MANUAL DE
PROCEDIMIENTOS
OPERATIVOS ESTÁNDAR DEL
LABORATORIO DE MICOLOGIA
R
R
E
E
D
D
D
D
E
E
M
M
I
I
C
C
O
O
L
L
O
O
G
G
I
I
A
A
G
G
C
C
B
B
A
A
Elaborado por: Dra. S. Cataldi, L. Guelfand, M. Perrone Fecha: mayo 2008
Versión original
Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM Fecha:
Revisado por: Dra. Alicia Arechavala, L. López Moral Fecha: junio 2011
PRÓLOGO
El objetivo de este manual es normalizar de una manera clara y sencilla los procesos que se realizan en el Área de Micología y que puedan ser
interpretados por profesionales capacitados de la especialidad, para permitir la resolución del trabajo diario del Sector.
Por último, la finalidad principal es implementar un Sistema de Gestión de Calidad basado en Normas ISO 9000:2000 teniendo como objetivo principal la mejora continua de los procesos, tratando de lograr la máxima satisfacción de los usuarios de la Red de Micología y otras partes relacionadas.
CONTENIDO
PROCEDIMIENTO OPERATIVO PARA EXAMEN MICOLÓGICO DE: 9 PIEL 9 CUERO CABELLUDO 9 UÑAS 9 MUESTRAS RESPIRATORIAS 9 ORINAS 9 MUCOSAS Y SEMIMUCOSAS 9 SANGRE 9 MÉDULA ÓSEA 9 LIQUIDOS DE PUNCIÓN 9 LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO 9 INMUNODIAGNÓSTICO
9 PRUEBAS DE SENSIBILIDAD ANTIFÚNGICA
1. OBJETIVOS:
Desarrollar el procedimiento a seguir para el examen directo y cultivo de los hongos presentes en muestras superficiales de piel
2. ALCANCE:
Todas las muestras de piel extraídas de acuerdo a las indicaciones de toma de muestra (PATT), para confirmar o descartar el diagnóstico clínico presuntivo de micosis superficiales de las lesiones de piel.
3. PERSONAL AFECTADO:
Bioquímicos y técnicos del sector Microbiología, área Micología, pertenecientes a los Laboratorios de los Hospitales del GCBA
4. REFERENCIAS:
Micología Médica Ilustrada, Roberto Arenas Guzmán, Nueva Editorial Interamericana, 3a edición, México, 2008
Manual de Procedimientos para Laboratorios de Micología Médica, Prof. Dr. Ricardo Negroni, Dra. Liliana Guelfand y col. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana supl. 1, editado por la Federación Bioquímica de la Pcia. De Bs. As. Argentina, 1999
Guía Práctica de Identificación y Diagnóstico en Micología Clínica, Pemán J. , Martín Mazuelos E., Rubio Calvo M.C., 1ª ed. Revista Iberoamericana de Micología, 2001, Bilbao, España
5. DEFINICIONES:
Elaborado por: S.Cataldi, M.Carmen Perrone,L.Guelfand Fecha: 8 de enero 2008
Versión Original
Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM Fecha: agosto 2011
Revisado: L.L Moral, I.Maldonado Fecha: julio 2011
Etapa Pre- Analítica
PAMR: Manual de Medios y Reactivos
PATT: Manual de Toma y Transporte de muestras Etapa Analítica
AMID: Manual de Identificación 01. Dermatofitos
02. Levaduras 03. No Dermatofitos 04. Levaduras Lipofílicas
APOE: Manual de procedimiento Operativo Etapa Post- Analítica
PPFI: Formularios e Informes MC: Manual de Calidad
MB: Manual de Bioseguridad ANEXOS
PLANILLAS
6. RESPONSABILIDADES:
Jefe de Sector ó Sección Microbiología / Micología, Bioquímicos a cargo del área Micología
7. DESARROLLO:
7.1 FUNDAMENTO DEL MÉTODO
El diagnóstico de las micosis superficiales se basa en el hallazgo de hifas o levaduras características, en el examen microscópico directo y el aislamiento del agente causal en los cultivos.
7.2 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS:
Microscopio con objetivos de 10x, 40x y 100x (inmersión) Heladera 2- 8 º C
Estufa de cultivo a 35- 37 ºC Estufa de cultivo a 28 ºC Mechero a gas o eléctrico Gradillas para tubos Portaobjetos
Cubreobjetos
Hojas de bisturí descartables estériles y/o sindesmótomos estériles Cinta adhesiva transparente
Ansa bacteriológica Gancho en L
Agujas de disección
Guantes de látex descartables
Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol (SAB+C) Agar Miel Sabouraud (SAB-M) con cloranfenicol (SAB+C) Agar lactrimel con cloranfenicol (LAC)
Agar Dermatophyte Test Medium (DTM)
Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol y cicloheximida (SAB+C+A) Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol y aceite de oliva (SAO) Agar Bilis de Buey (ABB)
Agar Dixon (ADX) Agar Danker (ADK)
7.3 PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS Y MEDIOS:
Ver Manual operativo de Medios y Reactivos (PAMR) 7.4 MUESTRA A ANALIZAR:
Escamas de piel recolectadas en forma estéril
7.5 SECUENCIA OPERATIVA:
7.5.1 Precauciones de seguridad:
Consultar el Manual de Bioseguridad (MB) 7.5.2 Procesamiento de la muestra:
A cada muestra se le asigna un número interno correlativo, siguiendo el orden consecutivo del libro correspondiente o sistema informático propio de cada Laboratorio. La muestra obtenida se destinará una parte para el examen directo microscópico, otra para el cultivo y de ser posible reservar material para confirmar -si hiciera falta- el resultado del examen directo.
a) Examen microscópico directo: para aclarar la capa córnea de la piel es indispensable recurrir a diversas soluciones que disuelve la queratina sin afectar la morfología de los elementos fúngicos. Las más comunes son las de hidróxido de potasio (KOH) en concentraciones del 10% al 40%, solo o con tinta azul negra permanente de PARKER, KOH con dimetilsulfóxido o blanco calcoflúor para muestras poco parasitadas. Ver (PAMR). Si se emplea KOH, suspender las escamas en una gota del mismo con o sin tinta Parker, cubrir con un cubreobjetos, calentar en la llama del mechero, (evitando llegar a ebullición y formación de burbujas en el preparado), enfriar rápidamente sobre la mesada. Si las escamas fueron obtenidas con cinta adhesiva transparente, colocar una gota de la mezcla KOH y tinta azul Parker para que penetre por capilaridad entre la cinta y el portaobjetos. Para determinar la presencia de bacterias filamentosas que parasitan la piel, se pueden realizar preparaciones teñidas. Para ello, una vez examinada la preparación con KOH sacar el cubreobjetos y resuspender las escamas digeridas en agua destilada, luego colocar la suspensión en un tubo cónico y centrifugar a 2000r.p.m. durante 5 minutos, volcar el sobrenadante y tomar con una pipeta Pasteur el precipitado para realizar un extendido sobre portaobjeto. Dejar secar y luego fijar y teñir con Giemsa al 10%, 30 minutos o con Azul de metileno al 1% durante 5 minutos.
b) Cultivos: La segunda parte del material, se utiliza para la realización de los cultivos en medios sólidos. Se sugieren dos o tres medios: (SA B+C), (LAC), (ABAL), (DTM), con y sin cicloheximida (Ver PAMR). Cuando se sospecha pitiriasis versicolor, se debe sembrar el material en medios ricos en lípidos (ácidos grasos de cadena larga) como el Medio de Dixon (ADX), en su defecto Agar miel Sabouraud con el agregado de aceite de oliva estéril (al 2%) (SAO), Medio de Danker (ADK), Agar Sabouraud con bilis de buey (ABB).
Para sembrar el material, se deben fragmentar las escamas lo más posible, para inocularlas en la superficie del medio de cultivo con un gancho metálico fino, esterilizado a la llama y enfriado en la superficie del agar. Si se emplean tubos, efectuar tres toques en el medio separados por lo menos por 1 cm de distancia entre ellos. Emplear dos o tres tubos con los medios de cultivo elegidos.
La incubación se lleva a cabo a temperatura ambiente o en estufas reguladas a 25º ó 28º C.
Si de acuerdo a los datos epidemiológicos del paciente se sospecha
Trichophyton verrucosum se deberá incubar a 37º C uno de los tubos
sembrados.
Cuando se siembran medios para búsqueda de Malassezia spp, se incubarán de 32 a 35 º C durante 7 días en aerobiosis.
Examinar los cultivos una ó dos veces por semana hasta completar las tres semanas de incubación.
7.5.3 Resultados:
a) Examen directo:
Si no hubo hallazgo se informa: “No se observan elementos micóticos” o “Negativo”
Si hubo hallazgo se informa según el caso:
“Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas”.
“ Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas, características compatibles con de dermatofitos”
“ Se observan elementos levaduriformes y/o seudohifas”
“Se observan levaduras y filamentos cortos característicos de “Malassezia spp”
b) Cultivos:
Si durante el lapso indicado de incubación no se obtuvo desarrollo se descartan los cultivos y se informan “No se obtuvo desarrollo de hongos” o “Cultivo Negativo para hongos”
Si hubo desarrollo se debe recurrir al POE de identificación (AMID) correspondiente a cada caso : POE Identificación Levaduras (AMID02), POE Identificación Dermatofitos (AMID01), POE Identificación no Dermatofitos (AMID03), POE Identificación Levaduras Lipofílicas (AMID04)
c) Interpretación:
Examen directo Cultivo Jerarquizar
Negativo Negativo Si
Positivo Negativo Si
Negativo Positivo Sólo si se aísla dermatofito
Negativo Positivo para levaduras
Si hay desarrollo en los 3 puntos de siembra y compatibi- lidad con las características clínicas.
d) Tiempo de entrega :
El examen directo puede entregarse dentro de 48 horas El cultivo debe entregarse entre los 20 y 30 días.
8. FORMULARIOS Y REGISTROS:
Registro de pacientes:
General del Laboratorio (libro, informático, etc) Libro interno de Micología
Ficha de derivación de la Red de Micología GCBA Ficha de derivación fuera de la Red
Informes:
Protocolo resultado de Micosis Superficiales
Fotocopia de informe de Hospital emisor de resultado a través de la Red
PA ( Manual de Procedimiento Pre- analítico)
PAMR (Manual de Procedimiento : Medios de cultivo y Reactivos) AMID (Manual de Procedimiento: Identificación Micológica ) MB (Manual de Procedimiento: Bioseguridad)
10. ANEXOS
Flujograma Planillas
11. CRITERIOS DE RECHAZO:
Si continuó con la aplicación de pomadas, cremas o polvos sobre la piel desde 3 días anteriores a la toma de muestra.
1. OBJETIVOS:
Desarrollar el procedimiento a seguir para el examen directo y cultivo de los hongos presentes en muestras de cuero cabelludo.
2. ALCANCE:
Todas las muestras de cuero cabelludo extraídas de acuerdo a las indicaciones de toma de muestra (PATT), para confirmar o descartar el diagnóstico clínico presuntivo de micosis.
3. PERSONAL AFECTADO:
Bioquímicos y técnicos del sector Microbiología, área Micología, pertenecientes a los Laboratorios de los Hospitales del GCBA
4. REFERENCIAS:
Micología Médica Ilustrada, Roberto Arenas Guzmán, Nueva Editorial
Interamericana, 3ra edición, México, 2008
Manual de Procedimientos para Laboratorios de Micología Médica, Prof. Dr. Ricardo Negroni, Dra. Liliana Guelfand y col. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana supl. 1, editado por la Federación Bioquímica de la Prov. de Bs. As. Argentina, 1999
5. DEFINICIONES:
Etapa Pre- Analítica
PAMR: Manual de Medios y Reactivos PATT: Manual de Toma y Transporte de muestras
Elaborado por: S.Cataldi, M.C.Perrone , L.Guelfand Fecha: 8 de febrero 2008
Versión Original
Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM Fecha: agosto 2011
Revisado: S.Cataldi,L.L.Moral,I Maldonado, L.Guelfand Fecha: julio 2011
Etapa Analítica
AMID: Manual de Identificación 01 Dermatofitos
04 Levaduras Lipofílicas
APOE: Manual de procedimiento Operativo Etapa Post- Analítica
PPFI: Formularios e Informes MC: Manual de Calidad
MB: Manual de Bioseguridad
6. RESPONSABILIDADES:
Jefe de Sector ó Sección Microbiología/ Micología, Bioquímicos a cargo del área Micología
7. DESARROLLO:
7.1 FUNDAMENTO DEL MÉTODO
El diagnóstico de las micosis superficiales de cuero cabelludo se basa en el hallazgo de hifas o levaduras características del género Malassezia, en el examen microscópico directo y el aislamiento del agente causal en los cultivos. 7.2 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS:
Microscopio con objetivos de 10x, 40x y opcional 100x (inmersión) Heladera 2- 8º C
Estufa de cultivo a 30 a 34 ºC (para Malassezia) Estufa de cultivo a 28 ºC
Mechero a gas o eléctrico Gradillas para tubos Portaobjetos
Cubreobjetos
Hojas de bisturí descartables estériles y/o sindesmótomos estériles Pinza de depilar
Gancho en L
Agujas de disección
Guantes de látex descartables
Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol u otro antibiótico o Agar lactrimel con cloranfenicol
Agar Dermatophyte Test Médium o Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol y cicloheximida
Agar Dixon
Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol y aceite de oliva (SAO) Agar Bilis de Buey (ABB)
Agar Danker (ADK)
7.3 PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS Y MEDIOS:
Ver Manual operativo de Medios y Reactivos (PAMR)
7.4 MUESTRA A ANALIZAR:
Escamas de cuero cabelludo y pelos arrancados de raíz, recolectadas en forma estéril
7.5 SECUENCIA OPERATIVA:
Precauciones de seguridad:
Consultar el Manual de Bioseguridad (MB) Procesamiento de la muestra:
A cada muestra se le asigna un número interno correlativo, siguiendo el orden consecutivo del libro correspondiente o sistema informático propio de cada Laboratorio. De la muestra obtenida se destinará una parte para el examen directo microscópico, otra para el cultivo y de ser posible reservar material para confirmar -si hiciera falta- el resultado del examen directo.
a) Examen directo microscópico: para aclarar la capa córnea del cuero cabelludo, es indispensable recurrir a diversas soluciones que disuelve la queratina sin afectar la morfología de los elementos fúngicos. Las más comunes son las de hidróxido de potasio (KOH)
en concentraciones del 10% al 40%, solo o con tinta azul negra permanente de PARKER, KOH con dimetilsulfóxido o blanco de calcoflúor para muestras poco parasitadas. Ver (PRMR). Si se emplea KOH, suspender las escamas en una gota del mismo con o sin tinta Parker, cubrir con un cubreobjeto, calentar en la llama del mechero, (evitando llegar a ebullición y formación de burbujas de aire en el preparado), enfriar rápidamente sobre la mesada.
b) Cultivos: La segunda parte del material, se utiliza para la realización de los cultivos en medios sólidos. Se sugieren dos o tres medios: Sabouraud – miel, Lactrimel, Dermatofitos medios: con y sin cicloheximida (Ver PAMR).
Cuando se sospecha dermatitis seborreica, se debe sembrar el material en medios ricos en lípidos (ácidos grasos de cadena larga) como el Medio de Dixon, o en su defecto agar miel Sabouraud con el agregado de aceite de oliva estéril (al 2%) (SAO), Medio de Danker (ADK), medio de Dixon (ADX) ó agar Sabouraud con bilis de buey (ABB).
Para sembrar el material, se deben fragmentar las escamas lo más posible, para inocularlas a la superficie del medio de cultivo con un gancho metálico fino, esterilizado a la llama y enfriado en la superficie del agar. Si se emplean tubos, efectuar tres toques en el medio separados por lo menos por 1 cm de distancia entre ellos. Emplear dos o tres tubos con los medios de cultivo elegidos. La incubación se lleva a cabo a temperatura ambiente o en estufas reguladas a 25º ó 28º C.
Si de acuerdo a los datos epidemiológicos del paciente se sospecha
Trichophyton verrucosum se deberá incubar a 37 º C uno de los
tubos sembrados.
Cuando se siembran medios para búsqueda de Malassezia spp, se incubarán de 32 a 35 º C durante 7 días en aerobiosis.
Examinar los cultivos una ó dos veces por semana hasta completar las 3 semanas de incubación.
RESULTADOS:
a) Examen directo:
Si no hubo hallazgo se informa:
Si hubo hallazgo se informa según el caso:
“Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas.
“Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas, características de dermatofitos”
“Se observan levaduras compatibles con “ Malassezia spp”
"Se observa pelo endothrix" (cadenas de artrosporos dentro del tallo piloso)
"Se observa pelo ectothrix" (vaina de esporas en mosaico o cadenas de artrosporos por fuera del tallo del pelo)
"Se observa pelo endo-ectothrix" (cadenas de artrosporos dentro y fuera del tallo piloso)
“Se observa pelo fávico” (hifas y burbujas de aire dentro del tallo del pelo)
b) Cultivo:
Si durante el lapso indicado de incubación no se obtuvo desarrollo se descartan los cultivos y se informan “No se obtuvo desarrollo de hongos” o “Cultivo negativo para hongos”
Si hubo desarrollo se debe recurrir al POE de identificación (AMID) correspondiente a cada caso:
POE Identificación Dermatofitos (AMID01), POE Identificación filamentosos (AMID04), POE Identificación Levaduras Lipofílicas (AMID03)
c) Interpretación:
Examen directo Cultivo Jerarquizar
Negativo Negativo Si
Positivo Negativo Si
Negativo Positivo Sólo si se aísla dermatofito
d) Tiempo de entrega :
El examen directo puede entregarse dentro de 48 horas o junto con el cultivo
8. FORMULARIOS Y REGISTROS:
Registro de pacientes:
General del Laboratorio (libro, informático, etc.) Libro interno de Micología
Ficha de derivación de la Red de Micología GCBA Ficha de derivación fuera de la Red
Informes:
Protocolo resultado de Micosis Superficiales
Fotocopia de informe de Hospital emisor de resultado a través de la Red
9. DOCUMENTOS ASOCIADOS:
PA ( Manual de Procedimiento Pre- analítico)
PAMR (Manual de Procedimiento : Medios de cultivo y Reactivos) AMID (Manual de Procedimiento: Identificación Micológica ) MB (Manual de Procedimiento: Bioseguridad)
10. ANEXOS
Flujograma Planillas
11. CRITERIOS DE RECHAZO:
Cuando el paciente no suspendió la medicación antifúngica sistémica (de 10 a 15 días) o local (de 3 a 5 días) los días anteriores a la toma de muestra.
Si continuó con la aplicación de pomadas, cremas o polvos sobre el cuero
1. OBJETIVOS:
Desarrollar el procedimiento a seguir para el examen directo y cultivo de los hongos presentes en muestras superficiales de uñas.
2. ALCANCE:
Todas las muestras de uñas extraídas de acuerdo a las indicaciones de toma de muestra (PATT), para confirmar o descartar el diagnóstico clínico presuntivo.
3. PERSONAL AFECTADO:
Bioquímicos y técnicos del sector Microbiología, área Micología, pertenecientes a los Laboratorios de los Hospitales del GCBA
4. REFERENCIAS:
Micología Médica Ilustrada, Roberto Arenas Guzmán, Nueva Editorial Interamericana, 3 a edición, México, 2008
Manual de Procedimientos para Laboratorios de Micología Médica, Prof. Dr. Ricardo Negroni, Dra. Liliana Guelfand y col. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana supl. 1, editado por la Federación Bioquímica de la Pcia. De Bs. As. Argentina, 1999
5. DEFINICIONES:
Etapa Pre- Analítica
PAMR: Manual de Medios y Reactivos
PATT: Manual de Toma y Transporte de muestras
Elaborado por: S.Cataldi, M.C Perrone, L.Guelfand Fecha: 6 de marzo 2008
Versión Original
Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM Fecha: julio de 2011
Revisado: ,L.L.Moral, I.Maldonado Fecha: julio 2011
Etapa Analítica
AMID: Manual de Identificación 01. Dermatofitos
02. Levaduras
03. Hongos Filamentosos
APOE: Manual de procedimientos operativos Estándar
Etapa Post- Analítica
PPFI: Formularios e Informes MC: Manual de Calidad
MB: Manual de Bioseguridad MA: Manual Administrativo ANEXOS
PLANILLAS
6. RESPONSABILIDADES:
Jefe de Sección Microbiología, Bioquímico a cargo del área Micología
7. DESARROLLO:
7.1 FUNDAMENTO DEL MÉTODO
El diagnóstico de las micosis superficiales de uñas se basa en el hallazgo de hifas o levaduras características, en el examen microscópico directo y el aislamiento del agente causal en los cultivos.
7.2 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS:
Microscopio con objetivos de 10x, 40x y opcional 100x (inmersión) Heladera 2- 8º C
Estufa de cultivo a 35- 37ºC Estufa de cultivo a 28ºC Mechero a gas o eléctrico Gradillas para tubos
Portaobjetos de vidrio Cubreobjetos de vidrio
Hojas de Bisturí descartables estériles o sindesmótomo estéril Ansa bacteriológica
Gancho en L Aguja de disección
Guantes de látex descartables
Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol Agar lactrimel con cloranfenicol
Agar Dermatophyte Test Medium
Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol y actidiona Agar Miel Sabouraud
7.3 PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS Y MEDIOS:
Ver Manual operativo de Medios y Reactivos (PAMR)
7.4 MUESTRA A ANALIZAR:
Escamas de uñas recolectadas en forma estéril.
7.5 SECUENCIA OPERATIVA:
PRECAUCIONES DE SEGURIDAD: Consultar el Manual de Bioseguridad (MB)
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA:
A cada muestra se le asigna un número interno correlativo, siguiendo el orden consecutivo del libro correspondiente o sistema informático propio de cada Laboratorio. La muestra obtenida se destinará una parte para el examen directo microscópico, otra para el cultivo y de ser posible reservar material para confirmar si hiciera falta el examen directo.
a) Examen directo microscópico: para aclarar la estructura córnea de la uña es indispensable recurrir a diversas soluciones que disuelve la queratina sin afectar la morfología de los elementos fúngicos. Las más comunes son las de hidróxido de potasio (KOH) en concentraciones del 10% al 40%, con tinta azul negra permanente de PARKER, KOH con dimetilsulfóxido o blanco calcoflúor para muestras poco parasitadas . Ver (PAMR). Si se emplea KOH, suspender las escamas en una gota del mismo con o sin tinta Parker, cubrir con un cubreobjeto, calentar en la llama del mechero, (evitando llegar a ebullición y formación de burbujas de aire en el preparado) enfriando rápidamente sobre la mesada. b) Cultivos: La segunda parte del material, se utiliza para la
realización de los cultivos en medios sólidos. Se sugieren dos o tres medios: Sabouraud- miel, lactrimel, Agar banana- avena, Dermatofitos medio con y sin actidiona (Ver PAMR). Para sembrar el material, se deben fragmentar las escamas lo más posible, para inocularlas a la superficie del medio de cultivo con un gancho metálico fino, esterilizado a la llama y enfriado en la superficie del agar. Si se emplean tubos, efectuar tres toques en el medio separados por lo menos por 1 cm de distancia entre ellos. Emplear dos o tres tubos con los medios de cultivo elegidos. La incubación se lleva a cabo a temperatura ambiente o en estufas reguladas a 25º ó 28º C.
Si de acuerdo a los datos epidemiológicos del paciente se sospecha
Trichophyton verrucosum se deberá incubar a 37º C uno de los
tubos sembrados.
Examinar los cultivos una ó dos veces por semana hasta completar las tres semanas de incubación.
RESULTADOS:
a) Examen directo: Es conveniente entregar este resultado dentro de las 48 horas.
Si no hubo hallazgo se informa:
• “ No se observan elementos micóticos” Si hubo hallazgo se informa según el caso:
“Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas.
“ Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas, características de dermatofitos”
“ Se observan elementos levaduriformes”
b) Cultivo:
• Si durante el lapso indicado de incubación no se obtuvo desarrollo se
descartan los cultivos y se informan : “No se obtuvo desarrollo de
hongos” o “Cultivo negativo para hongos”
• Si hubo desarrollo se debe recurrir al POE de identificación (AMID) correspondiente a cada caso :
POE Identificación Levaduras (AMID02), POE Identificación Dermatofitos (AMID01), POE Identificación no Dermatofitos (AMID03).
• Si hubo desarrollo de un hongo micelial no dermatofito se debe pedir: “Nueva muestra para confirmar el diagnostico”. En la segunda muestra se propone informar junto al genero (y especie) del hongo aislado:
“Hongo infrecuente como agente etiológico de onicomicosis, pero se jerarquiza el resultado por haberse aislado en dos muestras consecutivas con directos positivos”.
Interpretación:
Examen directo Cultivo Jerarquizar
Positivo Positivo Sí
Positivo Negativo Si
Negativo Positivo Sólo si se aísla dermatofito
Negativo Positivo para
Si es una muestra de uñas de mano, si hay desarrollo en los
levaduras 3 puntos de siembra de todos los tubos sembrados y si es
compatible con las características clínicas.
c) Tiempo de entrega :
El examen directo puede entregarse dentro de 48 horas o junto con el cultivo
El cultivo debe entregarse entre los 20 y 30 días.
8. FORMULARIOS Y REGISTROS:
Registro de pacientes:
General del Laboratorio (libro, informático, etc) Libro interno de Micología o sistema informatico Ficha de derivación de la Red de Micología GCBA Ficha de derivación fuera de la Red (ej: Inst. C.Malbran) Informes:
Protocolo resultado de Micosis Superficiales
Fotocopia de informe de Hospital emisor de resultado a través de la Red
9. DOCUMENTOS ASOCIADOS:
PAMR (Manual de Procedimiento : Medios de cultivo y Reactivos) AMID (Manual de Procedimiento: Identificación Micológica) MB (Manual de Procedimiento: Bioseguridad)
10. ANEXOS
Flujogramas Planillas
Si continuó con la aplicación de pomadas, cremas o polvos sobre la piel desde 3 días anteriores a la toma de muestra.
Si se trata de uñas de pies y el paciente concurrió sin medias y con calzado abierto.
1. OBJETIVOS:
Desarrollar el procedimiento a seguir para el examen directo y cultivo de los hongos presentes en muestras respiratorias
2. ALCANCE:
Todas las muestras respiratorias como material de estudio para el diagnóstico de las micosis broncopulmonares.
3. PERSONAL AFECTADO:
Bioquímicos y técnicos del sector Microbiología, área Micología, pertenecientes a los Laboratorios de los Hospitales del GCBA
4. REFERENCIAS:
Micología Médica Ilustrada, Roberto Arenas Guzmán, Nueva Editorial Interamericana, 3a edición, México, 2008
Manual de Procedimientos para Laboratorios de Micología Médica, Prof. Dr. Ricardo Negroni, Dra. Liliana Guelfand y col. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana supl. 1, editado por la Federación Bioquímica de la Pcia. De Bs. As. Argentina, 1999
Guía práctica de Identificación y Diagnóstico en Micología Clínica. Javier Pemán, Estrella Martín-Mazuelos, María del Carmen Calvo. Revista
Iberoamericana de Micología. 1a edición. Bilbao, España. 2001
5. DEFINICIONES:
Etapa Pre- Analítica
PAMR: Manual de Medios y Reactivos
PATT: Manual de Toma y Transporte de muestras Elaborado por: M.Carmen Perrone,S.Cataldi, L.Guelfand
Fecha: 6 de marzo 2008 Versión Original
Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM Fecha: abril 2011
Revisado por: L.López Moral, L.Guelfand Fecha: enero 2011
Etapa Analítica
AMID: Manual de Identificación
APOE: Manual de procedimiento Operativo Etapa Post- Analítica
PPFI: Formularios e Informes MC: Manual de Calidad
MB: Manual de Bioseguridad MA: Manual Administrativo
6. RESPONSABILIDADES:
Bioquímico a cargo a cargo del área Micología.
7. DESARROLLO:
7.1 FUNDAMENTO DEL MÉTODO
El diagnóstico de las micosis del aparato respiratorio se basa en el hallazgo de hifas o levaduras características, en el examen microscópico directo y el aislamiento del agente causal en los cultivos.
7.2 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS:
Microscopio con objetivos de 10x, 40x, 100x (inmersión) Heladera 2- 8 ºC
Estufa de cultivo a 35 - 37 ºC Estufa de cultivo a 28 ºC Mechero a gas o eléctrico Gradillas para tubos Portaobjetos
Cubreobjetos
Hojas de bisturí descartables estériles o sindesmótomos estériles Ansa bacteriológica
Gancho en L
Agujas de disección
Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol (SAB+C) (Obligatorio) o Agar Miel Sabouraud (SAB-M)
Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol y actidiona (SAB+C+A) Agar BHI con ó sin 5% sangre ovina, con cloranfenicol
Agar sangre
Otros medios: Agar girasol, Agar glicerinado, Agar tabaco, Agar opacidad, etc. N-acetil cisteína
7.3 PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS Y MEDIOS:
Ver Manual operativo de Medios y Reactivos (PAMR)
7.4 MUESTRA A ANALIZAR
Muestras obtenidas por expectoración espontánea o por procedimientos invasores según instrucciones del manual (PATT)
7.5 SECUENCIA OPERATIVA
7.5.1 Precauciones de seguridad:
Consultar el Manual de Bioseguridad (MB)
Utilizar guantes o manoplas descartables para el procesamiento de la muestra.
7.5.2 Procesamiento de la muestra:
A cada muestra se le asigna un número interno correlativo, siguiendo el orden consecutivo del libro correspondiente o sistema informático propio de cada Laboratorio. La muestra remitida se destinará una parte para el examen directo microscópico, otra para el cultivo
A. ESPUTO –ASPIRADO TRAQUEAL
a) Examen microscópico: Volcar el esputo en una placa de Petri estéril, examinar macroscópicamente, seleccionar una parte purulenta y separarla con un ansa estéril o con agujas de disección. Colocar una gota del material así obtenido entre porta y cubreobjeto para realizar el examen microscópico al estado fresco. Con la porción restante efectuar extendidos para coloración de Giemsa, Gram-Weigert, Ziehl Neelsen, Grocott, Azul de Toluidina-O. El examen en fresco se realiza inicialmente
con 100x a fin de recorrer rápidamente varios campos y reconocer si la muestra es representativa, para ello la muestra de esputo apropiada debe tener > de 25 leucocitos (polimorfonucleares neutrófilos) y < 25 células epiteliales escamosas por campo de 100x dependiendo del agente causal. Sin embargo en los pacientes inmunosuprimidos (neutropenicos, VIH +, trasplantados, con tratamientos prolongados con corticoides) aún las muestras poco representativas deben ser sometidas a estudios mediante tinciones, en busca de hongos.
Completar el estudio mediante la observación con 400x. de la
muestra. Este paso permite la visualización de hongos de dimensiones medianas o grandes, con pared celular gruesa y refringente tales como: seudohifas y blastoconidias de Candida, hifas ramificadas y tabicadas de Aspergillus, Pseudallescheria, etc, filamentos ramificados no septados de zigomicetos, elementos de las formas parasitarias de Paracoccidioides brasiliensis, Histoplasma capsulatum var duboisii, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis y acúmulos de Pneumocystis jirovec i, (estos últimos se ven mejor en el BAL). Los extendidos teñidos deben examinarse con óptica de inmersión a 1000x. La coloración de Giemsa es útil para observar elementos levaduriformes de Histoplasma capsulatum, la fase parasitaria de Penicillium marneffei, las formas tróficas de Pneumocystis jiroveci y es también la mejor tinción para reconocer las células de la muestra. De estas últimas tienen particular interés los eosinófilos en la aspergilosis broncopulmonar alérgica y los macrófagos en la histoplasmosis y penicilosis. Una variante de la observación al estado fresco es la preparación con tinta china, ver (PAMR) útil para ver las levaduras capsuladas de Cryptococcus neoformans ó C. gatti. Para la búsqueda de P. jiroveci, el material ideal es el BAL, pero cuando éste no puede realizarse, como segunda opción puede recurrirse al esputo inducido mediante nebulizaciones tibias con solución salina isotónica. Este microorganismo puede observarse en fresco a 400x, pero debe confirmarse con extendidos teñidos por las técnicas descriptas
en el manual de medios y reactivos (PAMR) Las muestras muy
viscosa oueden fluidificarse antes de la siembra empleando algún agente mucolitico (N-acetil cisteína), dejándola actuar a temperatura ambiente hasta que se consigue la fluidificación..
b) Cultivo: Una vez finalizado el examen microscópico se puede agregar al esputo 10 ml de una solución de antibióticos antibacterianos, conteniendo 100 ug/ml de cloranfenicol-estreptomicina y dejar en la heladera a 4ºC durante 24 hs.
directamente la siembra del material en tubos de ensayo con medio de SAB glucosado o miel y agar BHI. Se emplean 6 tubos por muestra, la mitad se incuba a 28ºC y los restantes a 37ºC. Los medios de cultivo deben contener cloranfenicol-estreptomicina en la concentración final de 100 ug/ml, en general no se usa la cicloheximida porque puede impedir el desarrollo de Aspergillus, Cryptococcus, Penicillium, etc.
B. : Lavado broncoalveolar (BAL), MiniBAL y Lavado bronquial (LB) a) Examen microscópico: El BAL es un material de gran utilidad
para el estudio de las micosis broncopulmonares. Se obtiene por fibrobroncoscopía y reduce al mínimo la presencia de elementos contaminantes de la boca y vías aérea superiores. Si la muestra fue adecuadamente obtenida exhibe, un neto predominio de macrófagos alveolares ó células inflamatorias, prácticamente no se observan células bronquiales o epiteliales planas de la boca. El BAL se considera significativo cuando el recuento de células epiteliales planas es < 1 %. Si la muestra no va a ser examinada inmediatamente, se la refrigera a 4ºC. Centrifugar toda la muestra, separar el sobrenadante y con el sedimento llevar a cabo los mismos pasos propuestos para el examen de esputo. El sobrenadante podrá ser utilizado para la detección de ciertos antígenos de hongos patógenos como. Aspergillus fumigatus, y Cryptococcus neoformans por aglutinación de partículas de látex o por técnicas de ELISA.
El valor diagnóstico del hallazgo de las diferentes especies fúngicas que colonizan o parasitan el aparato respiratorio es muy distinto. La presencia de ciertas especies, aunque sólo sea en cultivos, tiene importancia cuando se trata de patógenos primarios como: P. brasiliensis, H. capsulatum, C. immitis, B, dermatitidis y P. marneffei . Otras especies sólo tienen valor cuando se los encuentra en el examen microscópico directo y se los cultiva en forma reiterada de diferentes muestras, como son las especies del género Aspergillus, Fusarium spp, Pseudallescheria boydii y Nocardia asteroides. Finalmente algunos hongos sólo pueden ser considerados responsables de la patología respiratoria cuando son observados como invasores de los tejidos en los estudios histopatológicos de biopsia, piezas quirúrgicas, en pacientes inmunosuprimidos; en este caso se encuentran C. albicans y otras especies del género.
7.5.3 Resultados:
a) Examen microscópico:
Directo: Es conveniente entregar un resultado de los elementos
observados lo más rápido posible como informe preliminar.
Si no hubo hallazgo se informa: “No se observan elementos micóticos”
Si hubo hallazgo se informa según el caso:
¾ Se observan células levaduriformes con blastoconidias y / o seudomicelios
¾ Se observan células levaduriformes esféricas de brotación múltiple o en rueda de timón
¾ Se observan células esféricas de brotación simple (unigemantes) de cuello ancho
¾ Se observan cuerpos esféricos con endosporos ó esférulas
¾ Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas ¾ Se observan hifas cenocíticas
¾ Se observan elementos compatibles con P. jiroveci. Tinta china:
Si no hubo hallazgo se informa: “Negativa”
Si hubo hallazgo se informa: “Se observan levaduras capsuladas”
Coloración de Giemsa:
Si no hubo hallazgo se informa: “Negativa”
Si hubo hallazgo se informa según el caso:
¾ Se observan células levaduriformes con blastoconidias y / o seudomicelios.
¾ Se observan células levaduriformes esféricas de brotación múltiple o en rueda de timón.
¾ Se observan células esféricas de brotación simple (unigemantes) de cuello ancho.
¾ Se observan cuerpos esféricos con endosporos ó esférulas.
¾ Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas. ¾ Se observan hifas cenocíticas.
¾ Se observan levaduras en casquete intracelulares. ¾ Se observan elementos compatibles con P. jiroveci Coloración de Gram-Weigert:
Si no hubo hallazgo se informa: “Negativa”
Si hubo hallazgo se informa: “Elementos compatibles con P. jiroveci”
Coloración de Azul de Toluidina-O: Si no hubo hallazgo se informa: “Negativa”
Si hubo hallazgo se informa: “Elementos compatibles con
P. jiroveci”
Coloración de Grocott
Si no hubo hallazgo se informa: “Negativa”
Si hubo hallazgo se informa: “Elementos compatibles con
P. jiroveci”
¾ Se observan células levaduriformes con blastoconidias y / o seudomicelios.
¾ Se observan células levaduriformes esféricas de brotación múltiple o en rueda de timón.
¾ Se observan células esféricas de brotación simple (unigemantes) de cuello ancho.
¾ Se observan cuerpos esféricos con endosporos ó esférulas.
¾ Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas. ¾ Se observan hifas cenocíticas.
¾ Si no hubo desarrollo durante el lapso indicado de incubación se descartan los cultivos y se informa: “No se obtuvo desarrollo de hongos”
¾ Si hubo desarrollo recurrir al manual de identificación (AMID) según el caso e informar: “Género y especie”
7.5.4 Interpretación:
El hallazgo de un hongo tiene valor diagnóstico por si solo si se trata de un patógeno primario
El hallazgo de un hongo saprófito ó comensal, tiene valor diagnóstico cuando se conjuga con los datos clínicos y epidemiológicos del paciente.
Tiempo de entrega:
De 1 a 4 semanas
8. FORMULARIOS Y REGISTROS:
Registro de pacientes:
General de laboratorio ( libro, informático, etc) Libro interno de Micología
Ficha de examen micológico
Ficha de derivación de la Red de Micología GCBA Informes:
Protocolo de examen micológico
Fotocopia de informe de Hospital emisor de resultado cuando es procesado a través de la Red de Micología GCBA
9. DOCUMENTOS ASOCIADOS:
PATT: Manual de toma y transporte de muestra PAMR: Manual de medios y reactivos
MB: Manual de bioseguridad MC: Manual de calidad MA: Manual administrativo
10. ANEXOS:
Flujogramas Planillas
11. CRITERIOS DE RECHAZO:
Si la muestra no cumple con las condiciones de toma, conservación y transporte de muestra ver (PATT)
1. OBJETIVOS:
Desarrollar el procedimiento a seguir para el examen directo y cultivo de los hongos presentes en muestras de orina
2. ALCANCE:
Todas las muestras de orina extraídas de acuerdo a las indicaciones de toma de muestra (PATT), para confirmar o descartar el diagnóstico clínico presuntivo.
3. PERSONAL AFECTADO:
Bioquímicos y técnicos del sector Microbiología, área Micología, pertenecientes a los Laboratorios de los Hospitales del GCBA
4. REFERENCIAS:
Candida Urinary Tract Infections- Epidemiology, Patogenesis, Diagnosis, and Treatment: Executive Summary. Fisher J. Clinical Infections Diseases 2011; 52 (Suppl 6) S 429-S432.
Diagnosis, prevention and treatment of catheter-associated urinary tract infection in adults. 2009 International Clinical Practice Guideline from the Infectious Diseases Society America. Urinary Catheter Guidelines. Hooton et al. CID 2010:50 (1 March)
• Cumitech 2C: Laboratory Diagnosis of Urinary Tract . Infections.Yvette S. McCarter, Eileen M. Burd , Gerri S. Hall , Marcus Zervos , Susan E. Sharp. March 2009.
• INFORME TÉCNICO.Consenso Argentino Intersociedades para el Manejo de la Infección del Tracto Urinario – Parte III. (Sociedades participantes: Soc. Argentina de Infectología (SADI), Soc. Argentina de Urología (SAU), Soc. Argentina de Medicina (SAM), Soc. Argentina de Bacteriología Clínica (SADEBAC), Soc. de Ginecología y Obstetricia de Elaborado por: M.C. Perrone.,S.Cataldi, L.Guelfand
Fecha: 6 de marzo 2008
Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM Fecha: julio 2011
Revisado por Ivana Maldonado, L. Guelfand Fecha: junio 2011
Buenos Aires (SOGIBA). Rev Panam Infectol 2008; 10(1):48-57.
Manual de Procedimientos para Laboratorios de Micología Médica, Prof. Dr. Ricardo Negroni, Dra. Liliana Guelfand y col. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana supl. 1, editado por la Federación Bioquímica de la Pcia. De Bs. As. Argentina, 1999.
5. DEFINICIONES:
Etapa Pre- Analítica
PAMR: Manual de Medios y Reactivos
PATT: Manual de Toma y Transporte de muestras
Etapa Analítica
AMID: Manual de Identificación
APOE: Manual de procedimientos operativos Estándar
Etapa Post- Analítica
PPFI: Formularios e Informes MC: Manual de Calidad
MB: Manual de Bioseguridad
6. RESPONSABILIDADES:
Jefe de Sección Microbiología, Bioquímico a cargo del área Micología
7. DESARROLLO:
La confirmación microbiológica del diagnóstico de infección urinaria por agentes micóticos cuando se observan en el sedimento de la muestra y / o se aísla el agente causal en los cultivos.
7.2 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS:
Microscopio con objetivos de 10x, 40x y opcional 100x ( inmersión ) Heladera 2- 8º C
Estufa de cultivo a 35- 37ºC Estufa de cultivo a 28ºC Mechero a gas o eléctrico Gradillas para tubos Portaobjetos de vidrio Cubreobjetos de vidrio
Ansa bacteriológica de 5 ul (factor de dilución 1/200) o de 10 ul Guantes de látex descartables
Agar CLDE
Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol Agar cromogénico para levaduras
Agar semilla de girasol ó Agar tabaco Tinta China
Coloración de Giemsa
7.3 PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS Y MEDIOS:
Ver Manual operativo de Medios y Reactivos (PAMR)
7.4 MUESTRA A ANALIZAR:
Muestras de orina recolectadas en forma estéril (PATT) 7.5 SECUENCIA OPERATIVA:
7.5.1 Precauciones de seguridad:
Consultar el Manual de Bioseguridad (MB)
Utilizar guantes o manoplas descartables para la toma de muestra y procesamiento.
A cada muestra se le asigna un número interno correlativo, siguiendo el orden consecutivo del libro correspondiente ó sistema informático propio de cada Laboratorio.
a) Examen microscópico: Se centrifugan 10 ml de orina a baja velocidad (2000 r.p.m.) durante 10 minutos. El sedimento es examinado el estado fresco, entre porta y cubreobjetos, sin ningún agregado ó con una gota de tinta china diluida cuando se sospecha una criptococosis. La observación se lleva a cabo con óptica seca de 400X. El examen microscópico del sedimento permite observar seudohifas y blastoconidias de las
especies de Candida, así como también elementos
levaduriformes capsulados de Cryptococcus en las preparaciones con tinta china. Paracoccidioides brasilensis se visualiza en las preparaciones al estado fresco al igual que el Blastomyces dermatitidis Si por datos epidemiológicos la sospecha es Histoplasma capsulatum se debe realizar un extendido teñido con la coloración de Giemsa.
b) Cultivos: Para realizar el urocultivo se utiliza un ansa calibrada
de 5 µl (factor de dilución 1/200 ) o un ansa de 10 µl (factor de dilución 1/100). Se siembra la orina (sin centrifugar) en una placa de Petri con agar CLDE. En pacientes sondados y en muestras de punción suprapúbica se siembra además 100 µl de orina en CLDE y Agar sangre. Si en directo se observaron levaduras, sembrar tambien en Sabouraud glucosado y/o agar cromogénico. La incubación se efectúa de 35 a 37ºC durante 48hs. Cada colonia crecida equivale a 200 UFC/ml. cuando usamos ansa de 5 µl y equivale a 100 UFC/ml cuando se utiliza un ansa de 10 µl. Si en el examen directo se observan agentes micóticos diferentes a levaduras, se puede sembrar el sedimento urinario en Sabouraud glucosado y agar BHI a 2 temperaturas (28 y 35-37 ºC. Con el objeto de acelerar la identificación de C. neoformans, la muestra de orina puede ser sembrada directamente en medios que detecten la presencia de fenoloxidasa ver (PRMR), e incubados por 7 días.
c) Reacciones imnumológicas: El sobrenadante de la orina
puede ser utilizado para la búsqueda de antígenos fúngicos, especialmente polisacárido capsular de C. neoformans, por la técnica de aglutinación de partículas de látex sensibilizadas con gamma-globulina de conejo anti-C. neoformans. También pueden buscarse otros antígenos, como las glucoproteínas de Aspergillus spp .
7.5.3 Resultados:
a) Examen microscópico:
Si no hubo hallazgo se informa:
“ No se observan elementos micóticos” o “Negativo para hongos”
Si hubo hallazgo se informa según el caso:
“ Se observan levaduras y/o seudomicelios” “ Se observan levaduras capsuladas”
“Se observan elementos levaduriformes esféricos de brotación múltiple, anisométrica o en rueda de timón”
“Se observan elementos levaduriformes con artrosporas o blastoartrosporas.
“ Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas” “ Se observan hifas cenocíticas”
“ Se observan cuerpos esféricos con endosporas ó esférulas”
NOTA: Sólo en el caso de sospecha epidemiológica de histoplasmosis se informa lo observado en la coloración de Giemsa
Si no hubo hallazgo: “ No se observan elementos micóticos” o “Negativo”
Si hubo hallazgo: “Se observan levaduras intracelulares en casquete”
b) Cultivo:
Si no hubo desarrollo durante el lapso indicado de incubación se descartan los cultivos y se informa “Sin desarrollo” ó “Negativo” Monoespecie:
Si hubo desarrollo recurrir al manual de identificación (AMID) e informar: “género y especie”
Recuento de colonias: se informa en el caso de candidurias Se expresa en UFC/ml
Cuando se siembran 5ul, cada colonia crecida equivale a 200 UFC/ml. Cuando se siembran 10ul, cada colonia crecida equivale a 100 UFC/ml. Cuando se siembran 100 ul, cada colonia crecida equivale a 10UFC/ml
A diferencia de lo que sucede en las bacteriurias, no hay consenso sobre la utilidad de los cultivos cuantitativos cuando el agente patógeno es un hongo, algunos autores sugieren que el recuento de 1.000 a 10.000 UFC/ml es significativo para las candidurias y cuando se trata de pacientes sondados se habla de un recuento de 100 UFC/ml.
Polimicrobiano:
Solicitar nueva muestra según manual de toma y transporte de muestra (PATT), en el caso de pacientes sondados, con reciente recambio de sonda o por punción suprapúbica.
7.5.4 Interpretación:
Es importante la repetición del urocultivo para confirmar el diagnóstico de candiduria en particular en aquellos pacientes con sonda vesical o en muestras obtenidas por catéter.
En el caso de muestras provenientes de punción suprapúbica se jerarquiza el desarrollo de cualquier hongo, sin tener en cuenta el recuento de colonias y NO se solicita una segunda muestra.
En el caso de muestras de neonatología, se jerarquiza el desarrollo de cualquier hongo, sin tener en cuenta el recuento de colonias y NO se solicita una segunda muestra.
En los cultivos polimicrobianos (más de una especie) se jerarquiza el resultado si se obtienen las mismas especies en más de una muestra. El hallazgo de un hongo tiene valor diagnóstico por si solo si se trata de
un patógeno primario.
El hallazgo de un hongo saprofito ó comensal tiene valor diagnóstico cuando se conjuga con los datos clínicos y epidemiológicos del paciente.
Tiempo de entrega:
Entre 3 a 5 días hábiles en el caso de levaduras y hasta 30 días cuando se trata de patógenos de lento crecimiento.
8. FORMULARIOS Y REGISTROS:
Registro de pacientes:
General de laboratorio ( libro, informático, etc.) Libro interno de Micología o sistema informático Ficha de examen micológico
Informes:
Protocolo examen Micológico
Fotocopia de informe de Hospital emisor de resultado cuando es procesado a través de la Red de Micología
9. DOCUMENTOS ASOCIADOS:
PATT: Manual de toma y transporte de muestra PAMR: Manual de medios y reactivos
AMID: Manual de identificación MB: Manual de bioseguridad MC: Manual de calidad 10. ANEXOS: Flujograma Planillas 11. CRITERIOS DE RECHAZO:
Si el paciente no cumple con las condiciones de toma, conservación y transporte de muestra según (PATT)
Si el paciente tiene medicación antifúngica sistémica previa a la toma de la muestra.
ANEXO 1:
FLUJOGRAMA ORINAS Punción suprapúbica Chorro medio (OCM) Al acechoMUESTRA DE ORINA
Sonda (OSV) Nefrosomía EXAMEN MICROSCÓPICO del sedimento No Si “No se observan elementos micóticos” “Se observan levaduras y/o seudomicelios” crece? Si No “Sin desarrollo” ó “Negativo” Poli microbiano Mono microbiano agregar Sab. o agarcromogénico
Nueva muestra por mezcla polimicrobiana
Recuento de colonias
Desarrollo de levaduras (ID Pres) Candida albicans
Levadura no Calbicans
2° muestra Positiva
(con la misma identificación presuntiva)
1.000 a 10.000 UFC/ml (OCM) 100 UFC/ml (OSV)
Se solicita 2° muestra para confirmar el hallazgo (menos PSP)
Se observan hongos?
CULTIVO (OCM :siembra 5 µl/10 µl CLDE) (OSV, PSP:siembra 100µl CLDE – AS)
1. OBJETIVOS:
• Desarrollar el procedimiento a seguir para el examen directo y cultivo de los hongos presentes en muestras superficiales tanto de mucosas bucofaríngea y vaginal, como de semimucosas de labios, vulva y glande.
2. ALCANCE:
• Todas las muestras de mucosas y semimucosas extraídas de acuerdo a las indicaciones de toma de muestra (PATT), para confirmar o descartar el diagnóstico clínico presuntivo.
3. PERSONAL AFECTADO:
• Bioquímicos y técnicos del sector Microbiología, área Micología, pertenecientes a los Laboratorios de los Hospitales del GCBA
4. REFERENCIAS:
Micología Médica Ilustrada, Roberto Arenas Guzmán, Nueva Editorial Interamericana, 3ra edición, México, 2008
Manual de Procedimientos para Laboratorios de Micología Médica, Prof. Dr. Ricardo Negroni, Dra. Liliana Guelfand y col. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana supl. 1, editado por la Federación Bioquímica de la Pcia. de Bs. As. Argentina, 1999
5. DEFINICIONES: Etapa Pre- Analítica
MR: Manual de Medios y Reactivos
PATT: Manual de Toma y Transporte de muestras Elaborado por: S.Cataldi, M.C.Perrone, L.Guelfand
Fecha: 8 de enero 2008 Versión Original
Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM Fecha: agosto de 2011
Revisado por: : I.Maldonado, L.López Moral Fecha: agosto 2011
Etapa Analítica
AMID: Manual de Identificación 01. Levaduras
APOE: Manual de procedimiento Operativo Etapa Post- Analítica
PPFI: Formularios e Informes MC: Manual de Calidad
MB: Manual de Bioseguridad
6. RESPONSABILIDADES:
Jefe de Sector ó Sección Microbiología / Micología, Bioquímico/s a cargo del área Micología
7. DESARROLLO:
7.1 FUNDAMENTO DEL MÉTODO
El diagnóstico de las micosis superficiales de mucosas y semimucosas se basa en el hallazgo de seudohifas o levaduras, en el examen microscópico directo y el aislamiento del agente causal en los cultivos.
7.2 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS:
Microscopio con objetivos de 10x, 40x y opcional 100x (inmersión) Heladera 2-8 º C
Estufa de cultivo a 35-37 º C Estufa de cultivo a 28 º C Mechero a gas o eléctrico Gradillas para tubos Portaobjetos
Cubreobjetos
Hojas de bisturí descartables estériles y/o sindesmótomos estériles Ansa bacteriológica
Gancho en L
Agujas de disección
Guantes de látex descartables
Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol Agar lactrimel con cloranfenicol
Agar Miel Sabouraud Agar cromogénico
7.3 PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS Y MEDIOS:
Ver Manual operativo de Medios y Reactivos (PAMR)
7.4 MUESTRA A ANALIZAR:
Hisopados y frotis obtenidos en forma estéril, a partir de lesiones o secreciones de mucosas o semimucosas. Ver PATT.
7.5 SECUENCIA OPERATIVA:
PRECAUCIONES DE SEGURIDAD:
• Consultar el Manual de Bioseguridad (MB) PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA:
A cada muestra se le asigna un número interno correlativo, siguiendo el orden consecutivo del libro correspondiente o sistema informático propio de cada Laboratorio.
La muestra recolectada en el hisopo humedecido en SF o en medio de Stuart, se destina al cultivo, y la depositada en portaobjetos para el examen microscópico
a) Examen directo microscópico:
10x y 40x
• Luego, dejar secar, fijar y teñir con Giemsa al 10%, 30 minutos o con Azul
de metileno al 1% durante 30 minutos y si es necesario, realizar coloración de Gram.
b) Cultivos:
• Sembrar el hisopo en agar Sabouraud (SDA) y/o en agar cromogénico. • Incubar a 35º - 37º C durante 10 días.
• Examinar los cultivos una ó dos veces por semana hasta completar el período de incubación.
• Luego del cultivo primario es recomendable la siembra en un medio cromogénico (si no se hizo como siembra primaria).El medio cromogénico permite reconocer si en la muestra hay una o más especies.Con la colonia/s aisladas se puede iniciar la identificación presuntiva
RESULTADOS:
a) Examen directo: Es conveniente entregar este resultado dentro de las 24 horas.
Si no hubo hallazgo se informa:
“No se observan elementos micóticos”
Si hubo hallazgo se informa:
“Se observan elementos levaduriformes y/o seudohifas”
Debe consignarse además, la presencia de leucocitos o piocitos, células, bacterias y parásitos.
b) Cultivo:
• Si durante el lapso indicado de incubación no se obtuvo desarrollo se descartan los cultivos y se informan “ Negativo”
Si hubo desarrollo se debe recurrir al POE de identificación (AMID) correspondiente: POE Identificación Levaduras (AMID01)
c) Interpretación:
Examen directo Cultivo Jerarquizar
Negativo Negativo Si
Positivo Negativo Si
Negativo Positivo para
levaduras
Sólo si hay desarrollo masivo y en concordancia con las
características clínicas.
d) Tiempo de entrega :
1 El examen directo puede entregarse dentro de 24 horas o junto con el cultivo
2 El cultivo debe entregarse cumplidos los 10 días. 8. FORMULARIOS Y REGISTROS:
Registro de pacientes:
General del Laboratorio (libro, sistema informático, etc.) Libro interno de Micología
Ficha de derivación de la Red de Micología GCBA Ficha de derivación fuera de la Red
Informes:
Protocolo examen Micológico
Fotocopia de informe de Hospital emisor de resultado a través de la Red
9. DOCUMENTOS ASOCIADOS:
.
PAMR: etapa Pre-analítica- Manual de Medios y Reactivos
PATT: etapa Pre-analítica- Manual de Toma y Transporte de muestras AMID: etapa Analítica -Manual de Identificación.
APOE: etapa Analítica -Manual de Procedimientos Operativos Estándar PPFI: etapa Post-Analítica -Formularios e Informes
MC: Manual de Calidad MB: Manual de Bioseguridad
10. ANEXOS
Planillas
11. CRITERIOS DE RECHAZO:
Cuando el paciente no suspendió la medicación antifúngica sistémica (10 a 15 días) o local (3 a 5 días) los días anteriores a la toma de muestra.
Si continuó con la aplicación de pomadas, cremas o polvos sobre la mucosa afectada durante los 3 días anteriores a la toma de muestra.
Si los hisopos llegan al laboratorio secos, sin medio de transporte (agua destilada estéril, solución fisiológica estéril o Stuart)
1. OBJETIVO:
Desarrollar el procedimiento a seguir para el cultivo de hongos presentes en muestras de sangre.
2. ALCANCE:
Todas las muestras de sangre recolectadas de acuerdo a las indicaciones de toma de muestra (PRTT).
3. PERSONAL AFECTADO:
Personal profesional y Técnicos del sector Microbiología y Guardia 4. REFERENCIAS:
Esencial Procedures for Clinical Microbiology. H.D. Isenberg. ASM press, American Society for Mirobiology, Washington, D.C. 1998.
Manual de Procedimientos para Laboratorios de Micología Médica, Prof. Dr. Ricardo Negroni, Dra. Liliana Guelfand y col. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana supl. 1, editado por la Federación Bioquímica de la Pcia. De Bs. As. Argentina, 1999.
Manual of Clinical Microbiology. Murray y col. 8th
Edition ASM press U.S.A 2003.
Bianchi M, Robles AM, Vitale R, Helou S, Arechavala A, Negroni R. The usefulness of blood culture in the diagnosis of HIV-related systemic mycoses: evaluation of a manual lysis centrifugation method. Med Mycol 2000; 38: 77-80.
5. DEFINICIONES:
PAMR: etapa Pre-analítica- Manual de Medios y Reactivos
PATT: etapa Pre-analítica- Manual de Toma y Transporte de muestras AMID: etapa Analítica -Manual de Identificación.
APOE: etapa Analítica -Manual de Procedimientos Operativos Estándar PPFI: etapa Post-Analítica -Formularios e Informes
Elaborado por: L.Guelfand, M.Carmen Perrone,S.Cataldi Fecha: 6 de marzo 2008
Versión Original
Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM Fecha: 3 de agosto de 2011
Revisado por Laura López Moral, Liliana Guelfand. Fecha: junio 2011
MC: Manual de Calidad MB: Manual de Bioseguridad MA: Manual Administrativo LC: Lisis Centrifugación
6. RESPONSABILIDADES:
Jefe de Sección Microbiología o Micología Bioquímico a cargo del área Micología
7. DESARROLLO:
7.1 FUNDAMENTO DEL MÉTODO
El cultivo de sangre se basa en la detección de hongos que desarrollan en los frascos comerciales de equipos automatizados (Bactec o Bact Alert), en frascos de hemocultivos comerciales no automatizados (Britania) o por la técnica de lisis centrifugación (Isolator o de preparación en el laboratorio, ver PAMR). Este método es el más sensible y rápido para la recuperación de algunos hongos de la sangre, especialmente Histoplasma capsulatum, Cryptococcus neoformans y Fusarium spp.Presenta mejores resultados para los hongos filamentosos, que los obtenidos por las técnicas automatizadas o comerciales no automatizadas.
El hemocultivo para la búsqueda de hongos, se indica en caso de sospecha de fungemia en un huésped inmunocomprometido grave y en pacientes VIH positivos para la investigación de Histoplasma capsulatum, Cryptococcus neoformans, Fusarium spp, Candida spp y otras levaduras.
Cuando el paciente esta recibiendo alimentación parenteral hiperlipídica y se sospecha fungemia por Malassezia spp., se debe sembrar el material en medios ricos en ácidos grasos de cadena larga
7.2 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS:
Microscopio con objetivos de 10x, 40x y opcional 100x (inmersión) Heladera 2- 8º C
Estufa de cultivo a 32- 35ºC Estufa de cultivo a 28ºC Mechero a gas o eléctrico
Gradillas para tubos Portaobjetos
Cubreobjetos Gancho en L Aguja vacutainer
Guantes de látex descartables
Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol Agar Infusión Cerebro Corazón con cloranfenicol
Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol y aceite de oliva (SAO) Agar Dixon (ADX) o similares
7.3 PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS Y MEDIOS: Ver Manual operativo de Medios y Reactivos (PAMR)
7.4 MUESTRAS A ANALIZAR: Sangre:
La sangre es tomada en forma estéril y recolectada en tubo para la técnica de lisis centrifugación (LC) o en botellas de hemocultivos o en frascos especiales de equipos automatizados de acuerdo a las indicaciones del Manual de toma de muestra (PATT).
El método de LC se realiza colocando:
• 9 ml de sangre en un tubo estéril con 1 ml de saponina 5% y polianetol sulfonato de sodio al 0.4 % o EDTA para pacientes adultos • 1 a 3 ml de sangre para pacientes neonatos y pediátricos en 0,5 ml
de saponina 5% y polianetol sulfonato de sodio al 0.4 % o EDTA (Ver Anexo I Tabla de volemia)
7.5 SECUENCIA OPERATIVA:
7.5.1 Precauciones de Seguridad Biológica Consultar el Manual de Bioseguridad (MB) 7.5.2 Procesamiento de la Muestra:
A cada muestra se le asigna un número interno correlativo, siguiendo el orden consecutivo del libro correspondiente o sistema informático propio del Laboratorio. O bien se la prepara para su derivación de acuerdo a las indicaciones del PRTT.
Los tubos de LC se centrifugan a 3000 r.p.m. durante 30 minutos y se descarta el sobrenadante.
a) Examen directo microscópico No aplica
b) Cultivos:
En el método de LC, se siembra todo el sedimento en 4 tubos conteniendo medio de Sabouraud y agar infusión de cerebro y corazón (Ver PRMR). Cuando el paciente esta recibiendo alimentación parenteral hiperlipídica y se sospecha fungemia por Malassezia spp., se debe sembrar el material en medios ricos en ácidos grasos de cadena larga, como el Agar miel Sabouraud con el agregado de aceite de oliva estéril (SAO), Medio de Danker (ADK), Medio de Dixon (ADX) ó Agar Sabouraud con bilis de buey (ABB) . Ver Manual PAMR.
La sangre que se recolecta en los frascos comerciales de equipos automatizados o en frascos de hemocultivos comerciales no automatizados (ver PATT), se incuban directamente en estos envases.
La incubación de los tubos de LC se realiza a 28º C y 35-37º C, durante 3 a 4 semanas. Es necesario efectuar controles macroscópicos al menos 2 veces por semana para ver, si existe desarrollo micológico.
Los frascos de hemocultivos automatizados (Bactec, BacT-Alert) para gérmenes comunes, se incuban en su equipo de 5 días (para búsqueda de levaduras) a 3 semanas (para hongos sistémicos endémicos o filamentosos), a 35ºC.
Los frascos de Hemocultivos automatizados (Bactec, BacT Alert) especiales para micobacterias y hongos, se incuban en su equipo correspondiente durante 3 a 4 semanas, a 35-37ºC.
Los frascos de Hemocultivos comerciales no automatizados para gérmenes comunes, se incuban en estufa durante 3 a 4 semanas, a 35ºC.
Cuando se siembran medios para búsqueda de Malassezia spp, se incubarán de 32 a 35º C durante 3 semanas.
