Berichrom Heparin. + heparin free > [F Xa-AT III] + F XAresidue > tripeptide + dye. F XA Chromogenic substrate

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OWLD G11 E0532 (1211) H 1

Intended Use and Application

Berichrom Heparin is a chromogenic assay for the determination of the activity of heparin in plasma and for the monitoring of heparin therapy.

Summary and Explanation

Heparin considerably accelerates the inactivation of coagulation factor Xa and thrombin by antithrombin III. For this reason unfractionated and low-molecular-weight heparin prepara-tions are widely used as therapeutic anticoagulants. Due to numerous influences the effect of an identical dose of heparin varies from patient to patient. Using Berichrom Heparin it is possible to monitor therapy both with low-molecular-weight (LMW) and unfractionated heparin preparations.

Principle of the Method

Factor Xa is inactivated by AT III during the incubation phase of the test. This reaction is catalyzed by heparin. Dextran sulfate (DS) releases heparin which has bound to interfering factors and thus makes it accessible to the assay. The quantity of F Xa remaining after the incubation phase is determined via the increase in absorbance at 405 nm, using a chromogenic substrate in a kinetic test.

heparinbound + DS > DSbound + heparinfree

F Xa + AT IIIexcess

heparinsample

> [F Xa-AT III] + F XAresidue

Chromogenic substrate F XAresidue _{> tripeptide + dye}

Reagents

Materials provided

Test kit for 3 x 20 semi-micro tests, Code No. OWLD 3 x for 10 ml Factor Xa Reagent

3 x for 10 ml Dextran Sulfate Reagent 3 x for 11 ml AT III Reagent 3 x for 12 ml Substrate Reagent

Composition

Factor Xa Reagent: lyophilized; human plasma fraction with the additives Tris (6 g/l), sodium

chloride (12 g/l) and EDTA (0.74 g/l) Preservatives: sodium azide (< 1 g/l)

Dextran Sulfate Reagent, lyophilized; concentration in the working solution: 0.02 g/l. AT III Reagent (human), lyophilized; concentration in the working solution: 1 IU/ml.

Preservatives: sodium azide (< 1 g/l)

Substrate Reagent, lyophilized; concentration in the working solution: 4 mmol/l

Z-D-leu-gly-arg-ANBA-methyl amide.

Warnings and precautions

1. For In Vitro Diagnostic Use.

2. Reagents containing sodium azide must be handled with due caution:

Do not ingest or allow to contact skin or mucous membranes! Sodium azide can form explosive azides when contacting heavy metals such as copper or lead!

3. Each individual blood donation for use in manufacture of the Factor Xa Reagent or AT III Reagent is tested for hepatitis B surface antigen, anti-HCV, anti-HIV1 and anti-HIV2 by FDA-required test. Only donations with negative findings are used for manufacture. Furthermore, during the production process, the materials of human origin are heated in solution at +60°C for 10 hours for the purpose of virus inactivation.

Nevertheless, since absence of infectious agents cannot be proven, all materials obtained from human blood should always be handled with due care, observing the precautions recommended for biohazardous material3_.

Reagent preparation

Dextran Sulfate Reagent: Dissolve in the labelled amount of distilled water.

Factor Xa Reagent: Dissolve in the labelled amount of reconstituted Dextran Sulfate Reagent and warm to 37°C before use.

AT III Reagent: Dissolve in the labelled amount of distilled water and warm to room temperature before use.

Substrate Reagent: Dissolve in the labelled amount of distilled water and warm to 37°C before use.

Storage and stability

Store the test kit unopened at +2 to +8°C and use by the expiration date given on the label. Stability after reconstitution:

Temperature Factor Xa AT III Substrate Reagent

+37°C 4 hours – 1 week

+15°C to +25°C 3 days 1 week 2 weeks

+2 to +8°C 2 weeks 2 weeks 6 weeks

–20°C 2 months 2 months 6 months

In the original vial the solutions can be frozen up to 3 times.

Materials required but not provided

Standard Human Plasma, Code No. ORKL Acetic acid 20% (only for the two-point method)

Specimens

To obtain the plasma, carefully mix 1 part sodium citrate solution (0.11 mol/l) with 9 parts venous blood, avoiding the formation of foam. Centrifuge immediately at no less than 1500 x g for at least 10 min.

Stability of the sample:

–20°C 1 month

+15 to +25°C 8 hours

Plasma stored at –20°C is to be thawed within 10 minutes at 37°C after which the assay is to be performed within 8 hours.

Method

Procedure

cuvette: 1 cm path length wavelength: 405 nm test temperature: +37°C

Pre-warm the Factor Xa Reagent, Substrate Reagent and the plastic cuvettes/tubes to 37°C, and the AT III Reagent to room temperature (+15° to +25°C).

Kinetic method

Plasma sample 150 µl

AT III Reagent 150 µl

Factor Xa Reagent 500 µl

Mix and incubate for exactly 1 min at 37°C

Substrate Reagent 100 µl

Mix and determine ∆A405 nm/min

Test mixture for the kinetic test on the Chromotimer: Using the same incubation times the volumes of the solutions used have to be halved.

Manual two-point method (semi-micro test)

Sample Sample blank

Acetic acid 20% – 500 µl

Sample 150 µl 150 µl

AT III Reagent 150 µl 150 µl

Factor Xa Reagent 500 µl 500 µl

Mix and incubate for exactly 1 min at 37°C (timed by instrument)

Substrate Reagent 100 µl 100 µl

Mix immediately and after exactly 1 min add: (timed by instrument)

Acetic acid 20% 500 µl

Mix immediately and determine the absorbance against the blank within 2 hours.

Evaluation

The results are evaluated using a reference curve which must be established prior to the test using the heparin preparation administered for therapy and the same method of analysis. Dilute the treatment heparin to 10 IU/ml with isotonic saline (0.9%), then dilute 100 µl of the resulting dilution with 900 µl of heparin-free pooled plasma or standard plasma (e.g. Standard Human Plasma) to obtain a concentration of 1 IU/ml. The dilutions required for establishing the reference curve (range 0 to 1 IU heparin/ml) are obtained as follows:

heparin normal or standard heparinized

concentration plasma plasma 1 IU/ml

IU/ml µl µl 1.01 1110 1000 0.75 1250 1750 0.51 1500 1500 0.25 1750 1250 0.11 1900 1100 0.11 1000 1110 Notes

1. Doubling or halving the volumes used in the assay mixtures has no effect on the evaluation.

2. The plasma is used in undiluted form. If the values are above the calibrated measurement range, the sample must be diluted with the AT III solution or a heparin-free normal plasma (e.g. Standard Human Plasma); the results obtained are then to be corrected for the dilution factor.

3. If the heparin concentration is very low, the sensitivity of the test system can be increased by prolonging the incubation period to 3 minutes. In this case te results must be evaluated using a reference curve which has similarly been established using a 3-minute incubation period and additional standard dilutions.

4. Special assay protocols for autoanalyzers are available on request.

Internal quality control

Quality control materials containing at least two levels of heparin should be included with each batch of product sample. If the control materials do not produce the expected results, patient results must not be reported.

The following can be used for quality control:

A heparin-free normal plasma (e.g. Control Plasma N). This provides a check on the stability of the reagent and on the zero-point of the reference curve.

A normal plasma adjusted to an appropriate concentration (e.g. 0.5 IU/ml) with the heparin to be assayed. This provides a check on the sensitivity and recovery.

Limitations and interferences

The incubation periods must be exactly observed in order to obtain reproducible results.

Specific Performance Characteristics

Sensitivity

The limit of detection for an unfractionated heparin is 0.05 IU/ml.

Specificity

The heparin determination using Berichrom Heparin is not disturbed by platelet factor 4 (PF4).

Precision and reproducibility

For heparin concentrations of 0.5 IU/ml the coefficient of variation in the series falls between 4.0 and 7.0% and from day to day between 6.9 and 7.1%.

Method comparison

In a comparison of Berichrom Heparin with another chromogenic method correlation coefficients of 0.94 and 0.97 were found.

Bibliography

1. Levine, S. P. et al.: The Effect of Platelet Factor 4 (PF4) on Assays of Plasma Heparin. Brit. J. Haematol. 57 (1984) 585–596

2. Teien, A. N. and Lie, M.: Evaluation of an Amidolytic Heparin Assay Method: Increased Sensitivity by Adding Purified Antithrombin III. Thromb. Res. 10 (1977) 399–410 3. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, U. S. Department of Health

and Human Services, Washington 1993 (HHS Publication No. (CDC) 93–8395) Manufacturer: Dade Behring Marburg GmbH

Emil-von-Behring-Str. 76 D-35041 Marburg/Germany

USA Distributor: Dade Behring Inc.

Newark, DE 19714 U.S.A.

Edition August 2000

Berichrom

®

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OWLD G11 E0532 (1211) H 2

Berichrom

®

Heparin

Anwendungsbereich und -zweck

Berichrom Heparin ist ein chromogener Test zur Bestimmung der Aktivität von Heparin in Plasma und zur Überwachung der Heparintherapie.

Diagnostische Bedeutung

Heparin beschleunigt die Inaktivierung von Gerinnungsfaktor Xa und Thrombin durch Antithrombin III erheblich. Daher finden unfraktionierte und niedermolekulare Heparin-Prä-parate verbreitete therapeutische Anwendung als Antikoagulans. Infolge vielfacher Ein-flüsse schwankt die Heparinwirkung von Patient zu Patient trotz gleicher Dosierung. Mit Berichrom Heparin kann die Therapie sowohl mit niedermolekularen (LMW) als auch mit unfraktionierten Heparin-Präparaten verfolgt werden.

Prinzip der Methode

Faktor Xa wird in der Inkubationsphase durch AT III inaktiviert. Diese Reaktion wird durch Heparin katalysiert. Dextransulfat (DS) setzt an Störfaktoren gebundenes Heparin wieder frei und macht es der Bestimmung zugänglich. Der nach der Inkubationsphase verbliebene Faktor Xa wird in einem kinetischen Test über die Extinktionszunahme bei 405 nm mittels eines chromogenen Substrats bestimmt.

Heparingebunden + DS > DSgebunden + Heparinfrei

F Xa + AT IIIÜberschuß

HeparinProbe

> [F Xa-AT III] + F XARest

Chromogenes Substrat F XARest _{> Tripeptid + Farbstoff}

Reagenzien

Inhalt der Handelspackung

Testkit für 3 x 20 Halbmikro-Ansätze, Bestell Nr. OWLD 3 x für 10 ml Faktor Xa-Reagenz

3 x für 10 ml Dextransulfat-Reagenz 3 x für 11 ml ATIII-Reagenz 3 x für 12 ml Substrat-Reagenz

Zusammensetzung

Faktor Xa-Reagenz: lyophilisiert; Plasma-Fraktion (human) mit Zusatz von Tris (6 g/l),

Natriumchlorid (12 g/l) und EDTA (0,74 g/l) Konservierungsmittel: Natriumazid (< 1 g/l)

Dextransulfat-Reagenz, lyophilisiert; Konzentration in der Gebrauchslösung: 0,02 g/l. AT III-Reagenz (human), lyophilisiert; Konzentration in der Gebrauchslösung: 1 IU/ml.

Konservierungsmittel: Natriumazid (< 1 g/l)

Substrat-Reagenz, lyophilisiert; Konzentration in der Gebrauchslösung:

Z-D-Leu-Gly-Arg-ANBA-methyl-amid 4 mmol/l.

Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen

1. Nur zur in vitro diagnostischen Anwendung

2. Beim Umgang mit Natriumazid-haltigen In-vitro-Diagnostica ist zu beachten: Verschlucken und Kontakt mit Haut oder Schleimhäuten vermeiden. Natriumazid kann mit Schwermetallen, wie Kupfer oder Blei, explosive Azide bilden.

3. Jede individuelle Blutspende, die zur Herstellung von Faktor Xa-Reagenz oder AT III-Reagenz vorgesehen war, wurde auf Hepatitis Bs-Antigen, auf Anti-HCV, auf Anti-HIV1 und auf Anti-HIV2 untersucht. Für die Herstellung wurden nur Spenden mit negativem Befund verwendet.

Außerdem werden die Ausgangsmaterialien humanen Ursprungs beim Herstellungsprozess zur Virusinaktivierung in Lösung 10 Stunden bei +60°C erhitzt.

Unabhängig davon sollten alle aus menschlichem Blut gewonnenen Materialien wegen nie auszuschließender Gefährdung durch Krankheitserreger mit angemessener Sorg-falt unter Einhaltung der bei Biogefährdung empfohlenen Sicherheitsmaßnahmen ge-handhabt werden3_.

Vorbereitung der Reagenzien

Dextransulfat-Reagenz: Mit der auf dem Etikett angegebenen Menge dest. Wasser lösen. Faktor Xa-Reagenz: Mit der auf dem Etikett angegebenen Menge des rekonstituierten Dextransulfat-Reagenzes einlösen und vor Gebrauch auf 37°C temperieren.

AT III-Reagenz: Mit der auf dem Etikett angegebenen Menge dest. Wasser lösen und vor Gebrauch auf Raumtemperatur temperieren.

Substrat-Reagenz: Mit der auf dem Etikett angegebenen Menge dest. Wasser lösen und vor Gebrauch auf 37°C temperieren.

Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen

Der Testkit ist, ungeöffnet bei +2 bis +8°C gelagert, bis zu dem auf dem Etikett angegebe-nen Datum verwendbar.

Haltbarkeit nach Rekonstitution:

Temperatur Faktor Xa AT III Substrat-Reagenz

+37°C 4 Stunden – 1 Woche

+15°C bis +25°C 3 Tage 1 Woche 2 Wochen

+2 bis +8°C 2 Wochen 2 Wochen 6 Wochen

–20°C 2 Monate 2 Monate 6 Monate

Die Lösungen können in der Originalflasche bis zu 3mal eingefroren werden.

Zusätzlich benötigte Materialien

Standard-Human-Plasma, Bestell-Nr. ORKL Essigsäure 20%ig (nur für die Zweipunkt-Methode)

Untersuchungsmaterial

Zur Plasmagewinnung 1 Teil Natriumcitrat-Lösung 0,11 mol/l mit 9 Teilen Venenblut sorg-fältig unter Vermeidung von Schaumbildung mischen. Sofort mindestens10 min bei minde-stens 1500 x g zentrifugieren.

Stabilität der Probe:

–20°C 1 Monat

+15 bis +25°C 8 Stunden

Bei –20°C gelagerte Plasmen innerhalb von 10 min bei 37°C auftauen und die Bestim-mung dann innerhalb von 8 Stunden durchführen.

Methodik

Testdurchführung

Küvette: 1 cm Schichtdicke Wellenlänge: 405 nm Testtemperatur: +37°C

Faktor Xa-Reagenz, Substrat-Reagenz sowie die Kunststoffküvetten bzw. -röhrchen auf 37°C, ATIII-Reagenz auf Raumtemperatur (+15° bis +25°C) vorwärmen.

Kinetische Methode

Probe 150 µl

ATIII-Reagenz 150 µl

Faktor Xa-Reagenz 500 µl

mischen und genau 1 min bei 37°C inkubieren.

Substrat-Reagenz 100 µl

mischen und ∆E405 nm/min bestimmen.

Testansatz für Chromotimer: Bei gleichen Inkubationszeiten ist das Volumen der verwen-deten Lösungen zu halbieren.

Manuelle Zweipunkt-Methode (Halbmikroansatz)

Probe Probenleerwert

Essigsäure 20% – 500 µl

Probe 150 µl 150 µl

ATIII-Reagenz 150 µl 150 µl

Faktor Xa-Reagenz 500 µl 500 µl

mischen und genau 1 min bei 37°C inkubieren.

Substrat-Reagenz 100 µl 100 µl

sofort mischen und nach genau 1 min Zugabe von:

Essigsäure 20% 500 µl

sofort mischen und die Extinktion innerhalb von 2 Stunden gegen den Probenleerwert bestimmen.

Auswertung

Die Auswertung erfolgt anhand einer Bezugskurve, die vorher mit dem verwendeten Heparin-Präparat und der gleichen Analysenmethode zu erstellen ist. Das zur in der Therapie wendete Heparin-Präparat wird mit isotonischer Kochsalzlösung (0,9%) auf 10 IU/ml ver-dünnt. 100 µl dieser Verdünnung mit 900 µl heparinfreiem Pool- oder Standardplasma (z.B. Standard-Human-Plasma) verdünnen, um eine Konzentration von 1 IU/ml zu erhalten. Die Verdünnungen für die Bezugskurve (Bereich 0-1 IU Heparin/ml) erhält man nach folgender Tabelle:

Heparin- Normal- oder Heparinplasma

Konzentration Standardplasma 1 IU/ml

IU/ml µl µl 1,01 1110 1000 0,75 1250 750 0,51 1500 1500 0,25 1750 1250 0,11 1900 1100 0,11 1000 1110 Anmerkungen

1. Eine Volumenverdopplung oder -halbierung hat keine Auswirkung auf die Auswertung. 2. Das Plasma wird unverdünnt eingesetzt. Wenn die Werte oberhalb des kalibrierten Meßbereichs liegen, ist mit der ATIII-Lösung oder einem heparinfreien Normalplasma (z.B. Standard-Human-Plasma) zu verdünnen. Die erhaltenen Ergebnisse sind entspre-chend umzurechnen.

3. Wenn die Heparin-Konzentration sehr niedrig liegt, kann durch die Verlängerung der Inkubationszeit auf 3 Minuten die Empfindlichkeit des Testsystems gesteigert werden. Es muß dann an einer Referenzkurve ausgewertet werden, die ebenfalls mit einer 3-minütigen Inkubation und zusätzlichen Standardverdünnungen erstellt wurde. 4. Spezielle Automatenvorschriften sind auf Anfrage erhältlich.

Interne Qualitätskontrolle

Für jede Meßreihe sollten mindestens zwei Kontrollen mit unterschiedlichen Heparin-Kon-zentrationen mitgeführt werden. Werden die erwarteten Werte nicht gefunden, so können die Ergebnisse der Patientenproben nicht verwertet werden.

Als Kontrolle kann verwendet werden:

Ein heparinfreies Normalplasma (z.B. Kontroll-Plasma N). Damit kann die Stabilität des Reagenzes und der Null-Punkt der Referenzkurve überprüft werden.

Ein mit dem zu messenden Heparin-Präparat auf eine entsprechende Konzentration (z.B. 0,5 IU/ml) gebrachtes Normalplasma (z.B. Kontroll-Plasma N). Damit können Sensitivität und Wiederfindung überprüft werden.

Einschränkungen und Fehlerquellen

Die Inkubationszeiten müssen genau eingehalten werden, um reproduzierbare Ergebnis-se zu erhalten.

Leistungsmerkmale des Tests

Empfindlichkeit

Die Nachweisgrenze für ein unfraktioniertes Heparin lag bei 0,05 IU/ml.

Spezifität

Die Heparin-Bestimmung mit Berichrom Heparin wird durch Plättchenfaktor 4 (PF4) nicht gestört.

Präzision und Reproduzierbarkeit

Für Heparinkonzentrationen von 0,5 IU/ml liegt der Variationskoeffizient in der Serie zwi-schen 4,0 und 7,0% und von Tag zu Tag zwizwi-schen 6,9 und 7,1%.

Methodenvergleich

Bei einem Vergleich von Berichrom Heparin mit einer anderen chromogenen Methode wurden Korrelationskoeffizienten von 0,94 und 0,97 gefunden.

Literatur

and Human Services, Washington 1993 (HHS Publication No. (CDC) 93–8395)

Hersteller: Dade Behring Marburg GmbH

Emil-von-Behring-Str. 76 D-35041 Marburg

Vertreiber Schweiz: Dade Behring AG

Bonnstrasse 9 CH-3186 Düdingen Schweiz

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OWLD G11 E0532 (1211) H 3

Berichrom

®

_Héparine

Domaine d’utilisation et indication

Berichrom Héparine est un test chromogénique pour la détermination de l’activité d’héparine dans le plasma et pour la surveillance des héparinothérapies.

Intérêt diagnostique

L’héparine accélère considérablement l’inactivation du facteur Xa de la coagulation et de la thrombine par l’antithrombine III. Ainsi les préparations d’héparine non-fractionnées et de bas poids moléculaires trouvent-elles une large application thérapeutique comme anti-coagulants. Malgré une posologie identique, de nombreux facteurs influencent l’effet de l’héparine variable d’un patient à l’autre. Le test Berichrom Héparine permet le suivi des traitements utilisant aussi bien des héparines de bas poids moléculaires (HBPM) que des héparines non-fractionnées (HNF).

Principe de la méthode

Pendant la phase d’incubation, le facteur Xa est inactivé par l’AT III. Cette réaction est catalysée par l’héparine. Du sulfate de dextran (SD) libère de nouveau l’héparine liée à des facteurs interférants, et la rend ainsi mesurable. Le F Xa qui subsiste après la phase d’incubation est mesuré dans un test cinétique par l’augmentation de la densité optique à 405 nm à l’aide d’un substrat chromogène.

Héparineliee + SD > SDlié + héparinelibre

F Xa + AT IIIen excés

héparineéchantillon

> [F Xa-AT III] + F XArésiduel

substrat chromogène F XArésiduel _{> tripeptide + colorant}

Réactifs

Contenu du coffret

Coffret pour 3 x 20 semi-micro-tests, code OWLD 3 x pour 10 ml de Réactif F Xa

3 x pour 10 ml de Réactif sulfate de dextran 3 x pour 11 ml de Réactif AT III

3 x pour 12 ml de Réactif substrat

Composition

Réactif F Xa, lyophilisé; fraction plasmatique (humaine) additionnée de Tris (6 g/l), de

chlorure de sodium (12 g/l) et d’EDTA (0,74 g/l). Agents de conservation: azide de sodium (< 1 g/l)

Réactif sulfate de dextran, lyophilisé; concentration dans la solution d’emploi: 0,02 g/l. Réactif AT III (humain), lyophilisé; concentration dans la solution d’emploi: 1 UI/ml

Agents de conservation: azide de sodium (< 1 g/l)

Réactif substrat, lyophilisé; concentration dans la solution d’emploi: 4 mmol/l de

Z-D-Leu-Gly-Arg-ANBA-méthylamide.

Mises en garde et précautions d’emploi

1. Ne doit être employé que pour un usage in vitro

2. Les réactifs contenant de l’azide de sodium doivent être manipulés avec précaution : ne pas avaler et éviter tout contact avec la peau et les muqueuses. L’azide de sodium peut devenir explosif au contact de métaux lourds comme le cuivre ou le plomb. 3. Tout don de sang individuel prévu pour la préparation du Réactif Facteur Xa ou du

Réactif AT III a été testé vis-à-vis de l’antigène de surface de l'Hépatite B, de l’anticorps anti-VHC, de l’anticorps anti-VIH 1 et de l’anticorps anti-VIH 2. Seuls les dons trouvés négatifs ont été utilisés.

Par ailleurs, au cours du processus de fabrication, les produits d’origine humaine en solution sont chauffés 10 heures à +60°C pour inactiver les virus.

Néanmoins, toutes les préparations obtenues à partir de sang humain doivent être manipulées avec les précautions nécessaires en cas de risque biologique, dans la mesure où l’on ne peut exclure totalement un risque d’infection3_.

Préparation des réactifs

Réactif sulfate de dextran: reconstituer le lyophilisat avec la quantité d’eau distillée indiquée sur l’étiquette.

Réactif Facteur Xa: reconstituer le lyophilisat avec la quantité de sulfate de dextran reconstitué indiquée sur l’étiquette, et porter le réactif à +37°C avant son emploi. Réactif AT III: le reconstituer avec la quantité d’eau distillée indiquée sur l’étiquette, puis le porter à la température ambiante avant son emploi.

Réactif substrat: le reconstituer avec la quantité d’eau distillée indiquée sur l’étiquette, et le porter à +37°C avant son emploi.

Stabilités et conditions de conservation

Dans leur conditionnement d’origine non ouvert, les réactifs se conservent à +2/+8°C jusqu’à la date de péremption indiquée sur l’étiquette.

Stabilités après reconstitution:

Température Facteur Xa AT III reactif-substrat

+37°C 4 heures – 1 semaine

+15/+25°C 3 jours 1 semaine 2 semaines

+2/+8°C 2 semaines 2 semaines 6 semaines

–20°C 2 mois 2 mois 6 mois

Les solutions peuvent être congelées jusqu’à 3 fois dans leur flacon d’origine.

Autres réactifs nécessaires

Plasma standard humain, code ORKL

Acide acétique à 20% (uniquement pour la méthode en deux points)

Echantillons de patients

Pour obtenir les plasmas, prélever 1 volume de solution de citrate de sodium (0,11 mol/l) avec 9 volumes de sang veineux, et mélanger avec précaution en évitant la formation de mousse. Centrifuger aussitôt pendant au moins 10 min à au moins 1500 g.

Stabilité de l’échantillon:

à –20°C: 1 mois

à +15/+25°C 8 heures

Les plasmas congelés a –20°C doivent être décongelés en 10 min à 37°C, et testés dans les 8 heures qui suivent.

Méthode

Réalisation du test

Cuve: 1 cm de trajet optique Longueur d’onde: 405 nm

Température du test: +37°C

Préchauffer le réactif Facteur Xa, le réactif substrat ainsi que les cuves ou tubes plastique à +37°C, et le réactif AT III à la température ambiante (+15/+25°C).

Méthode cinétique

Echantillon 150 µl

Réactif AT III 150 µl

Réactif Facteur Xa 500 µl

Mélanger et laisser incuber exactement 1 min à +37°C

Réactif substrat 100 µl

Mélanger et mesurer la ∆ D.O.405 nm/min.

Protocole sur le Chromotimer: pour les mêmes temps d’incubation, diviser les volumes indiqués par deux.

Méthode manuelle en deux points (semi-micro-test)

échantillon blanc-échantillon

Acide acétique à 20% – 500 µl

Echantillon 150 µl 150 µl

Réactif AT III 150 µl 150 µl

Réactif Facteur Xa 500 µl 500 µl

Mélanger et laisser incuber exactement 1 min à +37°C.

Réactif substrat 100 µl 100 µl

Mélanger aussitôt, et après exactement 1 min, ajouter:

Acide acétique à 20% 500 µl

Mélanger aussitôt et mesurer la densité optique dans les 2 heures contre le blanc-échantillon.

Exploitation des résultats

L’exploitation des résultats se fait à l’aide d’une courbe d’étalonnage établie préalablement selon la même méthode avec la préparation d’héparine utilisée. Diluer la préparation d’héparine utilisée pour la thérapie en solution saline isotonique (0,9%) et la porter à 10 UI/ml. Rediluer 100 µl de cette dilution avec 900 µl d’un pool de plasmas exempt d’héparine ou d’un plasma standard (par ex. le Plasma standard humain), de façon à obtenir une concentration de 1 UI/ml. Pour les dilutions à établir pour la courbe d’étalonnage (domaine allant de 0 à 1 UI d’héparine/ml), se reporter au tableau ci-dessous:

concentration plasma normal plasma hépariné

d’héparine ou standard à 1 UI/ml

UI/ml µl µl 1,05 1000 1000 0,75 1250 1750 0,55 1500 1500 0,25 1750 1250 0,15 1900 1100 0,25 1000 1000 Remarques

1. La multiplication ou la division par deux des prises d’essai n’a pas d’influence sur l’exploitation des résultats.

2. Utiliser le plasma non dilué. Si les valeurs trouvées sont supérieures au domaine de mesure étalonné, diluer les échantillons avec la solution d’AT III ou un plasma normal exempt d’héparine (par ex. le Plasma standard humain). Diviser ensuite les résultats selon le facteur de dilution utilisé.

3. Lorsque la concentration d’héparine est très faible, on peut augmenter la sensibilité du test en allongeant le temps d’incubation à 3 minutes. Il faut alors exploiter les résultats sur une courbe d’étalonnage établie avec également 3 minutes d’incubation et avec des dilutions du standard complémentaires.

4. Les protocoles spécifiques pour automates sont envoyés sur demande.

Contrôle de qualité interne

Pour chaque série de mesures, introduire au moins deux contrôles ayant des concentrations d’héparine différentes. Si les valeurs attendues ne sont pas retrouvées, les résultats des échantillons de patients ne peuvent pas être exploités.

Comme contrôle on peut utiliser:

Un plasma normal exempt d’héparine (par ex. le Plasma de contrôle N), pour le contrôle de la stabilité du réactif et du point zéro de la courbe d’étalonnage.

Un plasma normal amené à la concentration voulue (par ex. 0,5 UI/ml) à l’aide de l’héparine à mesurer (par ex. le Plasma de contrôle N), pour le contrôle de sensibilité et de restitution.

Limites du test et sources d’erreurs

Les temps d’incubation doivent être scrupuleusement respectés si l’on veut obtenir des résultats reproductibles.

Caractéristiques du test

Sensibilité

La limite de mise en évidence pour une héparine non-fractionnée est de 0,05 UI/ml.

Spécificité

Le dosage de l’héparine à l’aide du test Berichrom Héparine n’est pas perturbé par le facteur 4 plaquettaire (PF4).

Précision et reproductibilité

A des concentrations d’héparine de 0,5 UI/ml, le coefficient de corrélation dans la série varie de 4,0% à 7,0%, et le coefficient de corrélation de jour à jour varie de 6,9% à 7,1%.

Comparaison avec une autre méthode

Une comparaison du Berichrom Héparine avec une autre méthode chromogénique a donné des coefficients de corrélation entre 0,94 et 0,97.

Littérature

France: Fabriqué par Dade Behring Marburg GmbH, Marburg (Allemagne), et

commer-cialisé en France par Dade Behring S.A., Immeuble Berkeley, 19/29 rue du Capitaine Guynemer, 92903 Paris-La Défense

Ce test est enregistré auprès de l'Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé

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OWLD G11 E0532 (1211) H 4

Berichrom

®

Eparina

Settori d’impiego e funzione

Determinazione dell’attività dell’eparina nel plasma per il controllo della terapia eparinica.

Significato diagnostico

L’eparina accelera notevolmente l’inattivazione del fattore di coagulazione Xa e della trombina tramite l’antitrombina III. I preparati eparinici non frazionati e quelli a basso peso molecolare hanno pertanto un diffuso impiego terapeutico come anticoagulanti. In considerazione dei molteplici effetti l’azione dell’eparina può essere diversa da paziente a paziente a parità di dosaggio. Con il Berichrom®_{Eparina e possibile seguire terapie che}

impiegano sia eparine a basso peso molecolare (LMW) sia preparati eparinici non frazionati.

Principio del metodo

Il fattore Xa viene inattivato dall’AT III durante la fase di incubazione del test. Questa reazione viene catalizzata dall’eparina. Il solfato di destrano (DS) rilascia di nuovo l’eparina legata a fattori interferenti e in questo modo rende possibile la determinazione. Il F Xa residuo dopo la fase dell’incubazione viene determinato mediante un test cinetico in base all’aumento dell’estinzione a 405 nm utilizzando un substrato cromogenico.

Eparinalegata + DS > DSlegato + Eparinalibera

F Xa + AT IIIeccesso

eparinacampione _{> [F Xa-AT III] + F Xa} residuo

Substrato cromogenico F XAresiduo _{> Tripeptide + colorante}

Reagenti

Contenuto della confezione

Kit da 3 x 20 determinazioni semimicro, codice WLD 3 flaconi da 10 mL di reagente F Xa

3 flaconi da 10 mL di reagente solfato di destrano 3 flaconi da 11 mL di reagente AT III

3 flaconi da 12 mL di reagente substrato

Composizione

Reagente F Xa, liofilizzato; frazione di plasma (umano) con l’aggiunta di Tampone Tris (6

g/L), cloruro di sodio (12 g/L) e EDTA (0,74 g/L). Conservanti: sodio azide (< 1 g/L)

Reagente solfato di destrano, liofilizzato; concentrazione della soluzione d’uso:

0,02 g/L.

Reagente AT III (umana), liofilizzato; concentrazione della soluzione d’uso: 1 UI/mL.

Agents de conservation: sodio azide (< 1 g/L)

Reagente substrato, liofilizzato; concentrazione della soluzione d’uso:

Z-D-Leu-Gli-Arg-ANBA-metilamide 4 mmol/L.

Avvertenze e precauzioni

1. Solo per uso diagnostico in-vitro

2. Quando si impiegano diagnostici in vitro contenenti sodio azide osservare le seguenti precauzioni: non ingerire ed evitare contatti con la cute e le mucose.

La sodio azide a contatto con metalli pesanti, come rame e/o piombo, può formare azidi esplosive.

3. Ogni donazione di sangue utilizzata per la produzione del reagente F Xa o del reagente AT III è stata esaminata per la ricerca dell’antigene di superficie del virus dell’epatite B e degli anticorpi anti-HCV, anti-HIV1 e anti-HIV2 secondo i test richiesti dall'FDA. Solo i campioni risultati negativi sono stati impiegati per la produzione.

Solo i prelievi che risultano negativi vengono impiegati per la produzione. Inoltre i derivati di origine umana durante la fase di produzione vengono riscaldati in soluzione per 10 ore a +60°C per l’inattivazione del virus.

Tuttavia, tutti i derivati da sangue umano devono essere trattati con le necessarie precauzioni rispettando le norme di sicurezza sul rischio biologico, in quanto non è possibile escludere con assoluta certezza il pericolo di agenti patogeni3_.

Preparazione dei reagenti

Reagente solfato di destrano: sciogliere con la quantità di acqua distillata indicata sulla etichetta. Reagente Fattore Xa: sciogliere con il reagente di solfato di destrano ricostituito secondo la quantità indicata sulla etichetta e portare a 37°C prima dell’uso.

Reagente AT III: sciogliere con la quantità di acqua distillata indicata sull’etichetta e portare a temperatura ambiente prima dell’uso.

Reagente substrato: sciogliere con la quantità di acqua distillata indicata sull`etichetta e portare a 37°C prima dell’uso.

Conservazione e validità

Il kit può essere utilizzato fino alla data di scadenza indicata sull’etichetta, se conservato sigillato a +2°/+8°C.

Validità dopo ricostituzione:

Temperatura Fattore Xa AT III Reagente-Substrato

+37°C 4 ore – 1 settimana

+15/+25°C 3 giorni 1 settimana 2 settimane

+2/+8°C 2 settimane 2 settimane 6 settimane

–20°C 2 mesi 2 mesi 6 mesi

Le soluzioni possono essere congelate nella confezione originale per un massimo di 3 volte.

Materiale necessario supplementare

Plasma umano standard, codice RKL

Acido acetico al 20% (soltanto per il metodo a due punti)

Campioni in esame

Mescolare accuratamente, evitando la formazione di schiuma, 1 parte della soluzione di citrato di sodio (0,11 mol/L) con 9 parti di sangue venoso. Centrifugare subito per almeno 10 min. ad almeno 1500 x g.

Stabilità del campione: 1 mese a –20°C 8 ore a +15°/+25°C

Scongelare entro 10 min a 37°C i plasmi conservati a –20°C ed effettuare la determinazione entro 8 ore.

Metodica

Esecuzione del test

Cuvetta: 1 cm di percorso ottico Lunghezza d’onda: 405 nm

Temperatura del test: +37°C

Portare a temperatura di +37°C il reagente F Xa, il reagente substrato e le cuvette e/o provette di plastica e portare a temperatura ambiente (+15°/+25°C) il Reagente AT III.

Metodo cinetico

Campione 150 µL

Reagente AT III 150 µL

Reagente Fattore Xa 500 µL

Mescolare ed incubare a +37°C esattamente per 1 min

Reagente substrato 100 µL

Mescolare e determinare il ∆ E405 nm/min.

Esecuzione del test con il Chromotimer: mantenendo gli stessi tempi di incubazione dimezzare il volume delle soluzioni impiegate.

Metodo manuale a due punti (determinazione semimicro)

campione bianco campione

Acido acetico al 20% – 500 µL

Campione 150 µL 150 µL

Reagente AT III 150 µL 150 µL

Reagente fattore Xa 500 µL 500 µL

Mescolare ed incubare a +37°C esattamente per 1 min.

Reagente substrato 100 µL 100 µL

Mescolare immediatamente e dopo 1 min esatto aggiungere:

Acido acetico al 20% 500 µL

Mescolare immediatamente e determinare entro 2 ore l’estinzione contro il bianco campione.

Valutazione

I risultati vengono valutati sulla base di una curva di calibrazione allestita mediante il prepa-rato eparinico utilizzato per la terapia rispettando gli stessi tempi di incubazione. Diluire tale preparato a 10 UI/mL con soluzione isotonica salina (0,9%). Diluire quindi 100 µL della diluizione risultante con 900 µL di una miscela di plasmi o con plasma standard esenti da eparina (ad es. Plasma umano standard) per ottenere una concentrazione di 1 UI/mL. Le diluizioni richieste per preparare la curva di calibrazione (ambito da 0 a 1 UI di eparina/ mL) si possono desumere dalla seguente tabella:

Concentrazione Plasma standard o Plasma eparinizzato

di eparina normale 1 UI/mL

UI/mL µL µL 1,05 1000 1000 0,75 1250 1750 0,55 1500 1500 0,25 1750 1250 0,15 1900 1100 0,25 1000 1000 Note

1. Il raddoppio o il dimezzamento dei volumi nel test non influenza la valutazione o il fattore interno del laboratorio.

2. Il plasma viene utilizzato indiluito. Se i valori sono al di sopra dell’ambito di misura corrispondente alla calibrazione, il plasma deve essere prediluito con la soluzione AT III o con un plasma normale senza eparina (ad es plasma umano standard). I risultati ottenuti devono essere convertiti corrispondentemente.

3. Se la concentrazione di eparina è molto bassa, la sensibilita del sistema per il test può essere aumentata prolungando il tempo di incubazione a 3 minuti. Si deve quindi fare una valutazione sulla base della curva di riferimento, calcolata con un tempo di incubazione di 3 minuti.

4. Su richiesta si possono ricevere speciali protocolli per l’esecuzione in automazione.

Controllo di qualità interno

Per ciascuna serie di valutazioni devono essere condotti almeno due controlli con differenti concentrazioni di eparina. Se non vengono riscontrati i valori attesi, i risultati dei campioni dei pazienti non possono essere utilizzati.

Come controlli possono essere utilizzati:

un plasma normale non contenente eparina (ad es. plasma di controllo N). Mediante tale controllo è possibile esaminare sia la stabilità del reagente sia il punto zero della curva; un plasma normale (ad es. plasma di controllo N) portato ad una concentrazione adeguata (ad es. 0,5 UI/mL) con l’eparina da dosare. Mediante tale controllo è possibile valutare sia la sensibilità che la riproducibilità.

Limitazioni e fonti di errore

Per ottenere risultati riproducibili è necessario attenersi esattamente ai tempi di incubazione.

Caratteristiche del test

Sensibilità

Il limite di identificazione per l’eparina non frazionata è 0,05 UI/mL.

Specificità

La determinazione dell’eparina con il Berichrom Eparina non viene influenzata dal fattore piastrinico 4 (PF4).

Precisione e riproducibilità

Con una concentrazione eparinica di 0,5 UI/mL, il coefficiente di variazione nella serie è tra 4,0 e 7,0% e quello inter-assay tra 6,9 e 7,1%.

Confronto tra metodi

Dal confronto fra Berichrom Eparina e altri metodi cromogenici sono stati trovati coefficienti di correlazione di 0,94 e 0,97.

Bibliografia

2. Teien, A. N. e Lie, M.: Evaluation of an Amidolytic Heparin Assay Method: Increased Sensitivity by Adding Purified Antithrombin III. Thromb. Res. 10, (1977) 399–410 3. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, U.S. Department of Health

Confezioni originali: Dade Behring Marburg GmbH

Emil-von-Behring-Str. 76 D-35041 Marburg

Rappresentante per l'Italia: Dade Behring SPA

Via Lampedusa 11/A 20141 Milano/Italy

(5)

OWLD G11 E0532 (1211) H 5

Berichrom

®

Heparina

Campo de aplicación y finalidad de su empleo

Berichrom Heparina es una prueba cromógena para la determinación de la actividad heparínica en el plasma y para el control de la terapéutica heparínica.

Importancia diagnóstica

La heparina acelera considerablemente la inactivacion del factor de coagulación Xa y de la trombina mediante la antitrombina III. Por ello, el uso de los preparados de heparina sin fraccionar y de bajo peso molecular encuentran un dilatado campo de aplicación como anticoagulantes. Aun con la misma dosificación, el efecto de la heparina varía de un paciente a otro, pues está sometido a la influencia de múltiples factores. Con Berichrom Heparina se puede controlar tanto la terapéutica con preparados heparínicos de bajo peso molecular (LMW) como con preparados de heparina sin fraccionar.

Principio del método

El factor Xa es inactivado por el reactivo AT III durante la fase de incubación. Esta reacción es catalizada mediante heparina. El dextransulfato (DS) libera la heparina fijada en los factores de perturbación y hace posible su determinación. El factor Xa restante después de la fase de incubación se determina en una prueba cinética mediante el aumento de la extinción a 405 nm utilizando un sustrato cromógeno.

heparinafijada + DS > DSfijado + heparinalibre

F Xa + AT IIIexcedente

heparinamuestra _{> [F Xa-AT III] + F XA} resto

sustrato cromógeno F XAresto _{> tripéptido + colorante}

Reactivos

Contenido del envase

Equipo de prueba para 3 x 20 semimicrodeterminaciones, N° de pedido OWLD 3 x para 10 ml de Reactivo Factor Xa

3 x para 10 ml de Reactivo de dextransulfato 3 x para 11 ml de Reactivo AT III

3 x para 12 ml de Reactivo sustrato

Composición

Reactivo de Factor Xa, liofilizado; fracción de plasma (humano) con adición de Tris

(6 g/l), cloruro de sodio (12 g/l) y EDTA (0,74 g/l) Agentes de conservación: azida sódica (< 1 g/l)

Reactivo de dextransulfato, liofilizado; concentración en la solución de uso: 0,02 g/l Reactivo AT III (humano), liofilizado; concentración en la solución de uso: 1 UI/ml

Agentes de conservación: azida sódica (< 1 g/l)

Reactivo sustrato, liofilizado; concentración en la solución de uso: 4 mmol/l de

Z-D-Leu-Gly-Arg-ANBA-metilamida

Advertencias y medidas de precaución

1. Sólo para ser utilizado en diagnósticos in-vitro

2. En el manejo de diagnóticos in-vitro que contengan azida sódica se debe observar: No ingerir y evitar el contacto con la piel y mucosas. La azida sódica puede formar azidas explosivas con metales pesados como cobre y plomo.

3. Cada donación individual de sangre destinada a la preparación del Reactivo de Factor Xa o de Reactivo AT III ha sido investigada para detectar la presencia del HBsAg, anti-HCV, anti-HIV1 y anti-HIV2. En la elaboración sólo se utilizan donaciones con resultados negativos.

Además, durante el proceso de fabricación de los materiales de origen humano, los virus son inactivados por calentamiento de la solución durante 10 horas a +60°C. Independientemente de esto, todos los materiales obtenidos a partir de sangre humana deben ser manipulados con las precauciones necesarias, siguiendo las medidas de seguridad recomendadas en caso de riesgo biológico, puesto que nunca se puede excluir completamente la existencia de agentes patógenos3_.

Preparación de los reactivos

Reactivo de dextransulfato: disolver con la cantidad de agua destilada indicada en la etiqueta.

Reactivo de Factor Xa: disolver con la cantidad de reactivo de dextransulfato reconstituido indicada en la etiqueta y calentar a +37°C antes de usarlo.

Reactivo AT III: disolver con la cantidad de agua destilada indicada en la etiqueta y llevar a la temperatura ambiente antes de usarlo.

Reactivo sustrato: disolver con la cantidad de agua destilada indicada en la etiqueta y calentar a +37°C antes de usarlo.

Estabilidad y almacenaje

El equipo de prueba, en su envase aún cerrado y conservado entre +2 y +8°C, es utilizable hasta la fecha indicada en la etiqueta.

Estabilidad después de la reconstitución:

Temperatura Factor Xa AT III Reactivo sustrato

+37°C 4 horas – 1 semana

entre +15 y +25°C 3 días 1 semana 2 semanas

entre +2 y +8°C 2 semanas 2 semanas 6 semanas

a –20°C 2 meses 2 meses 6 meses

Las soluciones pueden ser congeladas hasta 3 veces en el frasco original.

Materiales adicionales necesarios

Plasma humano estándar, N° de pedido ORKL

Acido acético al 20% (solamente para el método de dos puntos)

Material a investigar

Para obtener el plasma, mezclar cuidadosamente, evitando la formacion de espuma, 1 parte de solucion de citrato de sodio 0,11 mol/l con 9 partes de sangre venosa. Centrifugar inmediamente por lo menos durante 10 min. a por lo menos 1500 x g.

Estabilidad de la muestra:

a –20°C 1 mes

entre +15 y +25°C 8 horas

Los plasmas mantenidos a –20°C deben ser descongelados en el plazo de 10 min a +37°C y la determinación debe ser realizada dentro de las 8 horas subsiguientes.

Método

realización de la prueba

Cubeta: trayectoria óptica de 1 cm Longitud de onda: 405 nm

Temperatura de la prueba: +37°C

Precalentar el Reactivo de factor Xa, el Reactivo sustrato, así como las cubetas y los tubos plásticos a +37°C y llevar el Reactivo AT III a la temperatura ambiente (entre +15 y +25°C).

Método cinético

Muestra 150 µl

Reactivo AT III 150 µl

Reactivo de factor Xa 500 µl

mezclar e incubar exactamente durante 1 min a +37°C.

Reactivo sustrato 100 µl

mezclar y determinar la ∆ E405 nm/min

Determinación en el Chromotimer: Para los mismos tiempos de incubación hay que reducir a la mitad el volumen de las soluciones empleadas.

Método manual de dos puntos (semimicro determinación)

Muestra Valor de la muestra testigo Acido acético al 20% – 500 µl Muestra 150 µl 150 µl Reactivo AT III 150 µl 150 µl Reactivo de factor Xa 500 µl 500 µl

mezclar e incubar exactamente durante 1 min a +37°C.

Reactivo sustrato 100 µl 100 µl

mezclar de inmediato y luego de exactamente 1 min agregar:

Acido acético al 20% 500 µl

mezclar de inmediato y, dentro del plazo de 2 horas, determinar la extinción contra el valor de las muestras testigo.

Valoración

La valoración se efectúa utilizando una curva de referencia trazada previamente con el preparado de heparina empleado y con el mismo método analítico. El preparado heparínico a utilizar se diluye con solución isotónica de cloruro de sodio (0,9%) hasta alcanzar 10 UI/ml. Diluir 100 µl de esta dilución con 900 µl de una mezcla de plasma libre de heparina o de plasma estándar (por ej. Plasma humano estándar) a fin de lograr una concentración de 1 UI/ml. Las diluciones para la curva de referencia (zona de 0 a 1 UI de heparina/ml) se obtienen de acuerdo a la siguiente tabla:

Concentración Plasma normal o Plasma heparínico

de heparina plasma estándar 1 UI/ml

UI/ml µl µl 1,05 1000 1000 0,75 1250 1750 0,55 1500 1500 0,25 1750 1250 0,15 1900 1100 0 15 1000 1000 Notas

1. La duplicación o la división por dos del volumen utilizado en la determinación no ejercen ninguna influencia sobre la valoración.

2. El plasma se utiliza sin diluir. Cuando los valores se encuentran por encima de la zona calibrada de medida, hay que diluirlo con la solución de AT III o con un plasma normal libre de heparina (por ej. Plasma humano estándar). Los resultados obtenidos deben ser calculados en la forma correspondiente.

3. Cuando la concentración de heparina es muy baja, se puede aumentar la sensibilidad de la prueba prolongando el tiempo de incubación a 3 minutos. En este caso hay que efectuar la valoración con una curva de referencia trazada también con una incubación de 3 minutos y diluciones adicionales del estándar.

4. Las instrucciones especiales para los aparatos automáticos se obtienen a solicitud del interesado.

Control de calidad

Para cada serie de medidas se deben efectuar simultáneamente por lo menos dos controles con diferentes concentraciones de heparina. Si no se obtienen los valores esperados, los resultados de las muestras de los pacientes no pueden ser valorados.

Como controles se pueden utilizar:

Un plasma normal libre de heparina (por ej. Plasma N de control). Con él se pueden verificar la estabilidad del reactivo y el punto cero de la curva de referencia.

Un plasma normal (por ej. Plasma N de control) llevado a una determinada concentración (por ej. 0,5 UI/ml) mediante el preparado de heparina a analizar. Con él se pueden verificar la sensibilidad y la recuperación.

Limitaciones y fuentes de error

Respetar exactamente los tiempos de incubacion a fin de conseguir resultados repro-ducibles.

Características de rendimiento de la prueba

Sensibilidad

El límite de detección para una heparina sin fraccionar es de 0,05 UI/ml.

Especificidad

La determinación de heparina con Berichrom Heparina no es perturbada por el factor plaquetario 4 (FP4).

Precisión y reproducibilidad

Para las concentraciones de heparina de 0,5 UI/ml el coeficiente de variacion en la serie se halla entre 4,0 y 7,0% y de un dÅa al otro, entre 6,9 y 7,1%.

Comparación de métodos

En una comparación de Berichrom Heparina con otro método cromógeno se encontraron coeficientes de correlación de 0,94 y 0,97.

Bibliografía

Fabricante: Dade Behring Marburg GmbH

(6)

OWLD G11 E0532 (1211) H 6

Dade Behring Marburg GmbH, D-35041 Marburg/Germany

Edição Agosto 2000

Berichrom

®

_Heparina

Campo de aplicação e objectivo

Berichrom Heparina é um teste cromogénico para determinação da actividade de heparina no plasma e na vigilância da terapia pela heparina.

Significado diagnóstico

Heparina acelera notavelmente a inactivação do factor Xa (F Xa) e da trombina por meio de antitrombina (AT) III. Preparados de heparina não fraccionados e de baixo peso molecular têm por isso larga difusão terapêutica como anticoagulantes. Por múltiplas razões, o efeito da heparina varia muito de indivíduo para indivíduo, não obstante igual posologia. O teste Berichrom Heparina permite controlar tratamentos pela heparina, não só por heparinas de baixo peso molecular (HBPM) mas também por heparinas não fraccionadas (HNF).

Princípio metodológico

Durante a fase de incubação, o F Xa é inactivado por AT III. Esta reacção é catalisada pela heparina. Sulfato de dextrano (SD) liberta novamente a heparina ligada a factores interferentes, tornando-a assim mensurável. Mediante um substrato cromógeno, o F Xa residual após a fase de incubação é medido num teste cinético na base do aumento da extinção a 405 nm.

Heparinaligada + SD > SDligado + Heparinalivre

F Xa + AT IIIexcesso

Heparinaamostra

> [F Xa-AT III] + F Xaresidual

Substrato cromógeno F XAresidual _{> tripéptido + corante}

Reagentes

Conteúdo da embalagem comercial

Testkit para 3 x 20 determinações semimicro, código OWLD 3 x para 10 ml Reagente F Xa

3 x para 10 ml Reagente sulfato de dextrano 3 x para 1 ml Reagente AT III

3 x para 2ml Reagente substrato

Composição

Reagente F Xa: liofilizado; fracção plasmática (humana) com adição de tampão Tris (6 g/l),

cloreto de sódio (12 g/l) e EDTA (0,74 g/l) Conservante: azida de sódio (< 1 g/l)

Reagente sulfato de dextrano, liofilizado; concentração da solução de uso: 0,02 g/l Reagente AT III (humano), liofilizado; concentração da solução de uso: 1 UI/ml

Conservante: azida de sódio (< 1 g/l)

Reagente substrato, liofilizado; concentração da solução de uso:

Z-D-Leu-Gli-Arg-ANBA-metilo-amida 4 mmol/l.

Advertências e medidas de precaução

1. Só para uso diagnóstico in vitro.

2. Precauções a observar ao lidar com reagentes para diagnóstico in vitro com teor de azida de sódio:

Evitar ingerir e todo o contacto com a pele ou mucosas!

Com metais pesados, como cobre ou chumbo, a azida de sódio pode formar azidas explosivas!

3. Cada dádiva individual de sangue destinada à preparação de Reagente Factor Xa ou Reagente AT III foi sujeita a testes de detecção de HBsAg, HCV, HIV1 e anti-HIV2. Utilizadas foram unicamente preparações achadas negativas.

Além disso, no decurso da fabricação, todos os materiais de origem humana são aquecidos durante 10 horas em solução a +60 °C para inactivação de vírus. Não obstante, todos os materiais obtidos de sangue humano devem ser manejados com as precauções devidas, seguindo as medidas de segurança recomendadas em caso de risco biológico, uma vez que nunca se pode excluir inteiramente o risco de contaminação por agentes patogénicos3_.

Preparação dos reagentes

Reagente sulfato de dextrano: reconstituir o liofilizado com a quantidade de água destilada indicada no rótulo.

Reagente F Xa: reconstituir o liofilizado com a quantidade de sulfato de dextrano reconstituído indicada no rótulo e levar a +37 °C antes do uso.

Reagente AT III: reconstituir com a quantidade de água destilada indicada no rótulo e levar à temperatura ambiente antes do uso.

Reagente substrato: reconstituir com a quantidade de água destilada indicada no rótulo e levar a +37 °C antes do uso.

Estabilidade e condições de conservação

Não abertos, e conservados entre +2 e +8 °C, os reagentes mantêm-se utilizáveis até à data indicada no rótulo.

Estabilidade após reconstituição:

Temperatura F Xa AT III Reagente substrato

+37°C 4 horas – 1 semana

+15 a +25°C 3 dias 1 semana 2 semanas

+2 a +8°C 2 semanas 2 semanas 6 semanas

–20°C 2 meses 2 meses 6 meses

As soluções podem ser congeladas até 3 vezes nos frascos originais.

Outro material necessário

Plasma humano standard, código ORKL

Ácido acético a 20% (só para o método de dois pontos)

Amostras

Para obtenção do plasma, misturar cuidadosamente, evitando formação de espuma, 1 parte de solução de citrato de sódio (0,11 mol/l) com 9 partes de sangue venoso. Centrifugar imediatamente durante 10 min, pelo menos, a uma velocidade de, pelo menos, 1.500 x g. Estabilidade da amostra:

–20 °C 1 mês

+15 a +25 °C 8 horas

Plasmas conservados a -20 °C devem ser descongelados dentro de 10 min a 37 °C e o teste realizado dentro das 8 horas seguintes.

Método

Procedimento

Cuvete 1 cm de trajecto óptico

Comprimento de onda: 405 nm Temperatura de teste: +37 °C

Levar previamente o reagente Factor Xa e o reagente substrato, assim como os tubos ou cuvetes de plástico, a 37 °C e o reagente AT III à temperatura ambiente (+15 a +25 °C).

Método cinético

Amostra 150 µl

Reagente AT III 150 µl

Reagente Factor Xa 500 µl

misturar e deixar incubar exactamente 1 min a +37 °C

Reagente substrato 100 µl

misturar e medir a ∆ E405 nm/min

Protocolo para o Chromotimer: para os mesmos tempos de incubação, usar a metade dos volumes indicados.

Método de dois pontos (determinação semimicro)

Amostra Branco

Ácido acético al 20% – 500 µl

Amostra 150 µl 150 µl

Reagente AT III 150 µl 150 µl

Reagente Factor Xa 500 µl 500 µl

misturar e deixar incubar exactamente durante 1 min a +37°C.

Reagente substrato 100 µl 100 µl

misturar imediatamente e após exactamente 1 min, adicionar:

Ácido acético a 20% 500 µl

misturar imediatamente e determinar a extinção dentro de 2 horas em confronto com o branco.

Avaliação dos resultados

A avaliação faz-se com base numa curva de referência previamente estabelecida com o preparado de heparina utilizado e segundo o mesmo método de análise. Diluir este a 10 UI/ml em solução salina isotónica (0,9%). Diluir então 100 µl desta diluição com 900 µl de um plasma de pool isento de heparina ou de um plasma standard (por ex. o Plasma standard humano), de modo a obter uma concentração de 1 UI/ml. As proporções de diluição para a curva de referência (âmbito de 0 a 1 UI de heparina/ml) obtêm-se da seguinte tabela:

Concentração Plasma normal Plasma heparinizado

de heparina ou standard 1 UI/ml

UI/ml µl µl 1,05 1000 1000 0,75 1250 1750 0,55 1500 1500 0,25 1750 1250 0,15 1900 1100 0 15 1000 1000 Observações

1. A multiplicação ou divisão dos volumes por 2 não influi nos resultados.

2. Utilizar o plasma sem o diluir. Se os valores forem superiores ao âmbito de medição calibrado, diluir as amostras com solução de AT III ou um plasma normal isento de heparina (por ex. Plasma standard humano). Converter depois de modo correspondente os resultados obtidos.

3. Se a concentração de heparina for muito fraca, pode aumentar-se a sensibilidade do teste prolongado até 3 minutos o tempo de incubação. É então necessário determinar os resultados com uma curva de referência estabelecida igualmente com 3 minutos de incubação e diluições adicionais do standard.

4. Fornecem-se a pedido protocolos específicos para analisadores automáticos.

Controlo interno de qualidade

Para cada série de medições, incluir pelo menos 2 controlos com diferentes concentrações de heparina. Se os valores esperados não forem encontrados, os resultados das amostras de pacientes não podem ser utilizados.

Como controlo, pode utilizar-se:

um plasma normal isento de heparina (por ex. Plasma-controlo N), para o controlo da estabilidade do reagente e do ponto zero da curva de referência;

um plasma normal (por ex. Plasma-controlo N) levado a uma concentração correspondente (por ex. 0,5 UI/ml) ao preparado de heparina a medir, para o controlo da sensibilidade e da reprodutibilidade.

Limitações e fontes de erro

Para se poder obter resultados reproduzíveis, é necessário respeitar exactamente os tempos de incubação.

Características do teste

Sensibilidade

O limite de identificação para heparina não fraccionada é de 0,05 UI/ml.

Especificidade

A determinação de heparina com Berichrom Heparina não é perturbada pelo factor 4 das plaquetas (PF4)

Precisão e reprodutibilidade

Para concentrações de heparina de 0,5 UI/ml, o coeficiente de variação varia entre 4,0 a 7,0% na série, e entre 6,9 e 7,1% no teste de dia a dia.

Comparação de métodos

Numa comparação de Berichrom Heparina com outro método cromogénico foram encontrados coeficientes de correlação de 0,94 e 0,97%.

Bibliografia

Fabricante: Dade Behring Marburg GmbH

Distribuidor: Dade Behring Portugal

Meios de Diagnóstico Médico Lda. Estrada Nacional Lisboa/Sintra, Km 15 Apartado 145