UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
Portada
CARACTERIZACIÓN DE PORTAINJERTOS PARA
CÍTRICOS CON MARCADORES MOLECULARES
MICROSATÉLITES PARA EL ESTUDIO DE LA
DIVERSIDAD GENÉTICA PRESENTE EN ECUADOR
PROYECTO EXPERIMENTAL
Trabajo de titulación presentado como requisito para la obtención del título de
INGENIERO AGRÓNOMO
AUTOR
HAZ ANDRADE LUIS ALBERTO
TUTOR
PhD. DANIEL MANCERO CASTILLO
GUAYAQUIL – ECUADOR 2021
UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
APROBACIÓN DEL TUTOR
Yo, PhD Daniel Mancero Castillo, docente de la Universidad Agraria del Ecuador, en mi calidad de Tutor, certifico que el presente trabajo de titulación: “CARACTERIZACIÓN DE PORTAINJERTOS PARA CÍTRICOS CON MARCADORES MOLECULARES MICROSATÉLITES PARA EL ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA PRESENTE EN ECUADOR”, realizado por el estudiante HAZ ANDRADE LUIS ALBERTO; con cédula de identidad N° 0931061329 de la carrera INGENIERÍA AGRONÓMICA, Unidad Académica Guayaquil, ha sido orientado y revisado durante su ejecución; y cumple con los requisitos técnicos exigidos por la Universidad Agraria del Ecuador; por lo tanto se aprueba la presentación del mismo.
Atentamente,
_________________ Firma del Tutor
UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
APROBACIÓN DEL TRIBUNAL DE SUSTENTACIÓN
Los abajo firmantes, docentes designados por el H. Consejo Directivo como miembros del Tribunal de Sustentación, aprobamos la defensa del trabajo de titulación: “CARACTERIZACIÓN DE PORTAINJERTOS PARA CÍTRICOS CON MARCADORES MOLECULARES MICROSATÉLITES PARA EL ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA PRESENTE EN ECUADOR”, realizado por el estudiante HAZ ANDRADE LUIS ALBERTO, el mismo que cumple con los requisitos exigidos por la Universidad Agraria del Ecuador.
Atentamente,
Ing. Yoansy García Ortega PRESIDENTE
PhD. Sirli Leython Chacon PhD. Armando Vega Rivero
EXAMINADOR PRINCIPAL EXAMINADOR PRINCIPAL
PhD. Daniel Mancero Castillo EXAMINADOR SUPLENTE
Dedicatoria
El presente trabajo investigativo se lo dedico a Dios por darme la fortaleza para continuar en este proceso y alcanzar mis metas. A mis amados padres por su amor, comprensión y por darme una educación integra llena de valores. A mi tía Rosario por darme fortaleza impulsándome a seguir adelante y apoyándome paso a paso como una madre. A mi amada futura esposa Shani Nogales, que me impulso día tras día para terminar mis estudios, amándome y comprendiéndome en todo momento y siendo incondicional. A mi amado hijo Daniel que es mi inspiración y motor para alcanzar mis metas. Finalmente dedico esta tesis a mis primos y amigos por apoyarme cuando más lo he necesitado.
Agradecimientos
Agradezco a Dios por darme salud y ayudarme a cumplir mis objetivos. Al PhD. Daniel Mancero por depositar su confianza y fe, animándome e ilustrándome en cada etapa de este proceso. A mi querida madre Judith Andrade que a más de dármela vida es mi sostén y pilar fundamental apoyarme en cada paso. A mi padre Luis Haz por inculcándome valores y dándome su amor. A mi amigo Kevin Garcés por ser ese apoyo incondicional desde que ingrese a la universidad. A mi primo Julio Morales que me apoyó durante toda mi etapa universitaria. Agradezco a los docentes de la Universidad Agraria del Ecuador, por su aliento, consejos y conocimientos que me han permitido alcanzar una meta más en mi vida.
Autorización de auditoria intelectual
Yo HAZ ANDRADE LUIS ALBERTO, en calidad de autor(a) del proyecto realizado, sobre “CARACTERIZACIÓN DE PORTAINJERTOS PARA CÍTRICOS CON MARCADORES MOLECULARES MICROSATÉLITES PARA EL ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA PRESENTE EN ECUADOR”, para optar el título de INGENIERO AGRONÓMO, por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o parte de los que contienen esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autor(a) me correspondan, con excepción de la presente autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6, 8; 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento.
Guayaquil, 17 de junio del 2021
____________________________ HAZ ANDRADE LUIS ALBERTO C.I. 0931061329
Índice general
Portada ... 1
APROBACIÓN DEL TUTOR ... 2
APROBACIÓN DEL TRIBUNAL DE SUSTENTACIÓN ... 3
Dedicatoria... 4
Agradecimientos ... 5
Autorización de auditoria intelectual ... 6
Índice general ... 7 Índice de tablas ... 10 Índice de figuras ... 11 Resumen ... 12 Abstract ... 13 1. Introducción ... 14
1.1 Antecedentes del problema ... 14
1.2 Planteamiento y formulación del problema ... 16
1.2.1 Planteamiento del problema ... 16
1.2.2 Formulación del problema ... 16
1.3 Justificación ... 16
1.4 Delimitación de la investigación ... 19
1.5 Objetivo general ... 19
1.7 Hipótesis ... 19
2. Marco teórico ... 20
2.1 Estado del arte ... 20
2.2 Bases teóricas ... 22
2.2.1 Portainjertos ... 22
2.2.1.1 Ventajas de los portainjertos ... 22
2.2.2 Extracción de ADN ... 22
2.2.2.1 Protocolos de extracción de ADN ... 23
2.2.4 Reacción en cadena de polimerasa ... 26
2.2.5 Electroforesis ... 27
2.3 Marco legal ... 27
2.3.1 Ley Orgánica Del Régimen De La Soberanía Alimentaria. ... 27
3. Materiales y métodos ... 29 3.1 Enfoque de la investigación. ... 29 3.1.1 Tipo de investigación ... 29 3.2 Metodología. ... 29 3.2.1 Variables. ... 29 3.2.2 Tratamientos ... 31 3.2.3 Diseño experimental ... 31 3.2.4 Recolección de datos... 31 3.2.5 Análisis estadístico ... 37 4. Resultados ... 38
4.1 Diseño de marcadores moleculares microsatélites. ... 38
4.2 Evaluación de los marcadores moleculares microsatélites ... 40
4.2.1 Presencia o ausencia de bandas ... 40
4.2.2 Tamaño y concentración de los fragmentos de banda. ... 41
4.3 Establecimiento del contenido de información polimórfica para los pares de cebadores informativos ... 43
5. Discusión ... 44
6. Conclusión ... 46
7. Recomendación... 47
8. Bibliografía ... 48
Índice de tablas
Tabla 1. Descripción de los factores del proyecto ... 31
Tabla 2. Recursos financieros ... 32
Tabla 3. Contenido del kit de extracción de ADN “DNeasy Plant Mini Kit” ... 34
Tabla 4. Master mix PCR ... 36
Tabla 5. Configuración del Mini PCR ... 36
Tabla 6. Diseño de cebadores ... 39
Tabla 7. Presencia o ausencia de bandas ... 40
Tabla 8. Tamaño y concentración de bandas en gel al 2.5% ... 41
Tabla 9. Tamaño y concentración de bandas en gel al 1.5% ... 42
Índice de figuras
Figura 1. Maceración de muestras ... 54
Figura 2. Preparación del kit de extracción. ... 54
Figura 3. Pipeteo de muestras. ... 54
Figura 4. Suspensión de la muestra ... 55
Figura 5. Muestras en microtubos para su análisis ... 55
Figura 6. Comprobación de extracción de ADN ... 55
Figura 7. Visualización de ADN extraído ... 56
Figura 8. Preparación del PCR ... 56
Figura 9. Master Mix para PCR ... 56
Figura 10. Configuración del PCR ... 57
Figura 11. Preparación del tanque ... 57
Figura 12. Visualicacion en electroforesis en gel de agarosa ... 58
Figura 13. Visualicacion en electroforesis en gel de agarosa ... 58
Figura 14. Visualizacion en electroforesis en gel de agarosa ... 59
Resumen
El estudio de la diversidad genética y la identificación del material vegetativo es fundamental para el desarrollo de un cultivo, el uso de portainjertos para el establecimiento de una plantación aporta características favorables, brindando adaptabilidad a condiciones ambientales y mejorando la producción. La información de estos portainjertos se basa en características morfológicas y su manejo, por esta razón se han desarrollado métodos y técnicas a nivel molecular para facilitar el estudio y caracterización de portainjertos para cítricos. En este estudio se utilizaron marcadores moleculares microsatélites o SSR, para la caracterización de 8 portainjertos para cítricos usados en plantaciones comerciales. Los cebadores diseñados para localizar regiones microsatélites fueron analizados bajo la técnica de PCR para posteriormente ser separados y visualizados mediante electroforesis en el gel de agarosa al 2.5% y al 1.5%. Los datos obtenidos fueron usados para establecer su especificidad y su porcentaje de información polimórfica o PIC, determinando que el cebador “IDLCY2” es especifico debido a su selectividad al amplificar e informativo por sus valores de PIC 0.52 al 2.5% y 0.36 al 1.5% de concentración de agarosa.
Abstract
The genetic study diversity and the identification of vegetative material is fundamental for the crop development, the use of rootstocks for the establishment of the favorable characteristics plantation provides, in order to provide adaptability to environmental conditions and improving production. The information of these rootstocks is based on morphological characteristics and their management, for this methods reason and techniques have been developed at the molecular level to facilitate the study and characterization of rootstocks for citrus. In this study, microsatellite molecular markers, or SSR, were used for the characterization of 8 citrus rootstocks used in commercial plantations. The primers designed to locate microsatellite regions were analyzed under the PCR technique to be later separated and visualized by electrophoresis in the agarose gel at 2.5% and 1.5%. The data obtained were used to establish its specificity and its percentage of polymorphic information or PIC, determining that the primer "IDLCY2" is specific due to its selectivity when amplifying and informative by its values of PIC 0.52 at 2.5% and 0.36 at 1.5% of agarose concentration.
1. Introducción 1.1 Antecedentes del problema
Los cítricos pertenecen al género Citrus de la familia de las Rutáceas. El lugar de origen de los cítricos se remonta a las zonas de clima tropical y sub tropical de Asia, abarcando desde Arabia Oriental hasta Filipinas y desde el Himalaya hasta Indonesia o Australia, cultivándose desde hace más de 4000 años (Guillermo Banfi et al., 2012). Los primeros árboles de este cultivo llegaron a América con la segunda visita de los españoles, difundiéndose por toda América posteriormente.
Desde el ámbito económico los cítricos son de gran importancia debido a que promueve la economía de los países productores. A nivel mundial la producción de cítricos supera a la de cualquier otro frutal con 121,27 toneladas de cítricos al año, superando a los cultivos que tradicionalmente se producen en el trópico. Sin embargo, cultivar cítricos se ha convertido en una actividad que se realiza a gran escala y que requiere de un manejo y planificación a largo plazo (Feliu, 2016). La producción de cítricos en Ecuador (naranja) aumentó considerablemente desde el año 2015 pasando de “114,308 toneladas a 116,809 toneladas, en relación al año 2014” (MAGAP, 2015,p1)
La producción de cítricos se ve afectada por distintas causas, al tener una amplia variedad de especies cada una de ellas tienen diferentes problemas, en producción, adaptación y ataques de patógenos. Los cítricos se desarrollan en climas tanto tropicales como subtropicales por lo que su producción, venta y exportación está afectada por el cambio de condiciones climáticas en las diferentes épocas del año. Ante estos problemas se han generado tecnologías que favorecen a este cultivo. El uso de portainjertos o patrones ofrecen características favorables y resistencia a afectaciones causadas por patógenos y plagas que afectan a la producción. El porta injerto en los cítricos tiene directa influencia en la producción ya que aporta con las
características de resistencia y con un mejor sistema radicular (Guillermo Banfi et al., 2012).
Ecuador es un país tropical con diversas condiciones edafoclimáticas que permiten producir cítricos, sin embargo, esta misma diversidad demanda portainjertos que se adapten a diferentes factores ambientales y que posean características favorables para cultivar cítricos.
Según el reporte de Valarezo et al.,(2014) en Ecuador se han estudiado diferentes patrones, de los cuales 5 son los sobresalientes, entre ellos tenemos: Mandarina cleopatra, Citranger troyer, Citranger carrizo, Citrumelo swingle, limón volkamericano.
A nivel mundial el mejoramiento de portainjertos está en constante avance, surge de aquí la necesidad de contar con información, no solo de su morfología y manejo, sino también a nivel genético. Es necesario caracterizar a nivel genético los patrones más usados en nuestro país para poder verificar la identidad de los patrones a nivel comercial y usar la información en programas de mejoramiento genético para cítricos. Para esta caracterización y posterior mejoramiento genético es indispensable el uso de herramientas y tecnologías que nos permitan acceder a esa información.
Los marcadores moleculares microsatélites o también conocidos por sus siglas en inglés (SSR) Simple Sequence Repeat, son una herramienta importante ya que permiten localizar y aislar genes o fragmentos de ADN de interés para su posterior análisis (Aranguren et al., 2005).
Para utilizar parte de los avances del material genético de cítricos a nivel mundial e iniciar el mejoramiento de portainjertos de cítricos, es necesario acceder a la información genética mediante el uso de marcadores moleculares. La información
de los marcadores moleculares permite identificar características como poliembrionía y resistencia a enfermedades importantes para el desarrollo de nuevas variedades adaptadas a las condiciones locales de Ecuador.
1.2 Planteamiento y formulación del problema 1.2.1 Planteamiento del problema
En Ecuador los citricultores no tienen acceso a información a nivel genético, que les permita diferenciar, caracterizar e identificar los portainjertos que se usaran en cultivos perennes. Esta falta de información provoca pérdidas económicas en el sector agrícola, ya que se presentan limitantes como:
• Incompatibilidad genética del patrón con las distintas variedades. • Susceptibilidad a patógenos y enfermedades.
• Problemas de adaptación edafo-climáticas
Al ser un cultivo perenne todos estos efectos antes mencionados se pueden acumular y llegar a niveles críticos antes de presentar síntomas visibles, como consecuencia de usar un portainjerto erróneo. No se tendrán los resultados que se esperan en cuanto a producción y resistencia después de invertir tiempo y dinero en el cultivo.
1.2.2 Formulación del problema
¿Es posible observar los polimorfismos presentes en las muestras de los portainjertos comerciales, para cítricos más usados en Ecuador, usando marcadores moleculares microsatélites?
1.3 Justificación
La citricultura en Ecuador posee un gran inconveniente relacionado con la identidad genética del material vegetal que se usa como porta injerto. Existen distintas variedades e híbridos de cítricos usados como portainjertos a nivel
comercial. Estos portainjertos carecen de información molecular para su previa identificación y selección para el citricultor. La falta de esta información también supone un problema al tratar de averiguar su procedencia y estimar las características putativas de su descendencia.
Los portainjertos ofrecen una amplia gama de variaciones y combinaciones de genes que se relacionan directamente con la resistencia o tolerancia a ciertas enfermedades producidas por patógenos. Los portainjertos son esenciales ya que aportan con características que modifican tanto a las copas de los árboles y los frutos. Es indispensable caracterizar e identificar genéticamente a los cítricos para agilizar los procesos de selección y mejoramiento genético (Gallego, 2017). El uso de portainjertos permite la aclimatización a condiciones ambientales desfavorables, mejoran la producción y la calidad en fruta cosechada (Martinez y Palmira, 2013).
Caracterizar e identificar los cítricos a nivel genético es una tarea que ha sido limitada debido a la escasez de marcadores específicos y a factores como los altos índices de fertilidad entre especies, la poliembrionía y la reproducción apomíctica (Lezcano, 2018). Al mismo tiempo la verificación de la identidad genética de las variedades usadas como portainjertos ha sido esencial para el sistema de certificación de semillas e injertos a nivel mundial. Por estos motivos dar una identificación acertada basada solamente en características morfológicas se dificulta a medida que se acerca la relación genética de los genotipos, esto resulta aún más difícil cuando se comercializa materiales vegetales que usualmente difieren en pocos o tan solo un gen. En estos casos el uso de marcadores moleculares permite identificar la procedencia e identidad del material así como la presencia de alelos ligados a genes específicos con su respectiva característica (Martinez y Palmira, 2013).
En Ecuador la información a nivel molecular que caracterice a los portainjertos es mínima, la poca información existente se basa en la evaluación del comportamiento agronómico de los portainjertos de cítricos (Valarezo Concha et al., 2014). La falta de información para caracterizar molecularmente a los portainjertos de cítricos más usados en el Ecuador a nivel comercial no permite asegurar la identidad del material que se comercializa y distribuye para cultivar, siendo esto uno de los principales requisitos para una posterior certificación. En algunos casos es posible usar caracteres morfológicos de las hojas para diferenciar portainjertos, pero el periodo para verificar la identidad del portainjerto es muy largo por requerir de caracteres fenotípicos y algunas características que solo se expresarán hasta el estado adulto del cítrico. Algunos problemas de incompatibilidad y susceptibilidad también pueden omitirse en los casos de una identificación parcial con caracteres morfológicos. Por estos motivos el uso de marcadores moleculares se ha difundido en el mejoramiento y producción de cítricos.
Los marcadores moleculares microsatélites (SSR), son una herramienta molecular que permitirá caracterizar, diferenciar y hallar coincidencias genéticas existentes en los portainjertos, para así identificar y discriminar a los materiales a caracterizar, reduciendo el periodo de espera para verificar la identidad y originalidad del portainjerto. La información genética se puede usar para la comprensión de la clasificación taxonómica, la diversidad genotípica y las relaciones filogenéticas del género Citrus. El uso de marcadores moleculares también permite identificar materiales que pueden ampliar el uso de material vegetal e incrementar las zonas de cultivo de manera más rápida (Martinez y Palmira, 2013).
1.4 Delimitación de la investigación Espacio: Provincia del Guayas
Tiempo: El presente trabajo tuvo un tiempo estimado de cinco meses iniciando desde el 1 de septiembre hasta el 1 de enero.
Población: Citricultores e investigadores de cítricos del Ecuador. 1.5 Objetivo general
Caracterizar mediante la implementación de marcadores moleculares la diversidad genética presente en portainjertos de cítricos usados en Ecuador. 1.6 Objetivos específicos
• Diseñar marcadores moleculares microsatélites.
• Evaluar ocho pares de marcadores moleculares microsatélites para el perfil genético de ocho portainjertos de cítricos.
• Establecer el contenido de información del polimorfismo para los pares de iniciadores informativos.
1.7 Hipótesis
Los marcadores moleculares microsatélites permiten diferenciar mediante electroforesis a los portainjertos de cítricos más relevantes usados en Ecuador.
2. Marco teórico 2.1 Estado del arte
Ruiz (2002) en su trabajo titulado “Desarrollo de Marcadores Moleculares de Aplicación en Genómica y Programas de Mejora de Cítricos”, evaluó con marcadores moleculares familias segregantes, provenientes de una hibridación entre Poncirus trifoliata x (Citrus sinensis x Citrus reticulatta), y por la autofecundación de Fortunella crasifolia Swing. En estas familias utilizó un solo marcador microsatélite distinguiendo así 4 alelos que se encontraron presentes en la población. El marcador indicó que el 87% de los individuos dentro de la familia estudiada eran cigóticos. Los autores observaron que cuando más cercanos son los parentales genéticamente, es más complejo encontrar variabilidad en cada locus, demostrando así la eficiencia de los microsatélites en comparación con las isoenzimas, por su mayor grado de polimorfismo.
Carrillo et al., (2018) identificaron híbridos de limón mexicano, mediante el uso de marcadores moleculares microsatélites, los autores genotiparon 203 individuos, provenientes de cruces interespecíficos y las muestras amplificadas fueron observadas en gel de poliacrilamida al 8%, en el cual se observó y se comparó con las bandas de los progenitores. “Las plantas híbridas se determinaron por la presencia de bandas del progenitor masculino amplificadas por PCR utilizando cuatro iniciadores” (p.15).
En el estudio realizado para la caracterización de pomelo, Lezcano (2018) planteó que el uso de marcadores moleculares específicos es eficaz para el estudio y caracterización genética del pomelo, los marcadores moleculares permitieron evaluar el parentesco entre el pomelo y el resto de cítricos, obteniendo los siguientes resultados: “El análisis de la variabilidad genética mediante RAPD reveló
que el porcentaje de loci polimórficos y la heterocigosis esperada promedio fueron elevados en pomelo ‘Paraná’. Sin embargo, no se detectaron bandas exclusivas” (p.4).
El uso de marcadores moleculares microsatélites en las últimas décadas se ha convertido en una herramienta importante para la caracterización genética de distintos cultivos. En Ecuador, no se han realizado estudios con respecto a caracterizar a nivel molecular los portainjertos y variedades de cítricos. Los estudios a nivel molecular se han realizado en cultivos, como el maíz y la naranjilla (Gálvez, 2017; Garrido, 2010) .
En la caracterización de naranjilla con marcadores moleculares, Gálvez (2017) usó cincuenta marcadores microsatélites determinados para naranjilla. El objetivo fue determinar un grupo de iniciadores que fueron de utilidad en el estudio de la diversidad genética de la naranjilla. Los marcadores diferenciaron seis variedades tradicionales de naranjilla, obteniendo el perfil genético de treinta y tres SSR de los cincuenta estudiados, obteniendo que diez de ellos presentaron heterocigosis y 23 homocigosis con un índice polimórfico del 0.113.
En el trabajo experimental en maíz presentado por Garrido (2010), tuvo como objetivo estudiar la variación genética de la colección estudiada del INIAP, usando trece marcadores SSR con fluorescencia. Mediante análisis estadísticos se registró noventa alelos en los 13 locus estudiados, un valor de 0,65 para la heterocigosidad esperada y 0,3665 para la heterocigosidad observada, esto es debido a la reproducción alógama del maíz. Concluyendo que los marcadores moleculares SSR son eficaces para la detección de polimorfismo.
2.2 Bases teóricas 2.2.1 Portainjertos
Un portainjerto es el patrón o base donde se inserta el injerto, posee un sistema radicular idóneo que brindará sostén, adaptación, tolerancia a patógenos y enfermedades, y se encarga de absorber los nutrientes y el agua (Valarezo Concha et al., 2014)
2.2.1.1 Ventajas de los portainjertos
Arturo (2014) enlista las siguientes ventajas de los portainjertos: • Precocidad en la producción.
• Mayor uniformidad de la plantación proporciona cierto control sobre la calidad y cantidad de la cosecha para una misma variedad.
• Adaptación a problemas físico-químicos del suelo. • Resistencia a plagas y enfermedades.
• Tolerancia a bajas temperaturas. 2.2.2 Extracción de ADN
A nivel comercial existen kits para la extracción y purificación de ADN, basados en el uso de compactas matrices de origen inorgánico, equipadas con carga positiva, son capaces de acumular microgramos de ADN y aislarlos del restante de la muestra. Este proceso permite obtener ADN de buena calidad, libre de biomoléculas que vayan a interferir en los procesos. Los kits que se comercializan vienen en dos tipos de presentaciones, la primera posee un núcleo de hierro recubierto por resina, también llamadas perlas magnéticas, las cuales se encuentran dispersas en un medio amortiguador y la segunda son membranas de sílice, que se encuentran en un pequeño tubo de polipropileno. Los kits contienen soluciones para realizar la lisis, unión, precipitación. No contienen fenoles, ni etanol.
La comercialización de estos kits ha simplificado el tiempo de extracción de ADN y ha reducido el número de pasos en el proceso de extracción (Alejos, Aragón y Cornejo, 2014).
2.2.2.1 Protocolos de extracción de ADN
• Colecta de la muestra
Para la extracción en tejido vegetal se recomienda usar tejidos jóvenes o brotes nuevos, ya que poseen más células a diferencia del tejido viejo y poseen sustancias que pueden contaminar o dificultar la extracción de ADN como polisacáridos y polifenoles. Luego de la colecta es recomendable implementar un método de congelación o la conservación en frio, evitando la formación de estructuras como cristales, incluso la síntesis de metabolitos (Alejos, Aragón y Cornejo, 2014; Nieto et al.,2005)
• Homogeneización del tejido
La homogeneización es un proceso que consiste en destruir los enlaces entre las células para que la interacción con los reactivos de lisis sea más fácil. Existen dos tipos de homogenización: la mecánica, incluye el uso de agentes congelantes y homogeneizadores. La homogeneización química, se usan agentes químicos como detergentes, proteasas y caotrópicos para romper las uniones entre las células, este proceso se realiza a altas temperaturas (Velasco, 2005) .
• Lisis celular
En el proceso de lisis se busca la destrucción o modificación de las membranas celulares, con el fin de liberar los ácidos nucleicos contenidos en la célula. En este proceso se utilizan soluciones o agente que permitan disolver la membrana,
también se deben desactivar las enzimas que degraden el ADN usando inhibidores (Rocha, 2002).
• Almacenamiento del ADN.
El ADN luego de ser extraído, purificado y verificada su calidad se debe almacenar en condiciones frías. Las temperaturas para su almacenamiento dependen del uso inmediato o posterior que se le vaya a dar. Es recomendable usar “4 °C para los análisis inmediatos y el material restante a -20 °C o -80 °C, para una preservación por varios meses” (Alejos, Aragón y Cornejo, 2014, p.15). En el caso de conservar el ADN por meses se recomienda que se conserve en soluciones con una baja concentración de sales para inhibir la acción de DNasas.
2.2.3 Marcadores moleculares
Se denomina marcador molecular a la secuencia de ADN que se encuentra físicamente presente en el genoma de un individuo u organismo, se usan principalmente para encontrar y separar genes de interés (Rentaría, 2007). Los marcadores moleculares de ADN poseen alta especificidad, pueden determinar individuos, grupos de individuos y en algunos casos especies. Estas características han convertido a los marcadores moleculares en una herramienta básica para el estudio, caracterización y detección de polimorfismos en individuos, incluso poblaciones (Rocha, 2003).
2.2.3.1 Microsatélites SSR
Los microsatélites o como sus siglas lo indican secuencias simples repetidas, son una sucesión de ADN que está formada por varias bases de longitud, estas bases pueden ser mononucleotidas, di o tetranucleotidas, estos fragmentos se encuentran en zonas codificantes y no codificantes del genoma, presentan una alta variación polimórfica lo que lo hace esencial para la identificación y el estudio de variación genética intra e interespecíficos (Azofeifa, 1990; Picó y Gómez, 2012). Los microsatélites se utilizan como punto de partida para la replicación de ADN en
la PCR. El iniciador se hibrida con la hebra de muestra definiendo la zona que se desea amplificar y que contiene la secuencias simples repetidas (NHGRI, 2019; Reyes, 2008).
• Diseño de iniciadores
El diseño de un iniciador es fundamental para la amplificación de ADN, a continuación se describen los pasos a considerar para su diseño (Genome, n.d.).
• Cerciorarse que los iniciadores estén ordenados y diseñados en la dirección correcta.
• Los iniciadores deben tener una longitud que se encuentre entre 18 y 25 nucleótidos.
• Los iniciadores para la replicación y la secuenciación deben contener GC entre 40 y 60%, con los 3' de un iniciador terminados en C o G para promover la unión.
• El extremo 3' del iniciador debe coincidir exactamente con el ADN molde, ya que la extensión por la ADN polimerasa, durante la PCR, depende de una buena coincidencia en el extremo 3'.
• En las últimas 5 bases en el extremo 3' del iniciador, asegúrese de que haya al menos 2 bases G o C (pinza GC). Los pares de bases GC tienen un enlace más fuerte que los pares de bases AT (3 enlaces de hidrógeno versus 2).
• Cuando se ha agregado un sitio de restricción en el extremo de un iniciador, por lo general, se agregan 5-6 nucleótidos 5' del sitio de la enzima de restricción (también conocida como "secuencia líder") en el iniciador para permitir un corte eficiente.
• Intente evitar series de 4 o más de una base, o repeticiones de dinucleótidos (por ejemplo, ACCCC o ATATATAT) ya que esto puede causar errores.
• Los pares de Iniciadores deben tener una temperatura de desnaturalización similar con una diferencia máxima de 5 °C y no deben ser complementarios entre sí.
• Verificar la especificidad de los iniciadores para que no se unan a otras regiones genómicas a través de herramientas de búsqueda en genomas como NCBI Primer BLAST o UCSC PCR.
2.2.4 Reacción en cadena de polimerasa
La reacción en cadena de la polimerasa permite replicar in vitro millones de copias de un segmento específico del material genético a estudiar. Como menciona Pedrosa (1999) es altamente específico y sensible, características que han hecho de esta metodología una herramienta esencial para el análisis y la manipulación del ADN.
2.2.4.1 Protocolo de la técnica.
• Desnaturalización
En esta etapa se separa la doble cadena complementaria del ADN, esto obtiene mediante el incremento de la temperatura por un determinado periodo de tiempo. Como lo especifica Pedrosa (1999) “Aumentando la temperatura de la reacción a 92-98°C durante un tiempo que va de 30 a 90 segundos”(p.4).
• Alineamiento y extensión
La etapa de alineamiento consiste en el emparejamiento específico entre los iniciadores y las cadenas del ADN. En el punto de extensión la ADN polimerasa amplifica la longitud de los iniciadores unidos al ADN blanco, dando origen a nuevas
cadenas complementarias a las dos cadenas desnaturalizadas al inicio del proceso (Pedrosa, 1999).
2.2.5 Electroforesis
Según Castagnino (2000) define la electroforesis como el movimiento o flujo diferencial de sustancias dotadas con iones, neutras las cuales son atraídas o repelidas por un campo eléctrico, actualmente se emplean geles de agarosa o poliacrilamida para el campo de la biología molecular y el estudio de proteínas.
Mediante la electroforesis los fragmentos de ADN pueden ser separados de acuerdo a la longitud de la cadena y posteriormente visualizados con fluorescencia a la luz ultravioleta (UV).
2.3 Marco legal
2.3.1 Ley Orgánica Del Régimen De La Soberanía Alimentaria. Aún vigente (Asamblea Nacional, 2008) presenta
Art. 9. Investigación y extensión para la soberanía alimentaria. - El Estado asegurará y desarrollará la investigación científica y tecnológica en materia agroalimentaria, que tendrá por objeto mejorar la calidad nutricional de los alimentos, la productividad, la sanidad alimentaria, así como proteger y enriquecer la agro biodiversidad.
Además, asegurará la investigación aplicada y participativa y la creación de un sistema de extensión que transferirá la tecnología generada en la investigación, a fin de proporcionar una asistencia técnica, sustentada en un diálogo e intercambio de saberes con los pequeños y medianos productores, valorando el conocimiento de mujeres y hombres.
El Estado velará por el respeto al derecho de las comunidades, pueblos y nacionalidades de conservar y promover sus prácticas de manejo de biodiversidad y su entorno natural, garantizando las condiciones necesarias para que puedan mantener, proteger y desarrollar sus conocimientos colectivos, ciencias, tecnologías, saberes ancestrales y recursos genéticos que contienen la diversidad biológica y la agro biodiversidad.
Se prohíbe cualquier forma de apropiación del conocimiento colectivo y saberes ancestrales asociados a la biodiversidad nacional.
Art.10. Institucionalidad de la investigación y la extensión.
La ley que regule el desarrollo agropecuario creará la institucionalidad necesaria encargada de la investigación científica, tecnológica y de extensión, sobre los sistemas alimentarios, para orientar las decisiones y las políticas públicas y
alcanzar los objetivos señalados en el artículo anterior; y establecerá la asignación presupuestaria progresiva anual para su financiamiento.
El Estado fomentará la participación de las universidades y colegios técnicos agropecuarios en la investigación acorde a las demandas de los sectores campesinos, así como la promoción y difusión de la misma.
3. Materiales y métodos 3.1 Enfoque de la investigación.
El presente trabajo de investigación y desarrollo se enfocó en la investigación documental y experimental.
3.1.1 Tipo de investigación
• Investigación documental: Para el desarrollo del presente trabajo se utilizó la información disponible relacionada con el uso de marcadores moleculares microsatélites SSR en investigaciones ya realizadas.
• Investigación de campo y laboratorio: Se realizó la colecta de muestras de tejido vegetal de los portainjertos en campo y fueron llevadas al laboratorio para realizar la caracterización.
• Investigación experimental: Se aplicaron metodologías de extracción, amplificación y visualización del ADN con dos concentraciones de agarosa para el análisis del polimorfismo presente en el material genético.
3.1.2 Diseño de la investigación
El diseño de investigación es de tipo descriptivo. 3.2 Metodología.
3.2.1 Variables.
3.2.1.1 Variable independiente
• Concentraciones de agarosa
Se usaron dos concentraciones de agarosa, una al 1.5% y la otra al 2.5%. • Portainjerto de cítricos.
Se usaron como referencia ocho portainjertos de cítricos utilizados en plantaciones comerciales, descritos en la Tabla 1.
3.2.1.2 Variable dependiente
• Tamaño de fragmentos de ADN visibles
Se separó mediante el gel de electroforesis los productos del PCR de cada par de marcadores moleculares y se estimó el tamaño de los fragmentos de las secuencias amplificadas de cada muestra de portainjerto con relación a la escalera molecular.
• Concentración de los fragmentos de bandas
Se evaluó la concentración de los fragmentos de ADN separados en la matriz de agarosa del tanque de electroforesis y visualizados con luz UV.
• Presencia – ausencia de fragmentos de bandas.
La presencia o ausencia de fragmentos de ADN fueron evaluados después de separar el producto de PCR con electroforesis y usar luz ultravioleta para que las bandas presentes se iluminen.
• Especificidad de marcadores microsatélites.
Se evaluó la especificidad de los marcadores microsatélites con cada una de las muestras de los portainjertos.
3.2.2 Tratamientos
Se realizaron los siguientes tratamientos como se observa en la tabla a continuación:
Tabla 1. Descripción de los factores del proyecto
Portainjertos Concentraciones de agarosa
Citrus reshni Citranger troyer Citranger carrizo 1.5% Citrumelo swingle Citrus volkameriana 2.5% Citrus aurantium Citrus jambhiri Swingle Citrumelo
En esta tabla se describen los factores que intervienen en el proyecto. Haz, 2019
3.2.3 Diseño experimental
Para este estudio se utilizó un muestreo de 8 variedades de cítricos analizadas con 8 marcadores moleculares visualizados en electroforesis al 1.5% y 2.5% de agarosa. Se evaluaron las variables dependientes visualizadas en electroforesis en gel de agarosa.
3.2.4 Recolección de datos
3.2.4.1 Recursos
En este proyecto se contó con recursos de campo, bibliográficos y de laboratorio. • Recursos de campo.
El presente trabajo se realizó con la recolección de muestras de los portainjertos de cítricos en el campo.
• Recursos bibliográficos.
Se realizó con bibliografía de artículos científicos, tesis de grado, libros entre otros.
• Recursos de laboratorio.
Se utilizaron los equipos de laboratorio tales como: morteros, micro tubos, tanques de electroforesis, cámara de luz UV, kit de extracción de ADN, mini PCR.
Tabla 2. Recursos financieros
Recursos Valor
Viajes de recolección de muestras $ 50
Materiales de laboratorio $ 100
Agarosa $ 80
Tris + EDTA Taq polimerasa
Indicador de ADN (gel red) Cebadores Kit de extracción Total $ 120 $ 80 $60 $600 $250 $ 780
En la presente tabla se describe el valor estimado del costo del trabajo. HAZ, 2019
3.2.4.2 Métodos y técnicas
• Recolección de muestras
La recolección de muestras se realizó en la estación de INIAP Pichelingue, lugar donde se colectó hojas jóvenes de la colección de cítricos, las muestras fueron transportadas y almacenadas en refrigeración.
• Extracción y cuantificación de ADN
La extracción se realizó en el laboratorio de Biotecnología de la UAE, mediante un kit de extracción de ADN vegetal comercial, utilizando hojas de cada portainjerto. Se realizaron modificaciones de acuerdo a la disponibilidad del laboratorio en el protocolo descrito por la empresa (QIAGEN N.V, 2016).
1. Se maceraron 50 mg de tejido fresco de cada muestra usando un mortero y se agregaron 400 µl del Tampón AP1, se continuó macerando hasta obtener una mezcla homogénea.
2. El macerado obtenido se colocó en un microtubo de 2 ml y se añadieron 4 µl de RNasa, para ser agitado en el vórtex e incubado durante 10 minutos a 65ºC en el baño María, se invirtieron los tubos 3 veces durante la incubación.
3. Luego de la incubación se añadieron 130 µl de Tampón P3, se mezcló y se llevó a incubar en hielo por 5 minutos.
4. Se centrifugaron las muestras por 5 minutos a 14000 rpm.
5. Se pipeteo el lisado en una columna de centrifugación QlAshredder colocada en un tubo de 2 ml incluido en el kit para luego ser centrifugado durante 2 minutos a 14000 rpm.
6. El flujo fue transferido a un nuevo tubo sin alterar el sedimento y se colocaron 1.5 volúmenes de Tampón AW1, y se mezcló por pipeteo. 7. Se transfirió 650 µl de la mezcla a una columna giratoria DNeasy Mini
colocada en un micro tubo de 2 ml. Se centrifugaron a 8000 rpm durante 1 minuto, se repitió este paso con la muestra restante.
8. La columna giratoria se colocó en un nuevo tubo de 2 ml y se agregaron 500 µl de Tampón AW2 y se centrifugó a 8000 rpm durante 1 minuto, desechando el flujo continuo.
9. Se agregaron otros 500 µl de Tampón AW2, se centrifugó durante 2 minutos a 14000 rpm, se retiró la columna de centrifugado con cuidado evitando que entre en contacto con el flujo.
10. La columna de centrifugado fue llevada a un tubo de 2 ml.
11. Se añadieron 100 µl de Tampón AE para elución, se incubaron las muestras a temperatura ambiente durante 5 minutos, posteriormente se centrifugaron a 8000 rpm durante 1 minuto.
12. El ADN extraído de las muestras previamente etiquetado e identificado fue conservado en el congelador hasta su análisis.
Tabla 3. Contenido del kit de extracción de ADN “DNeasy Plant Mini Kit” Reactivos y materiales DNeasy Plant Mini Kit (Mini 50)
Mini columnas giratorias (incoloras) 50
Columnas giratorias QIAshredder Mini (lilas) 50
Tubos de recogida (2 ml) 50
Tampón AP1 40 ml
Tampón AP3 20 ml
Tampón AW1 (concentrado) 2 x 19 ml
Tampón AW2 (concentrado) 17 ml
Tampón AE 2 x 12 ml
ARNasa 220 µl
Tampón AW1 y AW2 son concentrados se debe agregar etanol (96–100%) de acuerdo con la etiqueta de la botella.
• Cuantificación del ADN.
Para determinar la calidad y concentración del ADN extraído, las muestras fueron observadas mediante electroforesis en gel de agarosa a una concentración del 1.5%, usando 7 µl de ADN y añadiendo 3 µl de Loading Dye a cada muestra para la tinción y visualización en el gel, la fluorescencia de las muestras fue comparada con los fragmentos de la escalera comercial “1 Kb Plus DNA Ladder”, (Mendoza et al., 2017). Como resultado de la corrida en gel de electroforesis se observó que la concentración de ADN extraído está dentro de los 30 µg, como se observa en la figura 7 demostrando la eficiencia del kit de extracción, de acuerdo al rango optimo establecido por el proveedor de 3 a 30 µg de ADN de alta calidad (QIAGEN, n.d.)
• Diseño y evaluación de marcadores moleculares microsatélites En el diseño de los cebadores se consultó varios estudios relacionados con marcadores moleculares microsatélites aplicados en cítricos de los cuales se tomó como referencia genes de interés presentes en el género citrus. Mediante el uso de la herramienta disponible en la web (“Nucleotide BLAST: Search nucleotide databases using a nucleotide query,” n.d.) se buscaron las secuencias de los genes de interés para el estudio, una vez identificadas las secuencias en el banco de genes y transformadas al formato “FASTA” fueron analizadas en el programa disponible en línea (“Find tandem repeats,” n.d.) la cual busca regiones microsatélites en las secuencias ingresadas.
Luego de ser identificadas las regiones microsatélites se procedió con el diseño de cada uno de los cebadores para cada gen en específico usando la herramienta en línea (“Primer designing tool,” n.d.). Parte de la evaluación de los marcadores diseñados consiste en que los pares de cebadores obtenidos como resultado coincidan o se asemejen con los criterios óptimos antes mencionados.
• Amplificación y replicación por la técnica PCR
Para la amplificación y replicación del ADN se usó la técnica de reacción en cadena de polimerasa (Pedrosa Andrés, 1999) usando el termociclador miniPCR® mini16 thermal cycler, que permitió procesar dos pares de cebadores a la vez, los volúmenes y reactivos usados para las reacciones están descritos en la tabla 4. La configuración del termociclador se realizó mediante la aplicación para dispositivos móviles y computadoras que se encuentra disponible en la página del proveedor y esta descrita en la tabla 5, el PCR se configuro para 35 ciclos. Este proceso se realizó con cada par de cebadores.
Tabla 4. Master mix PCR
Haz, 2021
Tabla 5. Configuración del Mini PCR
Etapa Temperatura (°C) Tiempo (seg)
Desnaturalización inicial 95.0 180
Desnaturalización 94.0 30
Alineamiento * 30
Extensión 72.0 30
Extensión Final 72.0 300
(*) Temperatura varía según el primer que se esté utilizando. Haz, 2021
Reactivos Volumen individual (µl) Volumen 8X (µl)
Primer forward (SSR) 1 8 Primer reverse (SSR) 1 8 dNTP`s 2 16 Taq 0,12 0,96 Buffer (green) 3 24 MgCl2 1,8 14,4 ddH2O (esterilizada) 6,08 48,64 ADN 2 16 TOTAL 17 136
• Separación y visualización en electroforesis
Para este proceso se elaboraron dos geles de agarosa de nivel molecular, uno al 1.5% y otro al 2.5%, usando Tampón TBE 1X para disolver la agarosa en un plato caliente y añadiendo 15 µl de GelRed® para teñir los ácidos nucleicos.
Se usó un molde para el gel con una capacidad de 500 ml y peinetas de 25 pocillos a una distancia de 1.5 mm y un grosor de 5 mm, en los cuales se cargaron 15 µl de la escalera comercial “1 Kb Plus DNA Ladder” como referencia en el primer pocillo y 7 µl de cada una de las muestras procesadas en el miniPCR dejando que corran durante 1.5 horas a 105 volteos, luego se las observo en una cámara de luz uv.
3.2.5 Análisis estadístico
Para el presente trabajo se utilizó el método descriptivo
• Ho: No existirá una diferencia significativa entre los polimorfismos de los portainjertos de cítricos visualizados por electroforesis en 1.5 y 2.5% de agarosa
• Ha: Existe al menos una diferencia significativa entre los polimorfismos de los portainjertos de cítricos visualizados por electroforesis en 1.5 y 2.5% de agarosa.
4. Resultados
4.1 Diseño de marcadores moleculares microsatélites.
En la tabla 6 se muestra el resultado del diseño de primers usando la herramienta en línea “PRIMER BLAST”, muestra el gen de estudio, la secuencia de nucleótidos ordenados de (5'->3'), la temperatura de alineamiento de cada cebador, el tamaño del amplicom y el código para identificar el gen, en el banco de germoplasma.
La selección de los cebadores fue basada en los siguientes parámetros: • Longitud del amplicom.
Las longitudes de los cebadores seleccionados estuvieron dentro del rango mínimo de 195 pares de bases y máximo 510 pares de base. • Contenido de GC%.
El contenido de guanina y citocina está dentro del 50 al 55% para promover uniones de enlaces más fuertes.
• Temperatura de alineamiento.
Las temperaturas entre cebadores no difieren más de los 5º que se recomienda para una óptima alineación.
• Longitud de los cebadores
Las secuencias seleccionadas como cebadores tienen una longitud promedio de 20 pares de bases nitrogenadas
Tabla 6. Diseño de cebadores
Haz, 2021
Gen Cebadores (5'->3') Temp
Alineamiento
Tamaño aprox. del amplicon
Adhesiones a bancos de germoplasma
Citrus maxima clone elongation factor
F: AAAGCCGTTGGTGTGAGAGT 59.5
280 FJ356252.1
R: CCGGCATCTCAACACTCCTA 60
Sour orange haplotype 1 malate dehydrogenase gene
F: CTCAGGCTCTCCTTTGGCTT 59.04
338 EU254115.1
R: TAGCGAAAATTGCACGACCC 60
Citrus sinensis plasma membrane ATPase-like F: CGGACGCGTTTGGTGTAAGA 60.9 508 XM_006483505.3 R: GCGATCTCTGAAAGCTCCCT 59.5 Citrus clementina capsanthin/capsorubin synthase, chromoplastic F: ATGGTCTCCCCTCCACTTAGAA 59.9 352 XM_006424132.2 R: GTACCGACTCCGGTGTCAAC 60.3
Citrus sinensis uncharacterized
F: GCGTTAGTAAGTTTGGCCGC 60.1
308 XM_025102824.1
R: GACACTGGCGTTGTTTCTCG 59.7
Citrus sinensis lycopene beta-cyclase
F: CCTATTTCCATTAGGCCGCCA 60.2
201 MG492007.1
R: GCTGGTCCAGTGCCAATGAT 60.6
Citrus sinensis beta-carotene hydroxylase F: ATGGCGGTCGGACTATTGG 59.5 307 XM_015534043.2 R: TCTCGGATCTCTTTCTCGCC 58.9 MM2-cpINDEL3 F: CCATTTCCGAGTACCATGACCA 60 195 LC2184351 R: GGCCTGGGTCGTGTATCAAT 59.8
4.2 Evaluación de los marcadores moleculares microsatélites
La evaluación de los marcadores moleculares se basó en la observación y descripción mediante la electroforesis en gel de agarosa, elaborado en dos concentraciones distintas una al 2.5% y otra al 1.5%. Las variables a considerar fueron:
4.2.1 Presencia o ausencia de bandas
En la tabla 7 se describe lo observado en el gel de agarosa. Tabla 7. Presencia o ausencia de bandas
Cítricos
Cebadores
Sc1 Sc8 Sst Lbc2 G11 IDLCY2 IDHYB1 MM2-cpINDEL3
2.5% 1.5% 2.5% 1.5% 2.5% 1.5% 2.5% 1.5% 2.5% 1.5% 2.5% 1.5% 2.5% 1.5% 2.5% 1.5% Citrus reshni + + + + + - + + + + + + + + + + Citranger troyer + + + + + + + + + - + + + + + + Citranger carrizo + + + + + - + + + + + + - - + + Citrumelo swingle + + + + + + + + + + + + + + + + Citrus volkameriana + + + + + + + + + + - - + + + + Citrus aurantium + + - - + + + - + + - - + + + - Citrus jambhiri + + + - + + + - + + - - + + + + Swingle Citrumelo + + + - + + + - + + - - + + + +
(+) Presencia de banda. (-) Ausencia de banda. Haz, 2021
4.2.2 Tamaño y concentración de los fragmentos de banda.
Las tablas 8 y 9 muestra los resultados obtenidos de la comparación visual de las muestras estudiadas con la escalera molde de 1 kb.
Tabla 8. Tamaño y concentración de bandas en gel al 2.5%
Cítricos Cebadores Sc1 Sc8 Sst Lbc2 G11 IDLCY2 IDHYB1 MM2-cpINDEL3 pb ng/ 5µl pb ng/ 5µl pb ng/ 5µl pb ng/ 5µl pb ng/ 5µl pb ng/ 5µl pb ng/ 5µl pb ng/ 5µl Citrus reshni 700 92 700 92 1200 92 1100 92 400 92 1300 92 500 92 500 92 Citranger troyer 700 92 750 92 1100 92 1000 92 400 45 1300 92 700 92 500 92 Citranger carrizo 700 92 700 92 1100 92 1000 92 400 45 1300 92 - - 500 92 Citrumelo swingle 700 92 700 92 1100 92 1000 92 400 45 1300 92 700 92 500 92 Citrus volkameriana 900 92 750 92 600 92 500 30 900 92 - - 800 92 700 92 Citrus aurantium 800 92 - - 600 92 500 30 900 45 - - 800 92 700 30 Citrus jambhiri 800 92 700 30 600 92 500 30 900 45 - - 800 92 700 30 Swingle Citrumelo 800 92 700 30 600 92 500 30 900 45 - - 800 92 700 92 (-) Ausencia de datos. Haz, 2021
Tabla 9. Tamaño y concentración de bandas en gel al 1.5% Cítricos Cebadores Sc1 Sc8 Sst Lbc2 G11 IDLCY2 IDHYB1 MM2-cpINDEL3 pb ng/ 5µl pb ng/ 5µl pb ng/ 5µl pb ng/ 5µl pb ng/ 5µl pb ng/ 5µl pb ng/ 5µl pb ng/ 5µl Citrus reshni 700 92 900 45 - - 1400 45 600 92 1300 92 600 45 500 92 Citranger troyer 700 92 1000 45 1300 45 1300 92 - - 1300 92 700 45 500 45 Citranger carrizo 700 92 900 45 - - 1300 92 600 45 1300 45 - - 500 45 Citrumelo swingle 700 92 900 45 1300 45 1300 92 600 45 1300 45 700 45 500 45 Citrus volkameriana 1000 45 1000 45 1000 45 1000 45 1200 45 - - 800 45 700 45 Citrus aurantium 900 45 - - 1300 92 - - 1000 45 - - 800 45 - - Citrus jambhiri 800 45 - - 1000 45 - - 1000 45 - - 800 45 700 45 Swingle Citrumelo 800 45 - - 1000 45 - - 1000 45 - - 800 45 700 45 (-) Ausencia de datos. Haz, 2021
4.3 Establecimiento del contenido de información polimórfica para los pares de cebadores informativos
En la tabla 10 describe el resultado de PIC para cada una de las concentraciones de agarosa. Durante este análisis se observó la diferencia presente entre las concentraciones, observando que las muestras analizadas en gel del 2.5% tiene más alto el contenido de información polimórfica.
Tabla 10. Contenido de Información Polimórfica
Cebadores 2.5% 1.5%
# Alelos PIC # Alelos PIC
Sc1 4 0,65 7 0,8 Sc8 3 0,5 3 0,5 Sst 6 0,7 5 0,67 Lbc2 6 0,74 4 0,62 G11 6 0,7 5 0,71 IDLCY2 3 0,52 2 0,36 IDHYB1 5 0,72 3 0,46 MM2-cpINDEL3 4 0,6 3 0,36 Haz, 2021
5. Discusión
Al culminar la investigación y descripción del trabajo podemos determinar si el uso de marcadores moleculares microsatélites en cítricos aporta información valiosa para los citricultores y el estudio de la diversidad genética de los portainjertos de cítricos usados en Ecuador.
Rentaría (2007), menciona que la implementación de los SSR es vital importancia para el estudio de la variación genética inter e intra especifica debido a su alto grado de polimorfismo, es por esto que la evaluación de los cebadores diseñados permite diferenciar a los cítricos estudiados en este trabajo.
Según Picó y Gómez (2012), al tratarse de secuencias con un alto índice de variabilidad entre individuos, estas variaciones se expresan con diferentes longitudes entre los alelos del mismo loci, en las muestras analizadas se observó distintos tamaños de bandas para cada marcador, lo que demuestra que los SSR aportan información importante para el estudio de la variabilidad genética.
Caracterización de la diversidad genética en naranja y comparación del polimorfismo de microsatélites amplificados al azar (RAMs) usando electroforesis de poliacrilamida y agarosa Coronado et al., (2009), menciona que la electroforesis en gel de agarosa permite un análisis rápido pero con una baja resolución ya que al separarse las bandas tienden a ser borrosas y ampliarse, esto se debe al tamaño de los poros del gel, sin embargo favorece su extenso rango de separación para fragmentos de gran peso molecular, Picó & Gómez (2012), mencionan que la concentración óptima para visualizar los alelos microsatélites con suficiente tamaño en gel de agarosa es de 2 a 3%,de tal manera se pudo evidenciar que de las dos concentraciones de agarosa usadas en este trabajo, la de 2.5% permitió visualizar
con mayor claridad las diferencias y la variabilidad genética presente en los cítricos estudiados.
Serrote et al., (2020), indica que el contenido de información de polimorfismo de un marcador es la capacidad que tiene para detectar el polimorfismo entre individuos de una misma población, de tal manera que, a mayor capacidad, mayor será su valor. En el caso de marcadores codominantes como los SSR los valores oscilan entre 0 sin capacidad para detectar polimorfismo y 1 altamente informativo, los valores de PIC obtenidos en este estudio están por encima del 0.25 en ambos geles, con la excepción del cebador Sc8 en gel de 1.5 el cual no tuvo capacidad para detectar polimorfismos dentro de la población de cítricos estudiados.
6. Conclusión
El uso del kit de extracción de ADN comercial es una opción rápida y sencilla para obtener ADN de alta calidad, siguiendo el protocolo establecido y conservando las muestras en la temperatura óptima hasta su análisis.
Se concluye que para el correcto diseño e identificación de regiones microsatélites es favorable el uso de las herramientas en línea antes mencionadas, identificar el gen de interés, buscar la secuencia en los bancos de germoplasma disponibles en la red y tener en cuenta los criterios de diseño y selección de cebadores.
Los marcadores diseñados si amplificaron las regiones microsatélites las cuales tuvieron tamaños y contracciones variables según la contracción de agarosa, los rangos de tamaño están entre 500 a 1400 pares de bases y la contracción entre 30 ng/ 5µl siendo la concentración e intensidad de banda más baja y 92 ng/ 5µl la mas alta y de mayor intensidad.
El PIC analizado nos indica que los cebadores diseñados son muy informativos y que el cebador “IDLCY2” es especifico debido a su selectividad al amplificar e informativo por sus valores de PIC 0.52 al 2.5% y 0.36 al 1.5% de concentración de agarosa.
En el caso de este estudio se concluye que la concentración optima de agarosa para los marcadores microsatélites es de 2.5% teniendo los valores más altos de PIC y la mejor resolución visual para su descripción y análisis.
Los marcadores moleculares microsatélites si permiten diferenciar individuos dentro de una misma población, y presentan diferencias visuales significativas entre las concentraciones de agarosa.
7. Recomendación
Acorde con los resultados de esta investigación se proponen las siguientes recomendaciones:
Usar métodos y estrategias sencillas para la extracción de ADN de buena calidad, siguiendo los protocolos establecidos.
Para el diseño correcto de cebadores se recomienda seguir los criterios establecidos, verificar las secuencias de los genes de interés en fuentes oficiales, usar las herramientas disponibles en la red para facilitar y optimizar los pasos, una vez diseñados los cebadores verificar que las secuencias sean las correctas.
En la reacción en cadena de polimerasa se recomienda analizar al mismo tiempo los cebadores que sean similares en las temperaturas de alineamiento y no difieran más de 5°.
Para el estudio de microsatélites se recomienda usar electroforesis en gel de agarosa al 2.5% ya que permite una mejor visualización de bandas.
Para determinar el PIC se recomienda obtener fotos o imágenes claras para la visualización y conteo de los alelos, manteniendo siempre el mismo criterio para todas las muestras.
En la obtención y establecimiento de un cultivo de cítricos se recomienda el análisis previo del material vegetativo a usar implementando marcadores moleculares SSR usando cebadores específicos e informativos para una validación temprana y evitar pérdidas posteriores.
8. Bibliografía
Alejos, L., Aragón, M., & Cornejo, A. (2014). Extracción y purificación de ADN.
Herramientas Moleculaes Aplicadas En Ecología, 1–26.
https://doi.org/10.1017/CBO9781107415324.004
Aranguren, J. A., Román-Bravo, R., Isea, W., Villasmil, Y., & Jordana, J. (2005). Los microsatélites (STR´s), marcadores moleculares de ADN por excelencia para programas de conservación: una revisión (Microsatellites (STR’s), ADN Molecular Markers for Excellency for conservation programs: A review). Retrieved from https://tspace.library.utoronto.ca/handle/1807/7085
Arturo, Á. (2014). ESTUDIO DE MERCADO Y PREFACTIBILIDAD DEL CULTIVO
DE LIMON TAHITI (Citrus aurantifolia) EN LA PROVINCIA DE SANTA ELENA. Retrieved from
http://repositorio.ucsg.edu.ec/bitstream/3317/2710/1/T-UCSG-PRE-TEC-EADR-13.pdf
Azofeifa, A. (1990). USO DE MARCADORES MOLECULARES EN PLANTAS; APLICACIONES EN FRUTALES DEL TRÓPICO. Agronomía
Mesoamericana, 17(2). Retrieved from
https://www.redalyc.org/html/437/43717210/
Carrillo Medrano, S. H., Gutierrez Espinosa, M. A., Robles González, M. M., & Cruz Izquierdo, S. (2018). Identificación de híbridos de limón mexicano mediante marcadores moleculares SSR. Revista Mexicana de Ciencias
Agrícolas, 9(1), 11. https://doi.org/10.29312/remexca.v9i1.844
Castagnino, J. (2000). .Electroforesis capilar. Bioquimia, 25(1). Retrieved from https://www.redalyc.org/html/576/57611797003/
Arcos, A. L., … Flores, J. E. M. (2009). Caracterización de la diversidad genética en naranja y comparación del polimorfismo de microsatélites amplificados al azar (RAMs) usando electroforesis de poliacrilamida y agarosa. Acta Agronómica, 58(4), 234–244. Retrieved from
http://www.revistas.unal.edu.co/index.php/acta_agronomica/article/view/1245 0/13107
Feliu, I. S. (2016). LA CITRICULTURA EN ESPAÑA: PRESENTE Y FUTURO. Valencia. Retrieved from
https://www.agronegocios.es/digital/files/planstar/Sanfeliu_pstar_citricos_vale ncia.pdf
Find tandem repeats. (n.d.). Retrieved May 21, 2021, from http://insilico.ehu.eus/mini_tools/microsatellites/
Gallego, J., Enriquez, A., Caicedo, A., Posso, A., & Muños, J. (2017). DIVERSIDAD GENÉTICA EN PATRONES DE CÍTRICOS MEDIANTE MICROSATÉLITES AMPLIFICADOS AL AZAR (RAMs). Biotecnología En El
Sector Agropecuario y Agroindustrial, 15(1), 85–94. Retrieved from
http://www.scielo.org.co/pdf/bsaa/v15n1/v15n1a10.pdf
Gálvez, D. A. Y. (2017). VALIDACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE
MARCADORES MOLECULARES MICROSATÉLITES PARA GENOTIPAJE DE NARANJILLA (SOLANUM QUITOENSE LAM.). Retrieved from
http://dspace.udla.edu.ec/bitstream/33000/8206/1/UDLA- EC-TIB-2017-40.pdf Garrido Haro, A. D. (2010). Caracterización molecular de la colección núcleo de
maíz de altura del INIAP mediante marcadores moleculares microsatélites. Retrieved from http://repositorio.iniap.gob.ec/handle/41000/311
January 28, 2019, from http://www.genomecompiler.com/tips-for-efficient-primer-design/
Guillermo Banfi, Carlos Miguel CASAFUS, Norma Beatriz COSTA, Anahí FABIANI, Sergio Mario GARRAN, Guillermo Marco, … Norma VACCARO. (2012). Manual para productores de naranja y mandarina de la Región del Río Uruguay. Retrieved November 6, 2018, from
https://inta.gob.ar/sites/default/files/script-tmp-inta_manual_citricultura_cap1.pdf
Lezcano, C. (2018). Caracterización genética de pomelo “Paraná” mediante
marcadores moleculares. Universidad Nacional del Nordeste. Retrieved from
http://repositorio.unne.edu.ar/bitstream/handle/123456789/1545/RIUNNE_Tes is_de_Maestría_Lezcano_Cecilia_Carolina.pdf?sequence=1&isAllowed=y MAGAP. (2015). BOLETÍN SITUACIONAL 2015 NARANJA. ECUADOR.
Retrieved from
http://sinagap.agricultura.gob.ec/phocadownloadpap/cultivo/2016/boletin_situ acional_naranja 2015.pdf
Martinez, M. F., & Palmira, S. (2013). CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE
GENOTIPOS DE MANDARINAS Citrus spp. MEDIANTE MARCADORES RAM´s (Microsatélites amplificados al azar) Y MICROSATÉLITES. Colombia.
Retrieved from http://bdigital.unal.edu.co/12773/1/7609502.2013.pdf Mendoza, H., Mendoza, J., López, J., Mejía, N., Zambrano, F., Mendoza, M., &
Ponce, W. (2017). Variabilidad genética de la colección de piñón (Jatropha Curcas L.) del Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias del
Ecuador, usando marcadores tipo microsatélites. La Técnica: Revista de Las
https://doi.org/10.33936/la_tecnica.v0i17.691
NHGRI. (n.d.). National Human Genome Research Institute (NHGRI). Retrieved January 28, 2019, from https://www.genome.gov/glossarys/index.cfm?id=163 Nieto José; Ramos Luis; Motte Emmerik. (2005). EXTRACCIÓN Y
PURIFICACIÓN DE ADN DE Tectona grandis L. PARA SU EMPLEO EN LA TÉCNICA RAPD. Foresta Veracruzana, 7(2). Retrieved from
https://www.redalyc.org/html/497/49770201/
Nucleotide BLAST: Search nucleotide databases using a nucleotide query. (n.d.). Retrieved May 21, 2021, from
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=Bla stSearch&LINK_LOC=blasthome
Pedrosa Andrés. (1999). Reaccion en cadena de Polimerasa. Revista Archivo
Médico de Camagüey, 3(2), 0–0. Retrieved from
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1025-02551999000200011
Picó, M., & Gómez, E. (2012). Marcadores moleculares basados en PCR: Marcadores SSR o STR (Simple Sequence Repeats or Short Tandem Repeats). Microsatélites. Retrieved from
https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/16743/SSR.pdf.pdf?sequence=1 Primer designing tool. (n.d.). Retrieved May 21, 2021, from
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=reset QIAGEN. (n.d.). DNA Isolation from Plant: DNeasy Plant Mini Kit - QIAGEN.
Retrieved May 23, 2021, from https://www.qiagen.com/dk/shop/pcr/dneasy-plant-mini-kit/
Rentaría, M. (2007). Breve revisión de los marcadores moleculares. Retrieved from http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/530/cap18.pdf Reyes, S. C. H. (2008). Revision teorica sobre la epigenetica, su impacto en
enfermedades complejas y componentes quimicos con actividad remodeladora de la cromatina. Retrieved from
http://catarina.udlap.mx/u_dl_a/tales/documentos/lcf/hernandez_r_sc/ Rocha, P. (2003). Marcadores moleculares, una herramienta útil para la
selección genética de palma de aceite. Palmas, 24. Retrieved from
https://publicaciones.fedepalma.org/index.php/palmas/article/view/957/957 Rocha Pedro. (2002). Teoría y práctica para la extracción y purificación del
ADN de palma de aceite. Palmas, 23. Retrieved from
https://publicaciones.fedepalma.org/index.php/palmas/article/view/921/921 Ruiz Lafora, C. (2002). DESARROLLO DE MARCADORES MOLECULARES DE
APLICACIÓN EN GENOMICA Y PROGRAMAS DE MEJORA DE CITRICOS.
Universidad de Valencia, Valencia. Retrieved from
https://www.tdx.cat/bitstream/handle/10803/9925/ruiz.pdf?sequence=1&isAllo wed=y
Serrote, C. M. L., Reiniger, L. R. S., Silva, K. B., Rabaiolli, S. M. dos S., & Stefanel, C. M. (2020, February 5). Determining the Polymorphism Information Content of a molecular marker. Gene. Elsevier B.V. https://doi.org/10.1016/j.gene.2019.144175
Valarezo Concha, A., Valarezo Cely, O., Mendoza García, A., & Alvarez, H. (2014). Guía técnica sobre el manejo de los cítricos en el Litoral ecuatoriano. Retrieved from http://repositorio.iniap.gob.ec/handle/41000/1194
molecular., 3. Retrieved from
http://revistabiotecnologia.unicauca.edu.co/revista/index.php/biotecnologia/arti cle/viewFile/19/12
9. Anexos
Figura 1. Maceración de muestras
Figura 2. Preparación del kit de extracción.
Figura 4. Suspensión de la muestra
Figura 5. Muestras en microtubos para su análisis
Figura 6. Comprobación de extracción de ADN
Figura 7. Visualización de ADN extraído
Figura 8. Preparación del PCR
