LECHE Y PRODUCTOS LACTEOS. DETERMINACIÓN DEL CALCIFEROL (Vitamina D).

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Ecuatoriana

DETERMINACIÓN DEL CALCIFEROL (Vitamina D).

1. OBJETO

1.1 Esta norma establece el método para determinar el contenido de calciferol o vitamina D.

2. ALCANCE

2.1 En esta norma se describen el método de Shear, que servirá de orientación y un método espectrofotométrico de determinación específica.

3. TERMINOLOGIA

3.1 Calciferol o vitamina D. Substancia orgánica que existe en los alimentos y que su falta causa empobre- cimiento del calcio y, como consecuencia, deformaciones de los huesos.

3.2 Otros términos relacionados con esta norma están definidos en la Norma INEN 3.

4. DISPOSICIONES GENERALES

4.1 Las pipetas aforadas y todo el instrumental usado deberán estar debidamente esterilizados e inspeccionados.

5. METODO DE SHEAR

5.1 Instrumental.

5.1.1 Calentador eléctrico.

5.1.2 Tubos de ensayo.

5.1.3 Baño de agua.

5.2 Reactivos.

5.2.1 Anilina roja (reactivo para análisis).

Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN – Casilla 17-01-3999 – Baquerizo Moreno E8-29 y Almagro – Quito-Ecuador – Prohibida la reproducción

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5 . 2 . 2 Acido clorhídrico concentrado (reactivo para análisis ).

5.2.3 Solución de ensayo. Mezclar 15 cm³ de anilina con 1 cm³ de ácido clorhídrico.

6. PREPARACION DE LA MUESTRA

6.1 Mezclar completamente la leche y/o producto lácteo, sacudiendo el recipiente que lo contiene por varias veces, hasta que la muestra esté homogénea.

6.2 Preparar la muestra para ensayo diluyendo con agua destilada en proporción que se estime conveniente. Si se forma grumos de crema y éstos no se dispersan, calentar la muestra en baño de agua hasta 35° - 40°C. Mezclar cuidadosamente e incorporar cualquier partícula de crema adherida al recipiente y enfriar rápidamente a 18° - 20°C.

6.3 No deben quedar partículas blancas o grumos adheridos a las paredes del recipiente.

7. PROCEDIMIENTO

7.1 La determinación debe realizarse por duplicado sobre la misma muestra preparada.

7.2 Colocar en el tubo de ensayo 3 cm³ de la solución 5.2.3 y 3 cm³ de la solución objeto del ensayo.

7.3 Calentar a ebullición durante un minuto.

7.4 Si a los pocos segundos el líquido toma un color verde que pasa luego al rojo estable, hará presumir existencia de calciferol ( vitamina D ).

8. METODO ESPECTROFOTOMETRICO

8.1 Resumen.

8.1.1 Extracción de la muestra con cloroformo y determinar el contenido de calciferol ( vitamina D ), por lectura en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 500 nm y de 550 nm.

8.2 Instrumental.

8.2.1 Balanza analítica, sensible al 0,1 mg

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8.2.2 Espectrofotómetro con un rayo visible entre 500 nm y 550 nm, equipado con células ópticas de 10 mm.

8.2.3 Erlenmeyer de 250 cm³.

8.2.4 Condensador de reflujo.

8.2.5 Pipetas volumétricas de 1 cm³ y 5 cm³:

8.2.6 Frasco volumétrico de 25 cm³.

8.2.8 Ampolla de separación de 125 cm³.

8.3 Reactivos.

8.3.1 Cloroformo, libre de alcohol. Lavado con agua y secado sobre sulfato de sodio anhidro.

8.3.2 Etanol, al 95 % ( v/v) (reactivo para análisis ).

8.3.3 Glicerina (reactivo para análisis ).

8.3.4 Eter de petróleo, rango de ebullición entre 40⁰ -60 ⁰C.

8.3.5 Solución al 50 % de hidróxido de potasio.

8.3.6 Solución de tricloruro de antimonio. Disolver 20g de cristales secos de tricloruro de antimonio, en 20 cm³ de cloroformo, calentar cuidadosamente. Enfriar, añadir 2-3 cm³ de cloruro de acetil, filtrar dentro de un frasco volumétrico de 100 cm³, hacer a la marca con cloroformo y mezclar cautelosamente. Dejar en reposo 30 minutos antes de usar. Guardar en lugar protegido de la luz y humedad.

8.3.7 Calciferol o vitamina D estándar (reactivo para análisis).

8.3.7.1 Solución estándar de calciferol (vitamina D). Pesar con aproximación al 0,1 mg, 2,5 mg deI reactivo 8.3.7 y transferir a un frasco volumétrico de 100 cm³, disolver en una pequeña cantidad de cloroformo y una vez disuelta llevar a la marca; esta solución contiene 25 ug de calciferol ( vitamina D ), por

cm³.

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8.3.8 Nitrógeno, libre de oxígeno (reactivo para análisis).

9. PREPARACION DE LA MUESTRA

9.1 Mezclar completamente el producto lácteo, sacudiendo el recipiente que lo contiene varias veces, hasta que la muestra esté homogénea.

9.2 Si se forma grumos de crema y éstos no se dispersan, calentar la muestra en baño de agua, a 35° ó 40° C ; mezclar cuidadosamente e incorporar cualquier partícula de crema adherida al recipiente y enfriar rápidamente entre 18° - 20°C .

9.3 No deben quedar partículas blancas o grumos adheridos a las paredes del recipiente.

10. PROCEDIMIENTO

10.1 La determinación debe realizarse por duplicado sobre la misma muestra preparada.

10.2 Pesar con aproximación al 0,1 mg, dos gramos de muestra y transferir a un Erlenmeyer de 250 cm³.

10.3 Agregar 50 cm³ de etanol, 14 cm³ de glicerina y 20 cm³ de la solución de hidróxido de potasio. Colocar en el condensador de reflujo y calentar a ebullición durante 30 minutos, agitando ocasionalmente.

10.4 Añadir 110 cm³ de agua, dejar en reposo por 10 minutos, agitando ocasionalmente. Enfriar y filtrar en un frasco volumétrico de 250 cm³. Lavar el Erlenmeyer y el filtro con etanol, hacer a la marca con el mismo solvente y mezclar.

10.5 Tomar una alícuota de 5 cm³ y colocarlo en una ampolla de separación de 125 cm³ y extraer con cinco volúmenes sucesivos del éter de petróleo, usando en cada extracción 5 cm³ del reactivo.

10.6 Recibir los excedentes en un frasco volumétrico de 25 cm³ y llevar a volumen con éter de petróleo.

10.7 Tomar por duplicado una alícuota de 5 cm³ y evaporar a sequedad en corriente de nitrógeno. Disolver el residuo en 1 cm³ de cloroformo.

10.8 Agregar 9 cm³ de la solución de tricloruro de antimonio, mezclar rápidamente y transferir a la célula óptica de 10 mm. Después de 1,5 a 2 minutos que haya sido agregada la solución de tricloruro de antimonio, medir la absorvancia en una longitud de onda de 500 nm y 550 nm en el espectrofotómetro.

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10.10 Debe realizarse un ensayo en blanco, usando cloroformo, el mismo material, reactivos, cantidades y el mismo procedimiento, en igual forma que para la muestra.

11. CALCULOS

11.1 Restar la lectura de la absorción a 550 nm de la obtenida a 500 nm. Tomar el promedio de las dos lecturas en la solución de la muestra y ésta^, correspondería a A.1. Tomar elpromedio de las dos lecturas en la solución estándar de calciferol y ésta correspondería a A.2.

12 ERRORES DE METODO

12.1 La diferencia entre los dos resultados de una determinación efectuada por duplicado no debe exceder de 0,0001% en caso contrario, debe repetirse la determinación.

13 INFORME DE RESULTADOS

13.1 Como resultado final debe reportarse la media aritmética de los dos resultados de la determinación.

13.2 En el informe de resultados debe indicarse el método usado, el resultado obtenido. Debe mencionarse además cualquier condición no especificada en esta norma o considerada como opcional, así como cualquier circunstancia que pueda haber influido sobre el resultado y debe incluirse los detalles necesarios para la identificación de la muestra.

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APENDICE Z

Z.1 DOCUMENTOS NORMATIVOS A CONSULTAR

INEN 3 Leche y Productos Lácteos. Terminología

Z.2 BASES DE ESTUDIO

Millipore AB 321. Calciferol. Cat No. AB 321. Millipore Corporation, Bedford, Massachusetts. 01730. Ma, 1980.

Norma Sud-africana SABS Method 357. First Revision. Calciferol ( vitamina D ). Content of the tablets. Council of the South African Bureau of Standards, 1977.

Emilio Salazar H. Guía práctica de análisis para el reconocimiento de substancias alimenticias con apuntes sobre alimentación y nutrición, su metabolismo y valor nutritivo. pp. 524. Editorial Dossat. España, 1947

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ORIGINAL:

Fecha de iniciación del estudio:

REVISIÓN:

Fecha de aprobación anterior por Consejo Directivo Oficialización con el Carácter de por Acuerdo No.

publicado en el Registro Oficial No.

Fecha de iniciación del estudio:

Fechas de consulta pública: 1983-04-18 a 1983-06-01

Subcomité Técnico: AL 03.01 Leche y productos lácteos

Fecha de iniciación: Fecha de aprobación: 1983-08-02

Integrantes del Subcomité Técnico:

NOMBRES:

Ing. Anibla Saltos Dr. Marco Morán

Dra. Yolanda de Fuentes Dra. Mónica Sosa de Galárraga Dra. Catherine de Escudero Dr. Alberto Proaño

Dra. Leonor Morales de Navas Dra. Magdalena Báez de Birga Dra. Leonor Orozco

INSTITUCIÓN REPRESENTADA:

UNIVERSIDAD TECNICA DE AMBATO INSTITUTO DE INVESTIGACIONES NUTRICIONALES Y MEDICO SOCIALES - MINISTERIO DE SALUD

INEDECA

IZQUIETA PEREZ – QUITO PASTEURIZADORA QUITO MINISTERIO DE AGRICULTURA IZQUIETA PEREZ – GUAYAQUIL MINISTERIO DE SALUD

INEN

Otros trámites: ♦⁴ Esta norma sin ningún cambio en su contenido fue DESREGULARIZADA, pasando de OBLIGATORIA a VOLUNTARIA, según Resolución de Consejo Directivo de 1998-01-08 y oficializada mediante Acuerdo Ministerial No. 235 de 1998-05-04 publicado en el Registro Oficial No. 321 del 1998-05-20 El Consejo Directivo del INEN aprobó este proyecto de norma en sesión de 1985-02-08

Oficializada como: Obligatoria Por Acuerdo Ministerial No. 304 de 1985-05-14 Registro Oficial No. 202 de 1985-06-07

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Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN

Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN ---- Baquerizo Moreno E8Baquerizo Moreno E8Baquerizo Moreno E8Baquerizo Moreno E8----29 y Av. 6 de Diciembre29 y Av. 6 de Diciembre29 y Av. 6 de Diciembre29 y Av. 6 de Diciembre Casilla 17

Casilla 17 Casilla 17

Casilla 17----01010101----3999 3999 3999 3999 ---- Telfs: (593 2)2 501885 al 2 501891 Telfs: (593 2)2 501885 al 2 501891 Telfs: (593 2)2 501885 al 2 501891 Telfs: (593 2)2 501885 al 2 501891 ---- Fax: (593 2) 2 567815Fax: (593 2) 2 567815Fax: (593 2) 2 567815Fax: (593 2) 2 567815 Dirección General: E

Dirección General: EDirección General: E

Dirección General: E----Mail:direccionMail:direccionMail:[email protected]:[email protected]@[email protected] b.ec .ec .ec Área Técnica de Normalización: E

Área Técnica de Normalización: E Área Técnica de Normalización: E

Área Técnica de Normalización: E----Mail:Mail:Mail:Mail:[email protected]@[email protected]@inen.gobbbb.ec .ec .ec .ec Área Técnica de Certificación: E

Área Técnica de Certificación: E Área Técnica de Certificación: E

Área Técnica de Certificación: E----Mail:Mail:Mail:Mail:[email protected]@[email protected]@inen.gobbb.ec .ec .ec .ec Área Técnica de Verificación: E

Área Técnica de Verificación: E Área Técnica de Verificación: E

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Área Técnica Área Técnica

Área Técnica de Servicios Tecnológicos: Ede Servicios Tecnológicos: Ede Servicios Tecnológicos: Ede Servicios Tecnológicos: E----Mail:Mail:Mail:inenlaboratoriosMail:[email protected]@[email protected]@inen.gobbbb.ec.ec.ec .ec Regional Guayas: E

Regional Guayas: ERegional Guayas: E

Regional Guayas: E----Mail:Mail:Mail:inenguayasMail:[email protected]@[email protected]@inen.gobbb.ec b.ec .ec .ec