de muestra de 96 personas, sobre el uso de plantas medicinales. Entre ellas, Daucus carota obtuvo un nivel de uso significativo del 50 % y un índice de valor de uso igual a 0.03%, lo cual cumple con la aceptación cultural para
ser utilizado como tratamiento en los problemas de salud en la población. El análisis fitoquímico de Daucus carota realizada mediante cromatografía líquida mostró que la raíz contenía en mayor cantidad flavonoides y fenoles como metabolitos secundarios. En el estudio microbiológico se utilizó el método de difusión en disco para evaluar el efecto antimicrobiano en todas las concentraciones; al 100% se obtuvo el mayor promedio de halo inhibitorio para el aceite esencial y extracto etanólico, de 11,33mm y 12,33mm respectivamente. Se realizó ANOVA para la estadística determinándose un P<0,0001 para el extracto etanólico y aceite esencial de la zanahoria, comprobándose que si existe un efecto antimicrobiano frente a Streptococcus mutans.
ABSTRACT
The World Health Organization (WHO) estimates that 80 percent of the world's population currently uses herbal medicines for some aspect of primary care. By which the in vitro antimicrobial effect of essential oil and ethanol extract of Daucus carota against Streptococcus mutans will be evaluated. It was based on three stages: ethnopharmacological study, preparation of extract and essential oil, and microbiological analysis. The present investigation investigated, through a survey applied in the city of Guayaquil with a population of 2450 people, resulting in a sample size of 96 people, on the use of medicinal plants. Among them, Daucus carota obtained a significant use level of 50% and an index of use value equal to 0.03%, which meets the cultural acceptance to be used as a treatment in the health problems in the population. The phytochemical analysis of Daucus carota by means of liquid chromatography showed that the root contained in greater quantity flavonoids and phenols as secondary metabolites. In the microbiological study the disc diffusion method was used to evaluate the antimicrobial effect in all concentrations; At 100%, the highest average inhibitory halo was obtained for the essential oil and ethanolic extract, 11.33mm and 12.33mm respectively. ANOVA was performed for the statistics, determining a P <0.0001 for the ethanolic extract and essential oil of the carrot, proving that there is an antimicrobial effect against Streptococcus mutans.
ÍNDICE GENERAL
APROBACIÓN DE LOS ASESORES DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD
DERECHOS DEL AUTOR
DEDICATORIA
RESUMEN
ABSTRACT
ÍNDICE GENERAL
INTRODUCCIÓN ... 1
Antecedentes de la investigación ... 1
Planteamiento del Problema ... 2
Formulación del Problema ... 3
Delimitación del Problema ... 3
Objeto de Investigación ... 4
Campo de Acción ... 4
Identificación de la Línea de Investigación ... 4
Objetivo General ... 4
Objetivos Específicos... 4
Hipótesis….. ... 5
Justificación Del Tema ... 5
Metodología ... 6
Marco teórico ... 6
Epígrafe I. Estudio de la zanahoria ... 6
Epígrafe II. Preparación de extractos y aceites de zanahoria... 6
Epígrafe III Estudio de cepas de microorganismos ... 6
Epígrafe IV. Métodos de extracción en fitoquímica ... 7
Elementos de novedad ... 7
Aporte Teórico ... 7
Significación Práctica ... 8
Novedad Científica... 8
CAPÍTULO I. MARCO TEÓRICO ... 9
1. Epígrafe I. Estudio de la Zanahoria ... 9
1.1. Generalidades ... 9
1.1.1. Taxonomía ... 9
1.1.2. Descripción botánica ... 9
1.1.3. Usos ... 9
1.1.4. Funciones Medicinales ... 10
1.2. Epígrafe II. Preparación de Extractos y Aceites de Zanahoria ... 10
1.2.1.Selección y recolección de especímenes de Daucus carota... 10
1.2.2. Obtención de Aceite Esencial y Extracto Etanólico de Daucus carota.. .. 10
1.3. Epígrafe III. Estudio de cepas de microorganismos ... 11
1.3.2. Morfología ... 11
1.3.3. Reproducción ... 11
1.3.4. Crecimiento ... 11
1.3.5. Clasificación del Streptococcus Mutans ... 13
1.3.6. Transmisión, Colonización y estabilidad de Streptococcus mutans en cavidad oral ... 14
1.3.7. Patogenicidad ... 16
1.3.8. Mecanismo de Resistencia Antimicrobiana ... 16
1.3.9. Resistencia Antimicrobiana del Streptococcus Mutans ... 17
1.3.10. Potencia o actividad antimicrobiana ... 18
1.3.11. Actividad antimicrobiana de los aceites esenciales ... 19
1.3.12. Cepas Control ... 19
1.4. Epígrafe IV. Métodos De Extracción En Fitoquímica ... 19
1.4.1. Extracción sólido-líquido ... 20
1.4.2. Maceración ... 20
1.4.3. Percolación o lixiviación ... 20
1.4.4. Extracción líquido-líquido ... 21
1.4.5. Compuestos fenólicos ... 21
1.4.5.1. Análisis de fenoles totales. ... 22
1.4.5.2. Tamizaje fitoquímico ... 22
1.5. Conclusiones del capítulo. ... 23
2. Caracterización del sector ... 24
2.1. Descripción del proceso metodológicos ... 24
2.1.1. Etapa I: Estudio etnofarmacológico ... 24
2.1.1.1. Criterios de inclusión ... 24
2.1.1.2. Criterios de exclusión ... 24
2.1.1.3. Materiales y métodos: ... 25
2.1.2. Universo y muestra... 25
2.1.3. Etapa II: Obtención de extracto y aceite esencial ... 26
2.1.3.1. Caracterización Botánica ... 26
2.1.3.2. Criterios de inclusión: ... 26
2.1.3.3. Criterios de exclusión: ... 26
2.1.3.4. Materiales y métodos: ... 26
2.1.3.4.1. Muestreo de una proporción ... 27
2.1.3.4.2. Evaluación cuantitativa de la diversidad de especies. ... 27
2.1.3.5. Recolección y acondicionamiento de la materia prima vegetal. .... 28
2.1.3.6. Operaciones previas: ... 28
2.1.3.7. Material vegetal y obtención de los extractos. ... 28
2.1.3.8. Extracto Etéreo ... 29
2.1.3.9. Extracto Etanòlico... 29
2.1.3.10. Destilación por arrastre de vapor... 29
2.1.5.Humedad ... 29
2.1.6. Cenizas totales ... 30
2.1.6.1.Cenizas Totales en Agua ... 30
2.1.6.2.Cenizas Totales en Ácido Clorhídrico. ... 30
2.1.7.Obtención del aceite esencial vegetal ... 31
2.1.8.Preparación y Obtención de extractos ... 31
2.1.4. Etapa III: Procedimiento microbiológico para determinar el efecto antimicrobiano de la zanahoria frente a S. mutans ... 31
2.1.4.1.Cepa de microorganismo ... 31
2.1.4.2. Procedimiento Microbiológico ... 31
2.1.4.3. Evaluación de la actividad bacteriana del aceite y extracto preparados con la técnica de difusión en disco. ... 31
2.1.4.4. Materiales y métodos ... 32
2.1.4.5. Pruebas microbiológicas. ... 33
2.1.4.6. Diluciones del aceite esencial y extracto etanólico ... 34
2.1.5. Conclusiones del capítulo. ... 34
CAPÍTULO III. ANÁLISIS DE RESULTADOS ... 35
2.ESTUDIO ETNOFARMACOLÓGICO DE PLANTAS MEDICINALES ... 35
Evaluación cuantitativa de la diversidad de especies. ... 37
Nivel de uso significativo (UST) ... 37
3.1.ANÁLISIS DE RESULTADOS MICROBIOLÓGICOS. ... 39
BIBLIOGRAFÍA
INTRODUCCIÓN
Antecedentes de la investigación
La Organización Mundial de la Salud (OMS), define a la Medicina Tradicional (MT) como la suma de conocimientos, técnicas y prácticas fundamentadas en las teorías, creencias y experiencias propias de diferentes culturas que se utilizan para mantener la salud física y mental (1). Es importante mencionar que la MT, también se conoce como: complementaria, alternativa, popular, blanda, marginal, no oficial, no ortodoxa y no convencional (1).
Es un hecho que, en las últimas décadas la MT se ha difundido ampliamente a nivel global incluyendo los países desarrollados, esto debido a los aspectos migratorios, económicos, ineficacia e ineficiencia de la Medicina “convencional” (MC) (1).
La medicina tradicional en Ecuador, al igual que en otros países andinos, es una antigualla. Sus raíces pertenecen a un pasado de más de 10 mil años, su vigencia ha continuado a lo largo de cinco siglos de regímenes coloniales y republicanos. Dicha permanencia ha sido sostenida por los pueblos de más bajos recursos: indios, mestizos, montubios y campesinos, quienes han encontrado en la medicina tradicional una alternativa menos costosa y más coherente con su cosmovisión (2)
Las plantas presentan un metabolismo secundario que les permite producir y acumular compuestos de naturaleza química diversa. Estos compuestos se denominan metabolitos secundarios, se distribuyen diferencialmente entre grupos taxonómicos, presentan propiedades biológicas, desempeñan funciones ecológicas y se caracterizan por sus diferentes usos y aplicaciones como medicamentos, insecticidas, herbicidas, perfumes y colorantes (3)
La zanahoria es una planta que se fija al suelo mediante una raíz ahusada, de color entre blanco (variedades silvestres) y rojo-anaranjado, de la que brota un tallo ramificado, anguloso, con hojas recortadas alternas. Su fruto es un diaquenio (5). El extracto de zanahoria contiene un porcentaje considerable de terpenos como el pineno, caratol, daucol, ácido isobutírico y asarona (6), estos metabolitos secundarios son de conocida actividad antimicrobiana. Los constituyentes mayoritarios del aceites esencial de semilla de zanahoria fueron carotol (66.78%), dauceno (8.74%), (Z,Z)-farneseno (5.86%), germacreno D (2.34%), trans-bergamoteno (2.41%), y -selineno (2.20%). Por su parte, carotol (30.55%), ducol (12.60%) y capaenol (0.62%) fueron los componentes principales del aceite comestible (7). La función conservadora de los aceites esenciales se debe a que en su composición poseen compuestos tipo eugenol o aldehído cinámico con poder antimicrobiano (8). La efectividad antimicrobiana de los aceites esenciales se evidenció en el estudio realizado en Argelia, 2016, para el aceite esencial obtenido de las partes aéreas (hojas, tallo) de D. gracilis, el cual fue sometido a evaluación de su actividad antimicrobiana contra cinco bacterias y tres hongos mediante difusión en agar método, producto de este estudio se comprobó que el aceite esencial de D. gracilis inhibió significativamente el crecimiento de Bacillus cereus y Proteus mirabilis con concentraciones inhibitorias mínimas de 17,15 μg / ml mediante el método de dilución en agar y 57,05 μg / ml y 114,1 μg / ml, respectivamente, mediante microdilución líquida (9)
Planteamiento del Problema
La resistencia a los antimicrobianos, pone en peligro la eficacia de la prevención y el tratamiento de las morbilidades provocadas por bacterias, siendo una amenaza cada vez mayor para la salud pública, prolongando las estadías hospitalarias, la utilización de fármacos más caros elevando los costos médicos y aumentando la mortalidad (10)
Streptococcus mutans es un microorganismo cariogénico, cuenta con alta prevalencia en el mundo entero (afectando del 95% al 99% de la población), situándose como la principal causa de pérdida de dientes (10). Este microorganismo en asociación con el Streptococcus sobrinus son colonizadores tempranos del biofilm que rodea a los dientes mediante procesos de adhesión y co-adhesión, su patogenicidad se ha demostrado en relación a la producción de caries del esmalte, debido a la capacidad que poseen de producir ácidos dando la característica fundamental de ser acidogénicos, acidúricos y acidófilos a partir de la sacarosa (12)
El uso de los aceites esenciales de frutas y hortalizas como agentes antibacterianos es bien conocido a nivel empírico (13), sin embargo, hay escasas investigaciones de los metabolitos secundarios de Daucus carota
frente a Streptococcus mutans.
La falta de estudios completos de fitofármacos y difícil acceso a los medicamentos a gran parte de la población obliga a desarrollar más investigaciones fitoquímicas y farmacognósticas en Ecuador a fin de aportar al desarrollo nacional y a la salud de la población.
Formulación del Problema
¿Cuál será el efecto antimicrobiano del aceite esencial y extracto etanólico de la zanahoria (Daucus carota) frente a Streptococcus mutans?
Delimitación del Problema
Imagen 1. Ciudad de Guayaquil, Ecuador. Tomado de Google Earth Pro bajo licencia institucional.
Objeto de Investigación
Actividad antimicrobiana del aceite esencial y extracto etanólico de Daucus carota frente a Streptococcus mutans
Campo de Acción
Actividad antimicrobiana del aceite esencial y extracto etanólico de Daucus carota frente a Streptococcus mutans.
Identificación de la Línea de Investigación
Estudios Microbiológicos Objetivo General
Evaluar el efecto in vitro antimicrobiano de aceite esencial y extracto etanólico de Daucus carota frente a Streptococcus mutans
Objetivos Específicos
• Analizar los compuesto fitoquímicos de Daucus carota mediante revisión bibliográfica.
• Extraer el aceite esencial y extracto etanólico de Daucus carota
mediante destilación de arrastre de vapor.
• Medir la actividad bactericida y/o bacteriostática del extracto etanólico y aceite esencial de Daucus carota mediante un ensayo microbiológico in vitro frente a Streptococcus mutans.
Hipótesis
Hipótesis alternativa (H1): El aceite esencial y extracto etanólico de Daucus carota a diferentes concentraciones tiene efecto antimicrobiano frente al
Streptococcus mutans.
Hipótesis nula (H0): El aceite esencial y extracto etanólico de Daucus carota a diferentes concentraciones no tiene efecto antimicrobiano frente al
Streptococcus mutans. Justificación Del Tema
Las enfermedades periodontales tienen una alta prevalencia constituyendo un problema de salud pública, el uso de aceites esenciales se han estudiado como agentes antimicrobianos por su amplio espectro de inhibición microbiana y su origen natural, además tienen una probada actividad antimicrobiana contra las bacterias de la cavidad oral, pero también han manifestado efectos secundarios adversos, no satisfaciendo completamente los requerimientos para el tratamiento de la enfermedad periodontal.
Con el estudio etnofarmacológico se pretende determinar el valor de uso de las plantas y cuales acorde a la experiencia de las comunidades vale la pena emprender una investigación.
Metodología
En la presente investigación estuvo dividido en tres etapas: mediante el estudio etnofarmacológico está dado bajo la modalidad cuali-cuantitativa de tipo descriptiva y exploratoria, se utilizó la encuesta como instrumento. La segunda etapa consiste en la obtención del aceite esencial y el extracto etanólico de la zanahoria mediante destilación de arrastre de vapor y la tercera etapa está basado en el análisis microbiológico mediante la técnica de difusión en disco por triplicados embebidos en concentraciones de 25%, 50%, 75% y 100%, con un control positivo la Amoxicilina y con el control negativo agua destilada. Para terminar con un análisis estadístico ANOVA que permitirá establecer la discusión final.
Resumen de la estructura de la tesis
• Marco teórico
Epígrafe I. Estudio de la zanahoria
1.1 Generalidades 1.1.1. Taxonomía
1.1.2. Descripción botánica 1.1.3. Usos
1.1.4. Funciones Medicinales
Epígrafe II. Preparación de extractos y aceites de zanahoria
1.2.1. Selección y recolección de especímenes de Daucus carota
1.2.2. Obtención del Aceite Esencial y extracto etanólico de Daucus carota Epígrafe III Estudio de cepas de microorganismos
1.3.1. Streptococcus mutans
1.3.4. Crecimiento
1.3.5. Clasificación del Streptococcus mutans
1.3.6. Transmisión, Colonización y estabilidad de Streptococcus mutans en cavidad oral
1.3.7. Patogenicidad
1.3.8. Mecanismo de Resistencia Antimicrobiana
1.3.9. Resistencia Antimicrobiana del Streptococcus mutans
1.3.10. Potencia o actividad antimicrobiana
1.3.11. Actividad Antimicrobiana de los aceites esenciales 1.3.12. Cepas de control
Epígrafe IV. Métodos de extracción en fitoquímica
1.4.1. Extracción sólido-líquido
1.4.2. Maceración
1.4.3. Percolación o lixiviación
1.4.4. Extracción líquido-líquido
1.4.5. Compuestos fenólicos
1.4.5.1 Análisis de fenoles totales 1.4.5.2 Tamizaje fitoquímico
1.5. Conclusiones Parciales
Elementos de novedad
Aporte Teórico
Significación Práctica
El estudio fitoquímico de la zanahoria y la demostración del efecto antimicrobiano del aceite esencial y extracto etanólico de esta raíz sobre
Streptococcus mutans aportará al desarrollo de fitofármacos que puedan ser usados para prevenir y/o restaurar la salud oral. Un adecuado conocimiento de las bondades terapéuticas de esta hortaliza de amplio cultivo en Ecuador contribuirá al desarrollo de la industria fitoterapéutica aplicando el conocimiento científico en los productos existentes en la naturaleza.
Novedad Científica
La determinación de la actividad antimicrobiana del aceite esencial y del extracto etanólico de la zanahoria permitirá establecer su comportamiento en
CAPÍTULO I. MARCO TEÓRICO
1. Epígrafe I. Estudio de la Zanahoria 1.1. Generalidades
La carota, es una planta herbácea, bienal, que crece entre 30 y 60 cm, con un tallo sólido, rígido. Las hojas son de forma triangular finamente divididas y pinnadas. Las flores son pequeñas de un color blanco opaco, agrupadas en planos, con umbelas densas. Estas umbelas son terminales y de aproximadamente 8-10 cm de ancho (17).
1.1.1. Taxonomía
La zanahoria pertenece a la división magnoliophyta, del orden de las apiales, familia apiaceae, género daucus, especie daucus carota (18).
1.1.2. Descripción botánica
El fruto de la Daucus Carota es pequeño, seco y duro, con pilosidades alrededor. Presenta dos mericarpos y su endospermo crece antes del embrión (19)
1.1.3. Usos
Como zanahoria cultivada, la raíz de D. carota es comestible mientras joven, pero rápidamente se vuelve muy dura como para consumir. Las flores a veces son aplastadas y fritas. Las hojas también son comestibles pero no en grandes cantidades (20)
1.1.4. Funciones Medicinales
Existe reciente evidencia que apunta que gran cantidad de las enfermedades padecidas por el ser humano aparecen en respuesta al estrés oxidativo. El extracto oleico de la Daucus carota presenta alto contenido de fenoles y flavonoides con altísimo poder antioxidante (23)
Se ha demostrado que la fracción de aceite de zanahoria exhibe una composición química única, con significativo poder antioxidante incluso con efecto hepatoprotector en células hepáticas con daño previamente inducido (23).
El aceite esencial de la Daucus carota L. obtenido de las partes aéreas al final del estadio de florecimiento fue reportado como antimicrobiano en contra del germen enteropatógeno Campylobacter jejuni. La molécula responsable de esta acción fue identificada como (E)-metilisoeugenol y la elemicina (24).
1.2. Epígrafe II. Preparación de Extractos y Aceites de Zanahoria
1.2.1. Selección y recolección de especímenes de Daucus carota
Para la obtención de una muestra representativa de la especie vegetal se tomaron alrededor de 500 gramos de planta. Se incluyeron todos los rizomas frescos, sin cortes y sin daños. Se excluyen los rizomas partidos, con daños de putrefacción o inmaduros.
1.2.2. Obtención de Aceite Esencial y Extracto Etanólico de Daucus
carota
1.3. Epígrafe III. Estudio de cepas de microorganismos
1.3.1. Streptococcus mutans
Se ha demostrado que está directamente involucrado en la patogénesis de la caries dental. Sin embargo, utilizando sondas moleculares para la identificación de genes específicos demuestran que los sujetos con actividad de caries poseen una abundancia de especies como S. mutans, lactobacillus y actinomices sp, en contraste con una disminución de especies asociadas al estado de salud como S. parasanguis, abiotrophia defectiva, gemella hemolysans, S. mitis/oralis y sanguis; estas modificaciones en los componentes de la flora y el microecosistema bucal, refleja lo complejo que es la valoración de la actividad y el riesgo de desarrollo de caries dental (25)
1.3.2. Morfología
Streptococcus mutans es un estreptococo α-hemolítico o no hemolítico,
que se visualiza como bacilo cuando se aísla de un medio con pH ácido y como cocácea cuando se sub-cultiva en un medio neutro o alcalino (a lo que debe su nombre) (25)
1.3.3. Reproducción
La reproducción del S. mutans es asexual binaria (26).
1.3.4. Crecimiento
sobre otros medios de cultivo para el aislamiento de estreptococos orales, incluyendo Streptococcus mutans. En el agar MS, muchos estreptococos orales muestran una morfología característica de las colonias (blanquecinas, de bordes definidos, colonias firmes muy adherentes al medio de cultivo) lo cual permite su diferenciación inicial. Usualmente, la placa de agar se cultiva en una atmosfera del 95% de nitrógeno y 5% de dióxido de carbono a 37°C por 1 o 2 días seguida de una incubación en aire por 1 o 2 días. Además de la morfología característica de las colonias, los estreptococos orales pueden diferenciarse por su habilidad para fermentar ciertos azucares (especialmente manitol y sorbitol) y por adherirse a superficies lisas en presencia de sacarosa (27).
1.3.5. Clasificación del Streptococcus Mutans
Con base en la composición y los enlaces de los polisacáridos de la pared celular, estreptococos del grupo mutans se pueden clasificar en 8 serotipos: Streptococcus mutans (serotipos c, e, f y k), Streptococcus sobrinus (serotipos d y g), Streptococcus cricetus (serotipo a), Streptococcus rattus (serotipo b), Streptococcus ferus (serotipo c), Streptococcus macacae (serotipo c) y Streptococcus downei (serotipo h). Se sabe que el serotipo c de S mutans es el tipo predominante en la cavidad oral humana más que las cepas e, d, f y k (27).
Los polisacáridos de la pared celular juegan un papel importante en la colonización de sus nichos ecológicos. Las diferencias en las afinidades para la unión de los antígenos de polisacáridos a los tejidos humanos pueden ser la causa de esta distribución tan variada. Por otro lado, se cree que el ancestro de S mutans haya sido el serotipo c y que las cepas f y e pueden haberse originado por mutaciones del determinante del serotipo c
(27).
1.3.6. Transmisión, Colonización y estabilidad de Streptococcus mutans en cavidad oral
La caries dental es una enfermedad dental transmisible en la cual los
facilitan los procesos de transmisión, la colonización se produzca antes de la aparición de los primeros dientes. Hay dos factores que sugieren que S. mutans pueda aparecer durante la etapa predental: 1) Streptococcus mutans y Streptococcus sobrinus son capaces de colonizar superficies mucosas. 2) Algunos niños desarrollan lesiones de caries poco después de la erupción dental. La colonización temprana de la cavidad oral (antes de la erupción dental) por S. mutans puede aumentar el riesgo de caries y hacer que su desarrollo se produzca a edades más tempranas (27).
Se han identificado unos 52 genotipos diferentes en niños, pero las madres trasmiten cerca de 16 de ellos. Se observa una tendencia hacia la estabilidad de los genotipos transmitidos por las madres, en parte, porque la colonización del genotipo materno pueda interferir con la colonización de otros genotipos. Se ha observado que los niños albergan de uno a cinco genotipos diferentes de S. mutans en diferentes edades. La diversidad genotípica de Streptococcus mutans en cuatro sitios de muestreo (saliva, dorso de la lengua, mucosa alveolar y biopelícula dental) de niños parece ser homogénea, sin embargo, la biopelícula dental es un lugar muy importante dado el gran número de genotipos de Streptococcus mutans y las cepas aisladas. Se ha demostrado un alto grado de homología entre cepas de S. mutans recuperadas de miembros de la misma familia indicando tanto la transmisión vertical y horizontal y una persistente colonización de Streptococcus mutans adquiridos previamente hasta la adultez temprana (27).
1.3.7. Patogenicidad
Se ha demostrado que Streptococcus mutans está directamente involucrado en la patogénesis de la caries dental. Sin embargo, utilizando sondas moleculares para la identificación de genes específicos demuestran que los sujetos con actividad de caries poseen una abundancia de especies como además del S. mutans, el lactobacillus y actinomices sp, en contraste con una disminución de especies asociadas al estado de salud como S. parasanguis, abiotrophia defectiva, gemella hemolysans, S. mitis/oralis y sanguis; estas modificaciones en los componentes de la flora y el microecosistema bucal, reflejan lo complejo que es la valoración de la actividad y el riesgo de desarrollo de caries dental (26).
1.3.8. Mecanismo de Resistencia Antimicrobiana
Sin dudas, el uso excesivo y con frecuencia empírico de los antimicrobianos para el tratamiento de diferentes situaciones clínicas ha conducido a modificaciones de la ecología bacteriana, lo que puede determinar consecuencias fatales para la salud pública (28).
Las bacterias adquieren la capacidad de resistir la acción de los antibióticos por medio de varios mecanismos como la variabilidad genética, la modificación de la permeabilidad de la membrana interna, la extracción del compuesto y la inhibición enzimática, así como por la modificación del blanco ribosomal o la alteración de la composición y el contenido de glicoproteínas de la pared bacteriana (28).
Esta resistencia es transmitida entre microorganismos de un mismo género (transmisión horizontal) y entre microorganismos de géneros diferentes (transmisión vertical). A todo lo anterior se adiciona el hecho de que se dispone de escasos datos de susceptibilidad a los antibióticos y la vigilancia de la resistencia no se lleva a cabo en todos los países (28). 1.3.9. Resistencia Antimicrobiana del Streptococcus Mutans
Los estreptococos orales, normalmente no patógenos, son residentes de la microflora humana; pero pueden actuar como “reservas genéticas” y transferir genes de resistencia a las bacterias transitorias de la cavidad oral, punto de entrada para una gran variedad de microorganismos (29)
cual muestra el efecto de los antibióticos sistémicos sobre la flora constitutiva de la cavidad oral, que podría generar la aparición de infecciones oportunistas como la candidiasis. Cabe anotar que se debe determinar si esta disminución es permanente o transitoria, dadas las altas tasas de recambio bacteriano en el medio oral, ya que en la población general es frecuente encontrar portadores de cepas de S. mutans
resistentes que pasarán inadvertidas mientras no se requiera el uso de amoxicilina. En cuanto a la resistencia a penicilinas, en esta investigación se encontró que el 4,4 % de los individuos eran portadores de cepas de S. mutans resistentes a amoxicilina, lo que corresponde al 5,2 % de las cepas aisladas. Estos resultados contrastan con diferentes investigaciones que han evidenciado porcentajes de cepas resistentes de microrganismos aerobios y anaerobios aisladas de infecciones orofaciales entre el 29 % y el 39 % —incluso a la amoxicilina con ácido clavulánico (12,16-19) —, lo que indica que existen mecanismos diferentes a la producción de β-lactamasas. En estreptococos obtenidos de infecciones odontogénicas agudas en niños, el porcentaje de cepas del S. mutans resistentes a la amoxicilina se encuentra en el 45 % con concentraciones inhibitorias mínimas superiores a los 8 μg/ml, lo que evidencia que, independientemente de la edad, la resistencia de S. mutans se asocia con la ingesta de antibióticos (29)
La resistencia a la penicilina (esto es, Concentración Mínima Inhibitoria – CIM- > 4µg/mL) entre los streptococos mutans ha estado incrementándose alrededor del mundo. La resistencia se debe a alteraciones en las proteínas de unión a la penicilina (PBPs) (30)
1.3.10. Potencia o actividad antimicrobiana
1.3.11. Actividad antimicrobiana de los aceites esenciales
Los ensayos antimicrobianos de los aceites esenciales son en la mayoría de los casos realizados con un objetivo específico y/o aplicación en mente. El seteo experimental debería ser hecho en vista de este objetivo, porque mientras más cerca la situación experimental emule a la situación práctica, más fuerte será su valor predictivo. Los aceites esenciales han sido evaluados para los siguientes propósitos:
- Para monitorear aceites esenciales antimicrobianos o sus constituyentes;
- Para monitorear actividades antisépticas o desinfectantes; - Para monitorear propiedades conservantes para alimentos.
- Para estudiar el posible rol de los aceites esenciales en las interacciones biológicas.
- Para estudiar el posible uso de los aceites esenciales como agentes terapéuticos (31)
1.3.12. Cepas Control
Para que los resultados del antibiograma de discos sean realmente confiables es de primordial importancia, además de los aspectos técnicos, introducir un control de calidad interno mediante el uso de cepas de control
(32)
1.4. Epígrafe IV. Métodos De Extracción En Fitoquímica
sin embargo, en algunos estudios como aquellos relacionados con aromas consideran la absoluta necesidad de la utilización de material vegetal fresco. La polaridad de las sustancias a extraer determina el tipo de solvente, por ende, si se desean extraer mayoritariamente compuestos como esteroles, se requerirá utilizar un solvente como éter de petróleo; el hexano permite una extracción de las cumarinas y para los alcaloides primero se emplea alcohol etílico y posteriormente un ácido diluido. El etanol es un solvente muy utilizado, permitiendo la extracción de sustancias de todas las polaridades, además resulta estable (poco reactivo), se evapora fácilmente y no es caro (33)
1.4.1. Extracción sólido-líquido
Es extraer un componente sólido con el contacto de un disolvente, en fitoquímica la fase portadora sólida sería el material vegetal, y el producto de esta extracción conocido como soluto sería el extracto resultante de este disolvente (33)
1.4.2. Maceración
Se obtienen extractos gracias a un amplio tiempo de contacto que el solvente debe tener con el material vegetal, el cual debe estar pulverizado o molido para lograr una mayor superficie de contacto con el solvente, todo esto a temperatura ambiente. Las agitaciones son recomendables para la homogenización del producto y de este modo influenciar el rendimiento de la extracción; el poder de extracción del solvente se reducirá al pasar el tiempo de contacto con el material vegetal; para este tipo de extractos es útil la protección del recipiente de extracción de la luz solar, debido a la descomposición de sustancias fotolábiles. Después de la filtración se requiere lavar el material vegetal restante con más solvente para la obtención del extracto total (33)
1.4.3. Percolación o lixiviación
detenido del solvente por las partículas del sólido hace que disuelvan la mayor cantidad de metabolitos que sean posibles y por la continua la adición de solvente se logra una alta efectividad
1.4.4. Extracción líquido-líquido
La extracción líquido-líquido se basa en la transferencia de una o varias sustancias desde una fase líquida a otra líquida que no puede mezclarse con la primera sustancia. Esto sucede por el reparto entre las dos fases de compuestos de diversas polaridades. Una fase suele ser acuosa y la otra conocida llamada extractarte es orgánica, esta última es la que transfiere los compuestos.
1.4.5. Compuestos fenólicos
Los compuestos fenólicos, entre los cuales se encuentran los flavonoides, presentan una amplia ubicuidad en la naturaleza. Son responsables del buen funcionamiento de las plantas y, en su relación con el hombre, son utilizados para tratar desordenes cardiovasculares y prevenir algunos cánceres. Poseen una estructura química adecuada para ejercer actividad antioxidante, la cual está íntimamente relacionada con tales propiedades. Para su extracción se utilizan solventes polares cuyo extracto posteriormente se concentra. Los compuestos fenólicos constituyen una de las principales clases de metabolitos secundarios de los vegetales, donde desempeñan diversas funciones fisiológicas
1.4.5.1. Análisis de fenoles totales.
La concentración de fenoles totales en extractos fue medida por espectrofotometría, basándose en una reacción colorimétrica de óxido-reducción. El agente oxidante utilizado fue el reactivo de Folin-Ciocalteu (38).
El ensayo Folin-Ciocalteu se utiliza como medida del contenido en compuestos fenólicos totales en productos vegetales. Se basa en que los compuestos fenólicos reaccionan con el reactivo de Folin-Ciocalteu, a pH básico, dando lugar a una coloración azul susceptible de ser determinada espectrofotométricamente a 765 nm. Este reactivo contiene una mezcla de wolframato sódico y molibdato sódico en ácido fosfórico, y reacciona con los compuestos fenólicos presentes en la muestra. El ácido fosfomolibdotúngstico (formado por las dos sales en el medio ácido), de color amarillo, al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso (35)
El mecanismo de reacción es una reacción redox, por lo que además puede considerarse también, como un método de medida de la actividad antioxidante total. La oxidación de los polifenoles presentes en la muestra, causa la aparición de una coloración azulada que presenta un máximo de absorción a 765 nm, y que se cuantifica por espectrofotometría en base a una recta patrón de ácido gálico (35)
1.4.5.2. Tamizaje fitoquímico
1.5. Conclusiones del capítulo.
➢ El extracto de la Daucus carota presenta alto contenido de fenoles y flavonoides con poder antioxidante.
➢ Los polifenoles pueden transformarse en una herramienta para sustituir
los antibióticos, suministrando un producto de origen natural inocuo para la salud humana.
➢ El S mutans es una bacteria cariogénica que habita en el biofilm de la cavidad bucal, y las cepas más frecuentes son e, d, f y k y su colonización se da alrededor de los seis meses de edad en el primer diente.
➢ El etanol es estable, adecuado y de fácil evaporación durante la
extracción de sustancias de diversas polaridades.
➢ El etanol atraviesa las membranas de las células de las muestras
CAPÍTULO II. MARCO METODOLÓGICO
2. Caracterización del sector
Este trabajo de investigación fue realizado bajo la modalidad cualitativa y cuantitativa, siendo su diseño del tipo cuasi experimental, dado el alcance de la misma.
Se realizó el estudio etnofarmacológico de plantas medicinales en el barrio urbano de Bastión Popular es una cooperativa de vivienda de Guayaquil, cuenta con una población total de 73.655 según el Instituto Nacional de Estadisticas y Censo (INEC 2010)., siendo su temporada de cosecha el cuarto trimestre del año, fueron adquiridas en el Mercado de Sauces 9, al Norte de la ciudad; Guayaquil, es la ciudad más grande y habitada de Ecuador, está ubicada a 4.0 msnm, localizada a una latitud y longitud: 79.9332613, -2.0854446 respectivamente.
2.1. Descripción del proceso metodológico
Existen tres etapas para realizar la investigación: • Estudios etnofarmacològico
• obtención del extracto etanólico y aceite esencial
• Procedimiento microbiológico para determinar el efecto antimicrobiano de la zanahoria frente a S. mutans.
2.1.1. Etapa I: Estudio etnofarmacológico 2.1.1.1. Criterios de inclusión
o Grupo etario de 30 a 60 años de edad, madres de familia y abuelas, conocedoras del uso ancestral de plantas para tratar dolencias.
o Para las encuestas se incluyeron a personas oriundas o que hubieran radicado en Bastión Popular por no menos de 5 años. o Personas sin problemas mentales.
2.1.1.2. Criterios de exclusión
o Personas menores de edad.
o Personas con problemas mentales o discapacidades mentales
2.1.1.3. Materiales y métodos:
El presente trabajo de investigación es de tipo transversal y descriptivo, después se realizó la aplicación de las encuestas etnofarmacológicas de plantas medicinales en la ciudad de Guayaquil en el sector Bastión Popular. Es descriptivo porque se describió la utilización de plantas medicinales por las personas encuestadas y es transversal porque se estudia de forma simultánea en un momento dado.
Las personas encuestadas fueron muestreadas por el método no probabilístico
del tipo cuotas, ya que tienen que cumplir con todos los criterios de inclusión.
En primer lugar, por medio de encuestas se verificará los usos potenciales de
la planta en base al conocimiento popular de los informantes.
Universo y muestra
El sector Bastión Popular de la ciudad de Guayaquil cuenta con un universo de 73.655 personas según el Instituto Nacional de Estadisticas y Censo (INEC 2010).
La utilizada fue una población 2450 personas que se ubican en un grupo etario de mujeres de 30 a 60 años de edad, se aplica la siguiente ecuación:
𝑛 = 𝑁𝑧2 𝑝𝑞 𝑑2 (𝑁 − 1) + 𝑧2 𝑝𝑞
Donde:
N= Tamaño de la población
Z = 1.96 para I.C. igual a 95%
q = 1 - p = Proporción de no ocurrencia del evento
𝒏 = (2) 2450 (0.5)(0.5)
(0.1) 2 (2449 − 1) + (2)2 (0.5)(0.5)
𝒏 = 2450 20.79
El tamaño de la muestra es: 𝒏 = 96,1
Resultando la muestra 96 personas que serán encuestadas, se ubican en un
grupo etario de mujeres de 30 a 60 años de edad, madres de familia y abuelas,
conocedoras del uso ancestral de plantas para tratar dolencias.
2.1.2. Etapa II: Obtención de extracto y aceite esencial 2.1.2.1. Caracterización Botánica
Se realizó la identificación botánica de la Daucus carota en el Herbario de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad de Guayaquil, anexo 2.
2.1.2.2. Criterios de inclusión:
• Todos los rizomas frescos, sin cortes, sin daños
2.1.2.3. Criterios de exclusión:
• Rizomas partidos, con daños de putrefacción, inmaduros
2.1.2.4. Materiales y métodos:
• Equipo de destilación por arrastre con vapor • Balón de extracción
La selección de la Daucus carota se lo hizo mediante un estudio etnofarmacológico, utilizado las fórmulas de muestreo de una proporción, índice de valor de uso (IVU) y nivel de uso significativo (UST).
2.1.3.4.1. Muestreo de una proporción
2.1.3.4.2. Evaluación cuantitativa de la diversidad de especies. Índice de valor de uso (IVU)
Para evaluar las preferencias del pueblo hacia las plantas utilizadas, se empleó
el concepto de Valor de Uso (Philips y Gentry, 1993). Esta valoración muestra la
cantidad de usos que se otorga a una determinada planta. La fórmula es la
siguiente:
𝑉𝑈𝑖𝑠 =𝛴𝑈𝑖𝑠 𝑁𝑖𝑠
Donde:
VUis= es el valor de uso atribuido a una especie particular (s) por un informante (i)
Uis = número de usos mencionado por el informante. Nis= número total de eventos.
Nivel de uso significativo
Para estimar el nivel de uso significativo para cada especie y verificar su
aceptación cultural, se utilizó la metodología propuesta por Germosén Robineau
(1995). Esta metodología, expresa que aquellos usos medicinales que son
citados con una frecuencia superior o igual al 20%, por las personas
encuestadas que usan plantas como primer recurso para un determinado
problema de salud, pueden considerarse significativos desde el punto de vista
de su aceptación cultural y, por lo tanto, merecen su evaluación y validación
cada especie (s), entre el número de informantes encuestados, se propone la
siguiente ecuación:
𝐔𝐒𝐓 = 𝐔𝐬𝐨𝐄𝐬𝐩𝐞𝐜𝐢𝐞(𝐬) 𝟏𝟎𝟎 /𝐍𝐢𝐬
Donde:
Uso Especie (s) = número de citaciones para cada especie.
Nis = número de informantes encuestados.
2.1.2.5. Recolección y acondicionamiento de la materia prima vegetal. Esta investigación será realizada en la ciudad de Guayaquil, Ecuador con la muestra de zanahoria recolectada en los mercados del norte de la ciudad, misma que es consumida como alimento, pero que no ha merecido la suficiente atención como antimicrobiano. Se adquirieron 5 kilos de zanahoria (Daucus carota) fresca en el mercado de Sauces 9 (Guayaquil-Ecuador).
2.1.2.6. Operaciones previas:
• Limpieza: Se eliminaron cuidadosamente las raíces y la tierra adherida, se utilizó cuchillos de acero inoxidables de hoja roma con el fin de separar también las raicillas (14)
• Preparación de la muestra: Se toman las zanahorias y son peladas y cortadas en hojuelas de 1cm de espesor. Se almacena en refrigeración hasta el siguiente proceso.
2.1.2.7. Material vegetal y obtención de los extractos.
Luego de la recolección de las zanahorias bajo el criterio de inclusión se
procedió a su secado a 40°C, posteriormente se trituraron manualmente hasta
lograr una cantidad de 72 g. Se da preferencia al uso de etanol como solvente
porque los compuestos alcohólicos rompen la membrana celular y pueden dar
2.1.2.8. Extracto Etéreo
Pesar 25 g. de droga seca y molida y extraerlos con 200 ml de éter etílico por maceración durante 48 horas. Se obtiene el extracto y el residuo sólido (secar y pesar) (15)
2.1.2.9. Extracto Etanòlico
A la droga agotada con el éter etílico, extraer por maceración con etanol al 75% (tres veces el peso del residuo en volumen) durante 48 horas se obtiene el extracto y el residuo sólido (secar y pesar) (15)
2.1.2.10. Destilación por arrastre de vapor
Se toman 100g de zanahoria secada y triturada bajo criterios de inclusión. Se conservan en refrigeración por un máximo de 2 horas, previo a la destilación. Colocar en el balón A agua destilada, en el balón B la muestra, ensamblar el equipo de destilación para arrastre de vapor y proceder a recoger el destilado, verificar que el lugar tenga ventilación adecuada. Una vez colectado el líquido que debe tener un color blanco lechoso, se procede a sangrarlo con Cloruro de Sodio y extraerlo con cloroformo. Guardar el Aceite esencial obtenido en frascos ámbar de tapa rosca. Repetir el procedimiento hasta agotar la muestra. El proceso llevará alrededor de 3-5 días (35).
2.1.3. Pruebas analíticas
Para todas las pruebas analíticas se trabajaron las muestras por triplicado. 2.1.4. Humedad
Llevar al horno secador las zanahorias previamente trituradas para extraer la humedad de las mismas a 60ºC durante 4 horas (14)
Porcentaje de humedad de la muestra: % H = (p – p”)/ p x 100
2.1.5. Cenizas totales
Con la ayuda de 2 crisoles previamente tarados, pesamos 2 gr. de muestra vegetal seca y molida en cada crisol, y llevamos a la mufla por el lapso de 3 horas a 750ºC, pasado este tiempo dejar en secador y pesar (14)
C=𝑀2−𝑀𝑀1−𝑀𝑋100
M2 = Masa de crisol con cenizas
M1 = Masa de crisol con muestra de ensayo M = Masa de crisol vacío
2.1.5.1. Cenizas Totales en Agua
Pesar 2 g de muestra vegetal seca y molida en dos crisoles respectivamente, llevar a la mufla por 3 horas a 750ºC, pasado este tiempo dejar en secador y pesar (Guanoluisa, 2017).
M2 = Masa de crisol con cenizas
M1 = Masa de crisol con muestra de ensayo
M = Masa de crisol vacío
C=𝑀2−𝑀𝑀1−𝑀𝑋100
2.1.5.2. Cenizas Totales en Ácido Clorhídrico.
transparente. Luego de esto poner el papel filtro con residuo en el crisol correspondiente para llevarlo a la mufla por 2 horas a 750 ºC (14).
2.1.6. Obtención del aceite esencial vegetal
Se procedió a realizar una Destilación por Arrastre de Vapor, se trataron los 5 kilos de zanahoria en un total de 5 días.
2.1.7. Preparación y Obtención de extractos
Estos se obtienen mediante la separación de porciones biológicamente activas presentes en los tejidos de las plantas, con el uso de un solvente (alcohol, agua, mezcla de estos u otro solvente selectivo) y un proceso de extracción adecuado (15)
2.1.4. Etapa III: Procedimiento microbiológico para determinar el efecto antimicrobiano de la zanahoria frente a S. mutans
2.1.4.1. Cepa de microorganismo
Streptococcus mutans ATCC25175
2.1.4.2. Procedimiento Microbiológico
El estudio se realizará con cepas de bacterias de Streptococcus mutans (ATCC 25175), en las cuales no se ha evidenciado contacto alguno con bacterias o solución antimicrobiana; la manipulación de las cepas se hará considerando las respectivas medidas de Bioseguridad.
El aceite esencial y el extracto hidroalcohólico de Daucus Carota al 25%, 50%, 75% y 100% serán embebidos en discos blanco. Se conoce que con el control positivo experimentalmente los halos se inhiben con una dispersión de alrededor de 16 mm.
2.1.4.3. Evaluación de la actividad bacteriana del aceite y extracto preparados con la técnica de difusión en disco.
criterio de sensibilidad positivo de difusión de 16 mm sembrado en cajas Petri con agar Mueller Hinton. Se rotularán las placas indicando el número de ensayo y la posición de los discos, así como también el control positivo (16).
Se harán cultivos bacterianos de Streptococcus mutans (ATCC 25175) usando como medio el agar Mueller Hinton con 5% de sangre desfibrinada de oveja a los cuales se les colocaron discos blanco embebidos con el aceite esencial y extracto hidroalcohólico al 25%, 50%, 75% y 100% (16).
2.1.4.4. Materiales y métodos
Equipos, materiales, instrumentos y sustancias
Equipos
• Incubadora
• Autoclave
• Balanza de precisión
Materiales
• Discos: sensidiscos estériles
• Hisopos estériles
• Gasas
• Bioseguridad: Mascarilla, guantes, mandil
Instrumental
• Placas Petri
• Tubos de ensayo
• Mechero
• Varilla de vidrio
• Pipetas
• Calibrador Vernier
Reactivos y muestras
• Extracto alcohólico al 75%
• Aceite esencial Daucus carota en emulsión de 25%, 50% y 75%
• Amoxicilina
• Agua destilada
• Agar sangre desfibrinada de cordero al 5%
• Agar Muller Hinton
• Alcohol antiséptico
• Cepa liofilizada de Streptococcus mutans ATCC 25175
2.1.4.5. Pruebas microbiológicas.
Se procede al cultivo de las cepas de Streptococcus mutans ATCC 25175 en tubos de ensayo con tapa rosca que contienen el medio Soya Tripticasa, procediéndose a incubarlos a 37°C y así de esta manera obtener colonias jóvenes. Al cumplirse las 24 horas de cultivadas se agrega solución salina estéril, hasta obtener una turbidez semejante al tubo número 1 de la escala de Mac Farland. Es recomendable tratar de girar entre las manos los tubos que contienen a la bacteria estudiada antes de proceder al sembrado, para distribuir los microorganismos adecuadamente.
% 𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑡𝑜𝑟𝑖𝑜 = 𝑀𝑎𝑑𝑖𝑎 𝑑𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 ℎ𝑎𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛
𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 ℎ𝑎𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜 𝑋 100
2.1.4.6. Diluciones del aceite esencial y extracto etanólico
Se realizaron las diluciones para el aceite esencial y extracto etanólico al 25%, 50%, 75% y 100%, aplicando la siguiente ecuación:
V1C1=V2C2
Tabla 1. Diluciones de Extracto etanólico de zanahoria (Daucus Carota) ACEITE ESENCIAL/EXTRACTO
ETANOLICO
Volumen inicial mL
DILUCION
%
VOLUMEN DE DILUCIÓN
Ml
33.33 mL 25 8.33 mL
33.33 mL 50 16.66 mL
33.33 mL 75 24.99 mL
33.33mL 100 33.33 L
2.1.5. Conclusiones del capítulo.
1. La destilación por arrastre de vapor demuestra ser un método eficiente dando como resultado un aceite esencial de alta pureza.
2. El etanol es un solvente muy utilizado, permitiendo la extracción de sustancias de todas las polaridades, además resulta estable (poco reactivo), se evapora fácilmente y no es caro.
3. El extracto etanólico de zanahoria por ser polar, favorecerá la preparación de las diluciones para el procedimiento microbiológico. 4. El extracto etanólico será el vehículo de los polifenoles totales presentes
en la muestra.
CAPÍTULO III. MARCO PROPOSITIVO
ESTUDIO ETNOFARMACOLÓGICO DE PLANTAS MEDICINALES
Las zanahorias se pueden consumir de muy diversas formas, Es un alimento
excelente desde el punto de vista nutricional gracias a su contenido en
vitaminas y minerales. El presente estudio etnofarmacológico fue realizado en
el sector Bastión Popular de la ciudad de Guayaquil. La muestra de
encuestados es de 96 personas se ubica en un grupo etareo que comprende
las edades de 30 a 60 años de edad, que incluyeron madres de familia y
abuelas, conocedores del uso ancestral de plantas para tratar dolencias.
GRAFICO 1. ¿CONOCE UD ALGUNA(S) PLANTA(S) UTILIZADA (S) CON
FINES MEDICINALES?
Fuente: Encuesta Etnofarmacologica Elaborado por el Autor
De acuerdo a la información recabada en una muestra de 96 personas
encuestadas, se pudo establecer que existe un grupo de alrededor de nueve
plantas de amplio uso por sus propiedades terapéuticas.
Así mismo, en la tabla del uso de la planta medicinal que se encuentra a
continuación se aprecia que la Zanahoria es una de las plantas cuya raíz se
usa para tratamientos direccionados a mejorar el cutis, en caso de que en el
rostro se presenten lesiones por acné, patología que suele estar asociada con
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Tabla 2. ¿LA (S) HA UTILIZADO UD ALGUNA VEZ? ¿PARA QUÉ?
PLANTA MEDICINAL
SI/NO INDICACIÓN
ALBAHACA SI CÓLICO MENSTRUAL, INFLAMACION
VIENTRE
COLA DE
CABALLO
SI CISTITIS, CÁLCULO RENAL
ESTEVIA SI ENDULZANTE NATURAL, DIABETES
EUCALIPTO SI BRONQUITIS, PROBLEMAS
RESPIRATORIOS
HIERBA BUENA SI CÓLICO MENSTRUAL, NERVIOS
LLANTÉN SI CISTITIS
MANZANILLA SI DOLOR ESTÓMAGO, INFLAMACIÓN,
INSONMIO
ORÉGANO SI CÓLICO DE GASES
PELUSA DE
CHOCLO
SI CISTITIS, CÁLCULOS RENALES
ROMERO SI CAIDA DE CABELLO, PROBLEMAS
DIGESTIVOS
RUDA SI DESINFLAMATORIO, CÓLICOS DE GASES,
INFECCIONES
SÁBILA SI QUEMADURAS, CÁNCER
VETERABA SI ANEMIA
ZANAHORIA SI PROBLEMAS DE VISIÓN, PIEL, ACNÉ
Evaluación cuantitativa de la diversidad de especies.
• Índice de valor de uso (IVU)
La fórmula es la siguiente:
𝑉𝑈𝑖𝑠 =𝛴𝑈𝑖𝑠 𝑁𝑖𝑠
𝑉𝑈𝑖𝑠 = 3
96 = 0.03
• Nivel de uso significativo (UST)
𝐔𝐒𝐓 = 𝐔𝐬𝐨𝐄𝐬𝐩𝐞𝐜𝐢𝐞(𝐬) 𝟏𝟎𝟎 /𝐍𝐢𝐬
UST= 48* 100/96
UST= 50
Aplicada las ecuaciones del muestreo de una población se obtuvo el 96, el índice de valor de uso dio 0,03% y un nivel de usó significativo de 50 %. Estos resultados determinan que la zanahoria está óptimo como muestra para continuar con los estudios de sus metabolitos secundarios y cumple con la
aceptación cultural para ser utilizado como tratamiento en los problemas de
TABLA 3. INFORMACIÓN ETNOFARMACOLÓGICA DE ZANAHORIA
ZANAHORIA Daucus carota
¿Quién se la indicó o sugirió su uso?
¿En qué
forma la ha utilizado? (Modo de Uso)
Parte Utilizada
¿Cómo la
preparó?
¿Dónde encuentra Ud. las plantas?
¿Durante qué tiempo la utilizó? (Duración del tratamiento)
¿Qué resultado obtuvo con su empleo?
¿La ha
consumido
sola o
conjuntamen- te con otras sustancias?
¿Conoce Ud si esa
planta se ha
estudiado científicamente? SI …..( 83) No …( 13) ¿Por qué vía llegó la
información de
dicho(s) estudio (s)?
¿Conoce alguna precaución que debe tomarse durante el tratamiento?
¿En qué
personas
las ha
usado?
Familiares Mascarilla (acné) Alimento
crudo y
cocido
Raíz, sin piel
Como
mascarilla y aplicar en rostro por 20 minutos. Como ensaladas
crudas o
cocidas, sopas, arroz
Compra. En tienda de abastos y mercados
Un día
Menos de una semana
Un mes
Mejoró Sola. televisión Internet,
con ayuda de terceros
No
exponerse al sol
En Niños Adultos Ancianos
96 48
96
96 48
96
96 40 35 21 40 96 65 18 45 96
96 96 Fuente. Encuesta Etnofarmacològica
De la información recabada en la tabla se puede apreciar que la zanahoria
forma parte de la medicina natural en Ecuador, pero es obvio que aún es bajo
su uso como un antimicrobiano que ayude al control de las lesiones causadas
por acné. Es de fácil adquisición en los centros de abastos, además, el tiempo
que duró el tratamiento es amplio, desde un día hasta un mes, pero en todos
los casos se apreció mejora de la condición, pero no cura total. No se
consumió ni aplicó ningún tratamiento conjunto.
La información es trasmitida de generación en generación, aunque los
encuestados afirman que en los tiempos actuales se ha formalizado dicha
información con estudios científicos de los cuales han tenido conocimiento por
medio de informes en programas de Televisión, y otros por medio de Internet,
con ayuda de terceras personas en el manejo de la tecnología.
El uso de la zanahoria como medicina natural varía según su indicación, ya sea
para tratar afecciones de la piel, donde prevalece su uso en adolescentes;
mientras que en el caso de proveedor de Vitamina A, el consumo es general.
3.1. ANÁLISIS DE RESULTADOS MICROBIOLÓGICOS.
Se determinó el efecto inhibidor del aceite esencial y extracto etanólico de
Daucus Carota al 25%,50%,75% y 100%, sobre el crecimiento in vitro de
Streptococcus Mutans, realizando un análisis estadístico de los datos mediante la aplicación de a prueba estadística de ANOVA de dos vías (two way-ANOVA) Por cada dilución bacteriana de Streptococcus mutans se utilizaron 3 placas de agar Mueller Hinton con sangre desfibrinada de oveja al 5%, se aplicaron los discos previamente impregnado con el aceite esencial y extracto etanólico de
Tabla 4. Escala de Durafford
Nula si es inferior a 8 mm
Sensible de 8 - 14 mm
Sensibilidad mediana de 14 - 20 mm
Sumamente sensible superior a 20 mm
Tabla 5. Promedios de halos de inhibición del S mutans frente al aceite esencial de Daucus carota
HALOS DE INHIBICIÓN (mm)
TOTAL
PROMEDIO
MÍNIMO
MÁXIMO
MEDIANA
DESVIACIÓN ESTÁNDAR CONCENTRACIÓN % P1 P2 P3
CONTROL BLANCO
CONTROL POSITIVO
25 7 6 6 0 16 19 6,33 6 7 6 0,577
50 9 7 7 0 16 23 7,67 7 9 7 1,155
75 11 9 10 0 16 30 10,00 9 11 10 1,000
100 12 10 12 0 16 34 11,33 10 12 12 1,155
Tabla 6. Promedios de halos de inhibición del S mutans frente al extracto alcohólico de Daucus carota
HALOS DE INHIBICIÓN
(mm)
TOTAL
PROMEDIO
MÍNIMO
MÁXIMO
MEDIANA
DESVIACIÓN
ESTÁNDAR
CONCENTRACIÓN % P1 P2 P3
CONTROL
BLANCO
CONTROL
POSITIVO
25
8 7 7 0 16 22 7,33 7 8 7 0,57750
10 8 8 0 16 26 8,67 8 10 8 1,15575
12 10 11 0 16 33 11,00 10 12 11 1,000100
13 11 13 0 16 37 12,33 11 13 13 1,155Tabla 7. Comparación de control positivo versus los tratamientos con las distintas diluciones del aceite esencial.
Bonferroni's multiple comparisons test
Mean Diff,
95,00% CI of diff,
Adjusted P Value
Control (Amoxicilina) vs. T1 (25%) 9,333 6,025 to 12,64 0,0064
Control (Amoxicilina) vs. T2 (50%) 8 2,27 to 13,73 0,0258
Control (Amoxicilina) vs. T3 (75%) 5,667 2,358 to 8,975 0,0172
Control (Amoxicilina) vs. T4
(100%) 4,333 1,025 to 7,642 0,0293
Control (Amoxicilina) vs. Blanco 15,39 12,08 to 18,7 0,0023
En este análisis se buscó comparar el control positivo (amoxicilina); frente a las distintas diluciones del aceite esencial (25%,50%, 75% y 100%), con el propósito de evaluar si existe diferencia estadística. El análisis estadístico llevado a cabo a partir de los datos obtenidos en la experimentación in vitro se muestra en la tabla 7. Determina que existe diferencia estadística al 25% y en blanco con valor de p <0,0023.
Tabla 8. Comparación de efectos entre todos los tratamientos empleados en los ensayos experimentales.
Tukey's multiple comparisons test
Mean Diff,
95,00% CI of diff,
Adjusted P Value
Control (Amoxicilina) vs. T1
(25%) 9,333 9,193 to 9,474 <0,0001
Control (Amoxicilina) vs. T2
(50%) 8 7,859 to 8,141 <0,0001
Control (Amoxicilina) vs. T3
Control (Amoxicilina) vs. T4
(100%) 4,333 4,193 to 4,474 <0,0001
T1 (25%) vs. T2 (50%) -1,333 1,474 to
-1,193 <0,0001
T1 (25%) vs. T3 (75%) -3,667 3,807 to
-3,526 <0,0001
T1 (25%) vs. T4 (100%) -5 5,141 to
-4,859 <0,0001
T2 (50%) vs. T3 (75%) -2,333 2,474 to
-2,193 <0,0001
T2 (50%) vs. T4 (100%) -3,667 3,807 to
-3,526 <0,0001
T3 (75%) vs. T4 (100%) -1,333 1,474 to
-1,193 <0,0001
Gráfico 2. Muestra el efecto de los distintos tratamientos empleados y la significancia estadística encontrada a partir de los análisis.
En el grafico 2 se concluye indicando que el aceite esencial de Daucus carota
