FACULTAD DE CIENCIAS DEL MAR Y AMBIENTALES DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
EVALUACIÓN DEL USO DE ACEITES ESENCIALES Y SUS COMPUESTOS ACTIVOS COMO SEDANTES PARA REDUCIR EL ESTRÉS DURANTE EL TRANSPORTE DE
LA DORADA (Sparus aurata)
María José Flores Llano
07/09/2022
TRABAJO DE FIN DE GRADO (PERFIL INVESTIGADOR) GRADO EN CIENCIAS DEL MAR
ORIENTACIÓN EN RECURSOS VIVOS
Resumen
El desarrollo de una acuicultura sostenible debe tener en cuenta el correcto mantenimiento y las condiciones idóneas que permitan maximizar el crecimiento y bienestar de los peces.
El manejo o el transporte inadecuado de los peces pueden activar el sistema de estrés, reduciendo la eficiencia del cultivo y su salud. Con el objetivo de reducir este problema, se buscan alternativas capaces de minimizar el estrés y que no perjudiquen la salud de los peces y los consumidores. Por ello, los aceites esenciales y sus compuestos activos, debido a sus propiedades, pueden ser una alternativa natural interesante para mitigar del estrés asociado a las prácticas acuícolas. En el presente trabajo se testó el efecto sedante del aceite esencial de Cymbopogon flexuosus y del compuesto activo R-(+)-Limoneno en la dorada (Sparus aurata). Inicialmente, para conocer el sedante y concentración adecuada, se midieron los movimientos operculares/minuto, y se eligió la dosis de 30 µL/L de limoneno, ya que fue en la que se observó una reducción significativa de éstos.
Posteriormente, con la concentración adecuada, se simularon condiciones de transporte durante 6 horas en un segundo experimento para evaluar la eficacia sedante del limoneno.
Los grupos experimentales fueron: 0) Pre-transporte (no transportado); i) Control (sin tratamiento); ii) Etanol (con etanol) y iii) Limoneno (30 µL/L, disuelto en etanol). Tras el transporte, se observó una acidificación del agua respecto a las condiciones iniciales en todos los grupos transportados y una disminución del oxígeno que no fue tan pronunciada en el grupo tratado con limoneno. A nivel metabólico, los resultados mostraron un incremento significativo del cortisol y una disminución del lactato en los grupos transportados respecto a los peces sin transportar. Por otro lado, la glucosa mostró unos niveles más bajos en el grupo con limoneno llegando a alcanzar valores similares a los peces no transportados. En cuanto a los triglicéridos, se observaron diferencias significativas entre el grupo Control y Limoneno, siendo mayores en este último. En conclusión, los niveles altos de cortisol y glucosa se asocian a situaciones de estrés debido a una mayor demanda energética, mientras que unos niveles menores de lactato y mayores de triglicéridos y proteínas en plasma podrían indicar una reducción del metabolismo aerobio. Por tanto, el limoneno parece proporcionar un estado de sedación al reducir, durante un proceso de transporte, la respuesta fisiológica al estrés.
Abstract
The development of sustainable aquaculture must take into account the correct maintenance and the best conditions that allow maximizing fish growth and welfare.
Improper handling or transport of fish can activate the stress system, reducing farming efficiency and fish health. In order to reduce this problem, alternatives are sought that are capable of minimizing stress without harming the fish and consumer health. Therefore, essential oils and their active compounds, due to their properties, can be an interesting natural alternative to mitigate the stress associated with aquaculture practices. In the present work, the sedative effect of the essential oil of Cymbopogon flexuosus and the active compound R-(+)-Limonene in gilthead sea bream (Sparus aurata) was tested.
Initially, to determine the appropriate sedative and concentration, opercular movements/minute were measured, and the dose of 30 µL/L of limonene was chosen, since it was the one in which a significant reduction was observed. Consequently, with the appropriate concentration, transport conditions were simulated for 6 hours in a second experiment to evaluate the sedative efficacy of limonene. The experimental groups were:
0) Pre-transport (not transported); i) Control (no treatment); ii) Ethanol (with ethanol) and iii) Limonene (30 µL/L, dissolved in ethanol). After transport, water acidification with respect to the initial conditions was observed in all transported groups as well as a decrease in oxygen that was not as pronounced in the group treated with limonene. At the metabolic level, the results showed a significant increase in cortisol and a decrease in lactate in the transported groups compared to the non-transported fish. Besides, glucose showed lower levels in the group with limonene, reaching values similar to those of non- transported fish. Regarding triglycerides, significant differences were observed between the Control and Limonene groups, being higher in Limonene. In conclusion, high levels of cortisol and glucose are associated with stressful situations due to a higher energy demand, while lower levels of lactate and higher levels of triglycerides and plasma proteins could indicate a reduction in aerobic metabolism. Therefore, limonene seems to provide a state of sedation by reducing the physiological response to stress during a transport process.
Índice
1. Introducción ... 7
1.1 Estado actual de la acuicultura ... 7
1.2 Biología de la dorada ... 8
1.3 Retos de la acuicultura ... 9
1.4 El estrés en la acuicultura... 9
1.5 Métodos para combatir el estrés durante el transporte de peces: aceites esenciales y sus efectos fisiológicos ... 10
1.5.1 Aceite esencial de Cymbopogon flexuosus ... 12
1.5.2 Limoneno ... 12
1.6 Objetivos ... 13
2. Material y métodos ... 13
2.1 Origen de los compuestos potencialmente sedantes ... 13
2.2 Experimentación con animales ... 14
2.2.1 Experimento I: Elección del compuesto y concentración óptima para la sedación….14 2.2.2 Experimento II: Simulación de transporte para determinar el potencial de sedación del aceite esencial limoneno ... 15
2.3 Técnicas analíticas ... 15
2.3.1 Bioquímica del plasma ... 15
2.3.2 Estimación del amonio y nitritos presentes en las muestras de agua de mar ... 16
2.3.3 Análisis de datos ... 16
3. Resultados ... 17
3.1 Experimento I: Elección del compuesto y la concentración óptima para la sedación ... 17
3.1.1 Etapas de la sedación ... 17
3.1.1 Elección del compuesto idóneo para la sedación ... 17
3.1.2 Elección de la concentración óptima de limoneno ... 17
3.2 Experimento II: Simulación de transporte para determinar el potencial de sedación del aceite esencial Limoneno ... 18
3.2.1 Parámetros fisiológicos ... 18
3.2.2 Parámetros del agua ... 20
4. Discusión ... 21
4.1 Experimento I ... 21
4.1.1 Elección de la dosis adecuada ... 21
4.2 Experimento II ... 22
4.2.1 Hematocrito ... 22
4.2.2 Bioquímica en plasma ... 22
4.2.3 Parámetros del agua ... 24
5. Conclusiones ... 24
6. Bibliografía... 25
Índice de Figuras: Figura 1. Evolución en millones de toneladas de la producción mundial en el sector acuícola y pesquero. ... 7
Figura 2. Área con presencia constatada de Sparus aurata. ... 8
Figura 3. Elementos neuroendocrinos que componen el sistema de estrés en peces teleósteos y efectos fisiológicos a lo largo del tiempo. ... 10
Figura 4. Efecto de los aceites esenciales (AE) sobre los cambios fisiológicos inducidos por el manejo, transporte y enfermedades de la acuicultura... 12
Figura 5. Fórmula semidesarrollada del Nerol, Geraniol y del Limoneno. ... 12
Figura 6. Movimientos operculares por minuto (MO/min) a distintas concentraciones del compuesto limoneno. Los experimentos control se llevaron a cabo sin tratamiento (C), con etanol (E) y diferentes concentraciones de limoneno (L10-L40). ... 18
Figura 7. Niveles de cortisol plasmático en individuos de Sparus aurata previos (PRE) y tras un simulacro de transporte de 6 horas. Los peces se transportaron sin tratamiento (C), con etanol (E) y con 30 µl/L de limoneno (L). ... 19
Figura 8. Niveles de glucosa (A), lactato (B) y triglicéridos (TAG) (C) en individuos de Sparus aurata previos (PRE) y tras un simulacro de transporte de 6 horas. Los peces se transportaron sin tratamiento (C), con etanol (E) y con 30 µl/L de limoneno (L). ... 20
Índice de Tablas: Tabla 1. Parámetros medidos directamente de las bolsas usadas para el transporte de individuos de Sparus aurata. Los peces se transportaron sin tratamiento (C), con etanol (E) y con 30 µl/L de limoneno (L). ... 21
1. Introducción
1.1 Estado actual de la acuicultura
La acuicultura es una actividad cada vez más trascendental mundialmente debido a su capacidad de producir alimentos de excelente calidad nutricional. Los alimentos de origen acuático son cada vez más reconocidos como una fuente de proteínas de gran calidad y micronutrientes como las vitaminas, los minerales y los ácidos grasos Omega-3 (EPA y DHA), los cuales son esenciales en la alimentación humana ya que contribuyen tanto en las distintas etapas del desarrollo como en el mantenimiento de una buena nutrición y salud en la etapa adulta. Dichas características, en un contexto en el que se abordan una crisis económica, pandémica, climática y alimentaria a nivel mundial, contribuyen a mejorar los sistemas agroalimentarios y garantizar unos precios asequibles en una dieta saludable para una población en crecimiento (FAO, 2022). Sin embargo, para el crecimiento y desarrollo sostenible de la acuicultura son necesarias políticas de gestión e innovación. En este sentido, la acuicultura tiene un papel importante en los Objetivos para el Desarrollo Sostenible (ODS) de la agenda 2030 de la ONU, relacionados con la mejora de la alimentación, la economía y el cuidado del medio ambiente.
Según datos de la FAO (Food and Agriculture Organization), la producción mundial de animales acuáticos, incluyendo pesca y acuicultura (Fig. 1), se estimó en 2020 en un total de 178 millones de toneladas, de las cuales el 49% pertenecían al sector acuícola (FAO, 2022). Dentro de la Unión Europea, se estima que en 2018 se produjeron 1,4 millones de toneladas procedentes de la acuicultura, siendo los principales productores España (21%), Francia (15%) e Italia (14%) (Guillen, 2019).
Figura 1. Evolución en millones de toneladas de la producción mundial en el sector acuícola y pesquero.
Fuente: FAO
Concretamente, la producción de acuicultura en España en 2020 fue de 307.168 toneladas (t), siendo las especies más cultivadas: mejillón (233.467 t), lubina (21.709 t), trucha arcoíris, (19.400 t) y dorada (6.588 t) (APROMAR, 2021). Para lograr alcanzar tales
niveles de manufactura, se siguen mejorando e investigando nuevas técnicas de cultivo que permitan optimizar la productividad, siendo una vía de investigación recurrente la reducción del estrés con el propósito de mejorar el bienestar animal, lo que repercutirá en un mayor rendimiento del sector, con productos de mejor calidad y de mayor sostenibilidad ambiental.
1.2 Biología de la dorada
La dorada (Sparus aurata, Linnaeus 1758) es un teleósteo que pertenece a la familia de los espáridos, con un cuerpo comprimido lateralmente y con una banda amarilla característica entre los ojos. Es común en todo el Mediterráneo (Fig. 2), siendo el pez más cultivado en este mar, aunque también se distribuye por las costas del Atlántico Oriental, desde Guinea y Senegal, hasta el mar Cantábrico y el sur del Reino Unido, estando también presente en las Islas Canarias (Ortega, 2011). Es una especie euriterma (5-32ºC de temperatura) y eurihalina (4-70‰ de salinidad) y se puede encontrar hasta los 90 metros de profundidad. Además es una especie carnívora que se alimenta de especies de fondo, especialmente de moluscos, crustáceos y pequeños peces (Reig, 2001).
Figura 2. Área con presencia constatada de Sparus aurata. Fuente: marinespecies.org
Tradicionalmente, las doradas se cultivaban extensivamente en estero hasta que se desarrollaron sistemas intensivos en la década de 1980. Esta especie es muy apropiada para la acuicultura extensiva en el Mediterráneo debido a su buen precio de mercado, su alta tasa de supervivencia y a que son un eslabón relativamente bajo en la cadena trófica (Colloca y Cerasi, 2009), por lo que es una especie que se adapta correctamente al sector acuícola y puede contribuir a satisfacer las necesidades socio-económicas.
1.3 Retos de la acuicultura
Existen diferentes causas que modifican las condiciones ambientales óptimas y consecuentemente causan estrés, como cambios en la temperatura y la salinidad (Deane y Woo, 2009), alta densidad de población (Long et al., 2019), hipoxia (Abdel-Tawwab et al., 2019) o el transporte de los animales (Falahatkar et al., 2012). En consecuencia, la producción de peces se encuentra íntimamente ligada a la calidad del agua y al manejo de los mismos (Conte, 2004). Por tanto, unas buenas prácticas acuícolas requieren ambientes monitoreados y controlados, además de protocolos de manejo correctos, para mejorar el bienestar animal y garantizar el éxito económico (Martos-Sitcha et al., 2020).
Definir e identificar indicadores fiables de bienestar de los peces es complicado, y con el propósito de poder evaluarlo de manera objetiva se analizan medidas físicas, fisiológicas y de comportamiento (Huntingford y Kadri, 2008).
1.4 El estrés en la acuicultura
El estrés en los peces es una respuesta que se genera frente a estímulos adversos que amenazan su homeostasis, para intentar volver a adaptarse al medio. Dichas respuestas pueden ser primarias (a nivel hormonal), secundarias (a nivel metabólico y hematológico) y terciarias (el individuo completo, e incluso a nivel poblacional) (Barton e Iwama, 1991).
El estrés en el sector de la acuicultura puede comprometer la salud y la supervivencia de los animales, por lo que comprender las bases fisiológicas y conductuales frente a éste es clave.
Ante una situación estresante, se desencadenan una serie de cambios en los sistemas inmune, nervioso y endocrino, interconectados entre ellos, para responder eficazmente frente a las modificaciones del medio (Barandica y Tort, 2008). Existen dos tipos de procesos de inducción al estrés: i) agudo, a corto plazo y con una intensidad alta, y ii) crónico, donde la intensidad es baja pero la exposición es prolongada (Tort, 2011). En situaciones de estrés agudo interviene el eje hipotálamo-simpático-cromafín (HSC) y las células cromafines. Estas células se ubican principalmente en el riñón anterior o cefálico, sintetizando catecolaminas (adrenalina y/o noradrenalina) que activan respuestas cardiovasculares, respiratorias y metabólicas con el propósito de disminuir los efectos adversos asociados a dicho estrés agudo (Perry, 2014). Por otra parte, el eje hipotálamo- hipofisario-interrenal (HHI), tiene mayor relación con el estrés crónico, aunque en situaciones de estrés agudo los niveles plasmáticos de cortisol se elevan rápidamente y vuelven a disminuir en cuestión de pocos minutos. Este eje segrega, en primer lugar, la hormona liberadora de corticotropina (CRH) para poder estimular la síntesis del precursor de la proopiomelanocortina (POMC) en las células corticotropas de la adenohipófisis, con el objetivo de secretar la hormona adrenocorticótropa (ACTH), activando esta última, a continuación, las células interrenales del riñón cefálico para liberar cortisol (Wendelaar Bonga, 1997). El cortisol modifica las funciones locomotoras, respiratorias, la renovación tisular y la regulación hidromineral con el objetivo de adaptarse al estrés (Fig. 3), por lo que la energía metabólica del animal se emplea en estas funciones en lugar de destinar energía al crecimiento y a la reproducción. Por este motivo, el rendimiento del pez se ve afectado y durante situaciones de estrés empeoran sus tasas de crecimiento, se inhiben los
procesos de reproducción y, además, su sistema inmunitario se ve comprometido (Wendelaar Bonga, 1997).
Figura 3.Elementos neuroendocrinos que componen el sistema de estrés en peces teleósteos y efectos fisiológicos a lo largo del tiempo. (Wendelaar Bonga, 1997; Tort, 2011). Las flechas hacia abajo (↓) indican disminución y las flechas hacia arriba (↑) indican aumento de los procesos indicados.
1.5 Métodos para combatir el estrés durante el transporte de peces: aceites esenciales y sus efectos fisiológicos
Los procesos de transporte entre instalaciones acuícolas activan las respuestas fisiológicas frente al estrés, lo que compromete la salud y bienestar de los peces si se supera su umbral de tolerancia (Jerez-Cepa et al., 2019). Para evitarlo, se emplean numerosos fármacos anestésicos, sedantes y analgésicos, inyectados o diluidos en el agua, cuyas propiedades reducen la excitación y la hiperactividad, facilitando su manejo y disminuyendo su mortalidad. Por último, se considera que la sedación es la condición ideal de transporte porque los peces siguen nadando, pero con movimientos menos vigorosos, lo que contribuye a reducir el metabolismo y las lesiones traumáticas (Netto et al., 2017).
Sin embargo, el tipo y la dosis de sedante depende de la especie y de las condiciones del medio, por lo que es necesario un enfoque paulatino para testar en especies desconocidas o en compuestos no probados para especies conocidas (Neiffer y Stampere, 2009).
Paralelamente, dichos compuestos pueden generar otras respuestas fisiológicas que al
Agudo Crónico
Tiempo Minutos Horas Días Semanas Meses
final también activen los mecanismos frente al estrés (Jerez-Cepa et al., 2019), o generar aversión entre los peces según el tipo de compuesto y/o la especie (Readman et al., 2013).
Para contrarrestar el estrés en el sector acuícola cada vez se investigan más los compuestos con un origen natural, y los aceites esenciales (AE) derivados de plantas han demostrado reducir las alteraciones bioquímicas y endocrinas ocasionadas, en los peces, por dichas situaciones estresantes (Fig. 4). Estos compuestos naturales presentan ventajas frente a los anestésicos o sedantes sintéticos, ya que no muestran efectos adversos en la fisiología de los peces ni en el medio ambiente (Aydin y Barbas, 2020). Sin embargo, deben establecerse el tipo de sedante, la dosis y la vía de administración específicamente según la especie, ya que pueden actuar como estresores por sí mismos si sus concentraciones y formulaciones químicas no son las adecuadas (Souza et al., 2019).
Por otro lado, otros estudios han demostrado las ventajas de usar nanoemulsiones de aceites esenciales como anestésicos para peces ya que mejoran sus efectos, lo cual está asociado con una menor volatilidad y a un incremento de la resistencia a la luz (Khumpirapang et al, 2017; Kheawfu et al, 2021; Rodrigues et al, 2021). Otra ventaja de usar una nanoemulsión es su solubilidad en agua, evitando así la necesidad de predisolverlo en etanol.
Los AE son mezclas complejas, líquidas y volátiles, generalmente destilables al arrastrarlos con vapor de agua, que contienen las sustancias responsables del aroma de las plantas, resultando en una mezcla de hasta más de cien componentes de distinta naturaleza: alcanos, alcoholes, aldehídos, cetonas, ésteres, ácidos, monoterpenos, sesquiterpenos y fenilpropanos (Martínez, 1996). Aun así, su eficacia para reducir el estrés depende de su composición química, concentración y quimiotipo, por lo que estudiar los compuestos activos presentes en estos AE permitiría un mejor control de sus efectos.
Figura 4. Efecto de los aceites esenciales (AE) sobre los cambios fisiológicos inducidos por el manejo, transporte y enfermedades de la acuicultura. El símbolo (+) indica activación y/o aumento y el símbolo (-) indica inhibición y/o reducción (Modificado de Souza et al., 2019).
1.5.1 Aceite esencial de Cymbopogon flexuosus
El género Cymbopogon contiene 85 especies distribuidas en las zonas tropicales y subtropicales, produciendo algunas de ellas aceites esenciales. Sin embargo, tanto la distinción de unas especies de otras como de sus aceites esenciales supone una gran dificultad. Mientras que algunas especies son morfológicamente indistinguibles y producen aceites esenciales que difieren en composición y propiedades, otras producen aceites esenciales de composición casi idéntica (como C. citratus y C. flexuosus) (Taskinen, 1983). Concretamente, el aceite esencial de C. flexuosus (AECF) contiene un 65% de citral (nerol y geraniol), 8% de hidrocarburos y trazas de metil eugenol (Taskinen, 1983). Además, se ha demostrado que este aceite esencial posee efectos sedantes a determinadas concentraciones en juveniles de tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus) (Netto et al., 2017) y en pez gato (Rhamdia quelen) (Dos Santos, 2017).
1.5.2 Limoneno
Figura 5. Fórmula semidesarrollada del Nerol, Geraniol y del Limoneno (Martínez, 1996).
Aceites Esenciales (AE) Manejo
Transporte Estrés Oxidativo
Enfermedades
Niveles de cortisol
Niveles de lactato
Niveles de glucosa
Genes crh y slc6a2
Actividad leucocitos
peroxidasa Lisozima
Niveles de glucosa y cortisol Actividad
SOD Niveles
TBARS LOOH Actividad
CAT
Actividad Gpx
Actividad GST
Niveles de lactato Ratio de ventilación
Actividad de natación Niveles de glucosa Niveles
de cortisol Genes crh, pomcb, prl
y sl Pérdida de iones
El limoneno (Fig. 5) es un monoterpeno y uno de los compuestos principales de los aceites esenciales de frutas cítricas (Giarratana et al., 2016), o de plantas como Lippia alba (Do Vale et al., 2002) o Aloysia triphylla (Parodi et al., 2020). Posee un carbono asimétrico, lo que deriva en dos isómeros ópticos: R-(+)-Limoneno, también denominado R-Limoneno, y R-(-)-Limoneno, también llamado S-Limoneno (Larsen et al., 2000). Este compuesto activo se ha testeado con éxito en el sector acuícola, tanto en sedación para transporte de distintas especies de peces (Do Vale et al., 2002; Parodi et al., 2020), como antibacteriano (Gomes da Silva et al., 2021; Pathirana et al., 2018) y como tratamiento para alargar la vida útil de la carne de pescado (Giarratana et al., 2016). Por lo expuesto anteriormente, este compuesto activo resulta un candidato ideal para investigar sus propiedades y su potencial incorporación al sector.
1.6 Objetivos
Desarrollar una acuicultura sostenible requiere de alcanzar las mejores condiciones posibles y del mantenimiento adecuado para maximizar el bienestar animal, ya que situaciones de estrés condicionan las tasas de crecimiento y la salud de los peces.
En consecuencia, el objetivo general del presente trabajo es testear el aceite esencial de C. flexuosus y el compuesto activo R-(+)-Limoneno, debido a su potencial como sedantes, durante el transporte de la dorada. Para ello, se han desarrollado una serie de objetivos específicos:
I. Evaluar los efectos de dos compuestos potencialmente sedantes en la dorada.
II. Elegir el compuesto y concentración óptima que proporcionen un efecto sedante para el transporte de dorada.
III. Evaluar los efectos del compuesto a la concentración óptima determinada a nivel fisiológico y metabólico en la dorada bajo una situación de estrés común en las prácticas acuícolas como es el transporte.
2. Material y métodos
2.1 Origen de los compuestos potencialmente sedantes
Se emplearon dos compuestos de distinta naturaleza: una nanoemulsión del aceite esencial de la planta Cymbopogon flexuosus y el principal compuesto aromático de los aceites esenciales obtenidos de cítricos como el limón, la naranja o el pomelo, el R-(+)- Limoneno. Ambas sustancias son de naturaleza hidrófoba, por lo que es necesario diluirlos en productos polares para facilitar su disolución en el agua. Con la finalidad de mejorar los efectos anestésicos, incluyendo una menor volatilidad y una mejora de su solubilidad en agua y resistencia a la luz, se utilizaron dos métodos: una nanoemulsión para el aceite esencial de Cymbopogon flexuosus y el etanol para el R-(+)-Limoneno.
Además, en ambos casos se determinó el efecto de solamente el dispersante en la disolución, por lo que en ambos casos también se utilizó sin los compuestos potencialmente sedantes.
Por lo tanto, para el aceite esencial de Cymbopogon flexuosus se incluyó mediante una nanoemulsión para facilitar su disolución en el agua de mar, y para el blanco o fase control, se utilizó la fase dispersante sin el aceite esencial en el agua.
Para el R-(+)-Limoneno, sin embargo, se empleó etanol de 96º para facilitar su disolución, en proporción 1:9, para los experimentos I y II. El R-(+)-Limoneno fue obtenido comercialmente de Sigma-Aldrich (Ref.183164) y proviene de aceites esenciales, poseyendo un 97% de pureza.
2.2 Experimentación con animales
Las doradas usadas se obtuvieron de un tanque de peces stock perteneciente a la Sala de Experimentación de los Servicios Centrales de Investigación en Cultivos Marinos (SCI- CM, Universidad de Cádiz; Código REGA ES11028000312), donde se llevaron a cabo todos los experimentos. Todos los procedimientos experimentales fueron llevados a cabo siguiendo las directrices dadas por la legislación vigente de la Unión Europea (2010/63/UE), española (ley 32/2007 y RD 53/2013) y de la Universidad de Cádiz, para el uso de animales de laboratorio. Además, el presente modelo experimental cuenta con la aprobación de la Junta de Andalucía para el uso y manipulación de animales de experimentación, con el número de autorización 3/11/2021/173. Los parámetros del agua fueron constantes durante los experimentos, con un 37 ‰ de salinidad, y una temperatura de 18,5ºC para el experimento I y 20ºC para el II. Paralelamente, las doradas empleadas en el experimento I tenían un peso medio de ~83 g y en el experimento II de ~100 g.
2.2.1 Experimento I: Elección del compuesto y la concentración óptima para la sedación.
Se cogieron 4 tanques de 10 litros de capacidad y de dividieron en 2 grupos: 2 de ellos se emplearon para el proceso de sedación, y 2 para el de recuperación. En los tanques de sedación las doradas se expusieron a diferentes concentraciones de los dos compuestos objetos de estudio. Por otro lado, los tanques de recuperación se usaron para que los peces sedados se pudieran recuperar y observar debidamente antes de devolverlos a un tanque madre. Los peces se pescaron del tanque de origen y se introdujeron de dos en dos en los tanques de sedación, provistos de aireadores para mantener una buena oxigenación del agua. En ese momento se activaba el cronómetro para tener controlado con exactitud el tiempo en el que entraban en las distintas fases de sedación/anestesia. Para categorizar las etapas de la anestesia, basándose y simplificando la categorización de Jerez-Cepa (2019), se clasificaron las siguientes etapas:
- Etapa I (sedación): disminución de la reactividad a los estímulos externos, movimiento reducido, ventilación disminuida.
- Etapa II (sedación profunda): pérdida total de equilibrio, natación errática.
- Etapa III (anestesia): pérdida total del equilibrio, cese de la locomoción. Fuerte analgesia, pérdida total de ventilación.
- Etapa IV (colapso de la médula espinal): paro respiratorio, paro cardíaco, muerte eventual, sobredosis.
Además, a los 6, 10 y 20 minutos de exposición al sedante se midió el número de movimientos operculares durante 15 segundos y se multiplicó dicha cifra por 4, para obtener el resultado por minuto. Tras finalizar este tiempo se pesaba el pez y se le trasladaba al tanque de recuperación.
En primer lugar, se testó la nanoemulsión de Cymbopogon flexuosus, con concentraciones de 20, 100 y 200 µL/L, siendo un total de 16 peces, 4 de cada tipo, incluyendo en los que se testó 200 µL/L de la nanoemulsión sin el aceite esencial.
Por otra parte, en el caso del limoneno, se probaron 4 concentraciones distintas: 10, 20, 30 y 40 µL/L y dos grupos control, uno sin estar sometido a ningún compuesto y otros solo a etanol (a la máxima concentración usada para disolver el limoneno). En total se usaron 48 peces (8 peces/tratamiento).
2.2.2 Experimento II: Simulación de transporte para determinar el potencial de sedación del aceite esencial limoneno
Para llevar a cabo una simulación de transporte en peces, se introdujeron doradas de aproximadamente 100 g de peso en bolsas plásticas para transporte con capacidad de 15 L y una densidad de aproximadamente 30 kg/m3. Se estabularon 3 peces en cada bolsa y se hicieron 4 réplicas para cada tratamiento (Control, Etanol y el sedante a la dosis elegida: Limoneno 30 µL/L), lo que hacía un total de 36 peces. Además de estos animales, se muestreó un grupo de 8 peces para obtener las mismas muestras biológicas, pero sin estar sometidos a ningún tipo de transporte, llamándose este grupo control “Pre- transporte”.
Los 36 peces que sí fueron sometidos al transporte se introdujeron de forma escalonada (cada 10 minutos) en las bolsas y se saturó el agua con oxígeno. A partir de ese momento se inició la simulación de transporte, que consistió en colocar las bolsas en un carro protegido de la luz directa y moverlo continuamente, durante 6 horas, simulando un transporte. Posteriormente, los peces se muestrearon de manera escalonada para extraer las muestras de sangre y tejidos: hígado, branquia, riñón cefálico, riñón caudal, hipófisis y cerebro. Finalmente, todas las muestras se almacenaron inmediatamente en nitrógeno líquido y posteriormente a -80ºC para su preservación. La sangre se centrifugó a 3000 g durante 4 minutos y del sobrenadante se obtuvieron muestras de plasma, almacenándose 2 alícuotas en tubos Eppendorf de 0,5 mL. Para medir el hematocrito, se centrifugaron capilares sanguíneos a 13000 g durante 5 minutos, midiendo posteriormente el porcentaje resultante de hematocrito. Por otra parte, se midieron los parámetros del agua directamente de la bolsa (pH, concentración de oxígeno y temperatura) y se almacenaron muestras de agua en tubos Falcon de 50 mL para medir posteriormente los niveles de amonio y nitritos.
2.3 Técnicas analíticas
2.3.1 Bioquímica del plasma
En el laboratorio se emplearon técnicas de análisis de metabolitos basadas en reacciones colorimétricas, dando lugar a un compuesto a partir del cual se determinaba su
concentración utilizando un lector de absorbancias y siguiendo las especificaciones de incubación y lectura recomendados por el fabricante.
Los kits para analizar los metabolitos de cada muestra de plasma eran de la marca SpinReact® y se adaptaron las mediciones a microplacas de 96 pocillos (estando las muestras por duplicado). Se analizó glucosa (Glucose-HK Ref. 1001200), lactato (Lactate Ref. 1001330), triglicéridos (TAG Ref. 1001311) y colesterol (Cholesterol-LQ Ref.
41021). Para el análisis de proteínas, en cambio, se utilizó el kit de análisis PIERCETM BCA Protein Assay Kit de THERMO (Ref.23225).
Además, el cortisol se midió mediante el kit comercial Cortisol Enzyme Immunoassay (Arbor Assays, K003-H1W), basado en una placa de 96 pocillos tapizados con un anticuerpo primario siguiendo las indicaciones del fabricante. Para la curva de estándares conocidos, se pipetearon por duplicado 50 μL de cada uno, de la misma manera que con las muestras de plasma. Paralelamente, se añadieron 25 μL del cortisol conjugado con 25 μL del anticuerpo secundario en los pocillos, aunque este último no se añadía en los blancos, sustituyéndose por 25 μL de buffer. Se selló la placa y se incubó 1 hora a 24ºC con agitación constante (200 rpm). Tras el periodo de incubación, se introdujo la placa en un lavador de microplacas (Automatic Micro-plate Washer PW-812, Huisong, Shangai, China) y, una vez seca, se añadieron 100 μL de tampón “TMB” en todos los pocillos y se volvieron a incubar 30 minutos a 24ºC sin agitación. Por último, se añadieron 50 μL de
“Stop Solution” y se procedió a la lectura de la absorbancia a 450 nm. Las absorbancias, tanto de los distintos metabolitos como del cortisol, fueron medidas mediante un espectrofotómetro PowerWaveTM 340.
2.3.2 Estimación del amonio y nitritos presentes en las muestras de agua de mar
Para medir la concentración de amonio y nitritos presentes en las muestras de agua de mar, se utilizaron los modelos de espectrofotómetro HI784 para amonio y HI764 de rango bajo para nitritos, ambos de la marca HANNA instruments®. El protocolo consistía en realizar un blanco con la propia muestra y posteriormente mezclar los reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante, dando lugar a una medida que debía transformarse en las unidades adecuadas. El método de medición para el espectrofotómetro del amonio se basa en una adaptación del método Salicilatos, que provoca una reacción de cambio de color medible por el aparato, mientras que el espectrofotómetro de nitritos de rango bajo adapta el método de Diazotización EPA 354.1, que causa una reacción entre los nitritos y el reactivo originando un tinte rosa en la muestra medible por el aparato.
2.3.3 Análisis de datos
Para el procesado y análisis de datos se usó el programa estadístico GraphPad Prism 8 (GraphPad Softwares, San Diego, EE. UU.). Para la elección de la concentración de sedante, además de los datos comportamentales descritos anteriormente, se realizó un ANOVA de dos vías para determinar si existían diferencias significativas entre el tiempo (6, 10 y 20 minutos), la concentración o la interacción entre ambas. Al apreciar que existían diferencias según la concentración de sedante independientemente del tiempo en
el que se registró la medida, se realizó un análisis ANOVA de una vía, que permitió elegir la concentración de 30 µL/L para el segundo experimento. A continuación, se realizó un test a posteriori (Test de Tukey) para comparar los distintos grupos.
En el caso del experimento II, se realizó un ANOVA de una vía en cada parámetro, tanto del plasma como del agua, para evaluar si existían diferencias significativas según el tipo de tratamiento, realizando un Test de Tukey para compararlos. Por último, los datos aportados en el presente trabajo están representados como la media de una variable ± error estándar de la media (EEM).
3. Resultados
3.1 Experimento I: Elección del compuesto y la concentración óptima para la sedación
3.1.1 Etapas de la sedación
Se consideró que la etapa idónea para el transporte de peces era la etapa I (sedación), por lo que la concentración en la que observase una disminución de la reactividad a los estímulos externos, reducción del movimiento y de la ventilación sería la escogida para usar en el experimento de simulación de transporte. La consideración de si los individuos habían entrado o no en la Etapa I lo marcaba el grupo Control, de forma de que, si el grupo Control no respondía a estímulos y los peces expuestos a los compuestos potencialmente sedantes tampoco reaccionaban a los mismosy, por tanto, no era un criterio para evaluar la sedación.
Considerando lo anteriormente expuesto, los peces sometidos a la nanoemulsión de C.
flexuosus superaban la etapa I, llegando a la etapa II (sedación profunda) en pocos minutos por lo que se descartó este compuesto como sedante para ser usado para el transporte. Por otra parte, en los peces expuestos a limoneno, no parecía haber diferencias visibles entre concentraciones más allá del número de movimientos operculares/minuto.
Por último, cabe destacar la existencia de agresividad en todas las parejas de individuos del grupo Etanol.
3.1.1 Elección del compuesto idóneo para la sedación
Durante la realización del experimento, los peces expuestos a la nanoemulsión del aceite esencial de Cymbopogon flexuosus que no alcanzaron la etapa II presentaban un comportamiento visiblemente estresado, mostrando sus escamas un patrón rayado, movimientos de natación rápidos y comportamiento agresivo entre individuos. Se aumentó la dosis de 20 µL/L a 100 µL/L y por último a 200 µL/L, lo cual empeoró los efectos sobre el pez, mostrándose muy estresados y con intención de escapar del tanque.
Por este motivo, se interrumpió la experimentación con este compuesto como parte del experimento y se continuó testando con distintas concentraciones del limoneno.
3.1.2 Elección de la concentración óptima de limoneno
En la Fig. 6 se presenta la cantidad de movimientos operculares por minuto según el tipo de tratamiento (Control, Etanol, Limoneno 10 µL/L, Limoneno 20 µL/L, Limoneno 30
µL/L, Limoneno 40 µL/L). Al realizar un ANOVA de dos vías para determinar si existían diferencias significativas según el tiempo,el tratamiento o la interacción entre ambas variables, se obtuvieron unos un p-valores de 0,298, <0,0001 y 0,098respectivamente, por lo que se comprobó que no hay diferencias significativas entre el tiempo, pero sí en el tipo de tratamiento.
Figura 6. Movimientos operculares por minuto (MO/min) a distintas concentraciones del compuesto limoneno. Los experimentos control se llevaron a cabo sin tratamiento (C), con etanol (E) y diferentes concentraciones de limoneno (L10-L40). Los valores aparecen representados como la media ± error estándar de la media (EEM) de 8 peces. Las letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas entre los grupos analizados con ANOVA de una vía, seguida de un test de Tukey (p<0,05).
A continuación, se realizó un ANOVA de una vía que mostró diferencias significativas entre tratamientos (p-valor<0,0001). Al comparar las medias (Fig. 6), se puede observar que el tratamiento que provoca un menor número de movimientos operculares/min es la concentración de limoneno 30 µL/L. En consecuencia, esta fue la dosis que se utilizó para el experimento II.
3.2 Experimento II: Simulación de transporte para determinar el potencial de sedación del aceite esencial Limoneno
3.2.1 Parámetros fisiológicos 3.2.1.1 Cortisol
Los ejemplares del grupo Pre-Transporte se diferenciaron significativamente del resto de grupos mostrando los niveles más bajos de esta hormona (16,92±12,70ng/mL) respecto a Control (161,1±35,19 ng/mL), Etanol (204,6±44,36 ng/mL) y Limoneno (127,3±18,05 ng/mL). Sin embargo, los valores de cortisol muestran una tendencia a disminuir en el grupo tratado con limoneno, además de observarse los niveles más altos de cortisol en el grupo tratado con etanol (Fig. 7).
C E L10 L20 L30 L40 50
100 150
Experimento I
MO/min
Tratamiento a
bc bc b
c b
Figura 7. Niveles de cortisol plasmático en individuos de Sparus aurata previos (PRE) y tras un simulacro de transporte de 6 horas. Los peces se transportaron sin tratamiento (C), con etanol (E) y con 30 µl/L de limoneno (L). Los valores aparecen representados como la media ± error estándar de la media (EEM) de 12 peces. Las letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas entre los grupos analizados con ANOVA de una vía, seguida de un test de Tukey (p<0,05).
3.2.1.1 Metabolitos plasmáticos
En los niveles de proteínas y colesterol no se observaron diferencias significativas entre los grupos testados en el experimento. Sin embargo, los niveles de glucosa del grupo Limoneno y Pre-transporte fueron similares y más bajos que en el grupo Etanol, con el que mostraron diferencias significativas. Por otra parte, los niveles de lactato del grupo Pre-Transporte fueron mayores, presentando diferencias significativamente al resto de grupos. Por último, respecto a los niveles de triglicéridos (TAG), se observaron diferencias significativas entre el grupo Pre-Transporte y Limoneno, y entre Control y Limoneno (Fig. 8). En términos generales, se apreció que los niveles medios de los parámetros del limoneno son los que más se acercan a los parámetros medidos en el grupo Pre-Transporte de los tres, excepto en el caso del cortisol y los niveles de triglicéridos que son más similares los del grupo Control con Pre-Transporte.
PRE C E L
0 50 100 150 200 250 300
Cortisol (ng/mL)
b a
a
a
PRE C E L
0 5 10 15 20
Glucosa (mM)
a a
ab b A
Tratamiento
Figura 8. Niveles de glucosa (A), lactato (B) y triglicéridos (TAG) (C) en individuos de Sparus aurata previos (PRE) y tras un simulacro de transporte de 6 horas. Los peces se transportaron sin tratamiento (C), con etanol (E) y con 30 µl/L de limoneno (L). Los valores aparecen representados como la media ± error estándar de la media (EEM) de 12 peces. Las letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas entre los grupos analizados con ANOVA de una vía, seguida de un test de Tukey (p<0,05).
3.2.1.2 Hematocrito
El porcentaje promedio de hematocrito del experimento fue de 33,13% en el grupo Pre- Transporte, 37,17% en el grupo Control, 37,56% en el grupo Etanol y 35,33% en el grupo Limoneno 30 µL/L, no encontrándose diferencias significativas entre tratamientos.
3.2.2. Parámetros del agua 3.2.2.1 pH
El pH del tanque madre del que se obtuvieron todos los peces era de 7,5. Al medir el pH directamente de las bolsas después del transporte, los resultados fueron de media 6,69 para el grupo Control, 6,74 para el Etanol y 6,73 para el de Limoneno 30 µL/L, no observándose diferencias significativas entre tratamientos (Tabla 1).
PRE C E L
0.0 0.5 1.0 1.5
Tratamiento
Lactato (mM)
a
b b
b B
PRE C E L
0 5 10 15
Tratamiento
TAG (mM)
a a
b ab C
3.2.2.2 Saturación de oxígeno
Aunque no fuera de manera significativa, el grupo con limoneno mostró un mayor % de saturación de oxígeno (84,2%) respecto al grupo control (50,7%) y etanol (60,8%) (Tabla 1).
3.2.2.3 Amonio y nitritos
El amonio y los nitritos se mantuvieron en todos los tratamientos en unos niveles por debajo de 0,003 y 0,3 ppm respectivamente (Tabla 1).
Tabla 1. Parámetros medidos directamente de las bolsas usadas para el transporte de individuos de Sparus aurata. Los peces se transportaron sin tratamiento (C), con etanol (E) y con 30 µl/L de limoneno (L). Los valores aparecen representados como el promedio ± error estándar de la media (EEM) (4 muestras de agua/tratamiento).
Tratamiento C E L p-valor1
O2 (mg/L) 3,70±0,56 4,42±1,23 6,27±0,45 0,099
O2 (%) 50,67±7,62 60,80±16,78 84,83±6,39 0,113
pH 6,69±0,03 6,74±0,02 6,73±0,03 0,596
Nitritos (NO2- ppm) 0,28±0,01 0,29±0,03 0,26±0,02 0,535 Amonio (NH3) 0,003±0,00 0,004±0,00 0,003±0,00 0,667
1Valores resultantes de un ANOVA de una vía
4. Discusión 4.1 Experimento I
4.1.1 Elección de la dosis adecuada
Medir el movimiento opercular de los peces se suele utilizar para evaluar la demanda metabólica del mismo, y esta aumenta durante situaciones estresantes (Artigas, 2005), por lo que un menor movimiento opercular puede asociarse a una menor sensibilidad al estrés.
La hipoventilación causada por un sedante puede causar efectos negativos como hipoxemia o bradicardia, aunque a pesar de ello, se considera que la sedación produce menor respuesta al estrés que la manipulación y el transporte sin usar ningún compuesto sedante o tranquilizante. Sin embargo, un exceso de sedante puede aumentar el movimiento opercular para expulsar el irritante químico de la cavidad branquial (Neiffer y Stamper, 2009). Esto se corrobora en los resultados obtenidos, donde un mayor movimiento opercular acompañado de un aumento de la actividad de los peces permitió descartar el aceite de C. flexuosus como sedante en el experimento I. Por el contrario, con el aumento de la concentración del compuesto limoneno, disminuyeron los movimientos operculares por minuto, obteniendo la respuesta contraria en la dosis más alta testada (40 µL/L). Por lo tanto, las doradas aceptaron el aumento de la concentración del sedante hasta llegar a un punto de sedación óptima de 30 µL/L. Sin embargo, al aumentar la dosis a 40 µL/L, la sobredosis causó un efecto estresante a los peces que, en consecuencia, aumentaron el número de movimientos operculares por minuto, sugiriendo que mayores concentraciones del compuesto pueden ser contraproducentes para su uso, al menos en la especie de estudio.
4.2 Experimento II 4.2.1 Hematocrito
En general, los parámetros hematológicos suelen ser más indicados para evaluar transportes de larga duración ya que son marcadores secundarios de la respuesta al estrés (Sampaio y Freire, 2016), lo que coincide con la falta de cambios observada en los niveles de hematocrito entre los distintos grupos. Además, los resultados del presente trabajo coinciden con el estudio en carpas descritos por Gause et al. (2012), donde los valores del hematocrito del grupo sedado fueron similares a los de la población de referencia, demostrando la ausencia en la necesidad de realizar una mayor hematopoyesis por parte de los animales durante periodos de transporte como los testados en el presente experimento (6 h).
4.2.2 Bioquímica en plasma
El grupo Pre-Transporte es el grupo con menores niveles de cortisol en plasma, debido a que no fueron expuestos a ninguna fuente de estrés como es el transporte o el manejo previo al transporte. Dentro de los grupos que si fueron expuestos al transporte, parece que el limoneno, aunque no de manera significativa, contribuye a reducir los niveles de cortisol en sangre y por lo tanto a frenar los mecanismos fisiológicos de respuesta al estrés. Sin embargo, sus efectos no logran reducir los niveles de cortisol a los niveles que presentan los peces no transportados. Esta tendencia a reducirse, a pesar de no ser significativa, concuerda con los resultados de Zeppenfeld et al. (2014) y de Teixeira et al.
(2017). Además, en vista del elevado valor del grupo tratado con etanol, este compuesto utilizado como vehículo para la administración del AE podría activar los mecanismos fisiológicos frente al estrés y que, debido a éste, el limoneno no consiga disminuir los niveles de cortisol de una manera más efectiva. A pesar de ello, el resultado puede considerarse altamente positivo, con la necesidad de estudiar nuevas fuentes de emulsión o disolución para su administración en el agua de transporte.
Por su parte, los niveles altos de glucosa en plasma se suelen asociar con respuestas al estrés, ya que la liberación de catecolaminas da lugar a un aumento de la frecuencia respiratoria y cardíaca, del transporte de oxígeno y de la movilización de los sustratos energéticos para abastecer el alto consumo de energía requerido en una situación estresante. Consecuentemente, esto provoca un aumento de la glucosa en sangre (Teixeira et al., 2017), lo cual se observó en el grupo Etanol, que presentó los niveles más elevados de este metabolito, concordando con los mayores niveles de cortisol observados, lo que podría indicar que este compuesto tiene efectos estresantes en los peces. Contrariamente, un menor nivel de glucosa en sangre puede asociarse a un estado más relajado del organismo. En este sentido, los niveles de glucosa del grupo Limoneno fueron similares al grupo Pre-Transporte, por lo que parece que el limoneno bloquea las respuestas metabólicas frente al estrés.
Respecto a las proteínas, existen estudios que observan que, como parte de su actividad catabólica, el cortisol ejerce una acción proteolítica, especialmente en el músculo blanco e hígado, aunque se basa en observaciones indirectas a partir del aumento de aminoácidos plasmáticos en presencia de cortisol y es bastante difícil de confirmar experimentalmente
(Mommsen et al., 1999). Por lo tanto, y a pesar de no existir diferencias significativas entre grupos, la menor concentración de proteínas en el grupo Etanol podría deberse al catabolismo proteínico con el objetivo de obtener los aminoácidos necesarios como sustratos en la gluconeogénesis. Por otra parte, el aumento del catabolismo de aminoácidos es frecuente en transportes de mayor duración y se suele asociar a un incremento de amonio, que no hemos visto en el experimento realizado, lo que concuerda con la falta de cambios en los niveles de proteína plasmáticos observados (Tang et al., 2009).
El colesterol, por otro lado, además de ser un lípido que puede ser utilizado como fuente de energía dentro de las rutas del metabolismo aerobio, es el precursor del cortisol, por lo que una mayor concentración en los grupos Control y Etanol podría deberse a una mayor demanda de éste para sintetizar esta hormona, aunque no existen diferencias significativas entre grupos.
Paralelamente, los cambios en los niveles de lactato plasmático son un indicador de los efectos respiratorios de los sedantes, ya que aumenta la concentración cuando no hay suficiente oxígeno para el metabolismo aerobio de las células, aunque existen estudios tanto a favor como en contra de la relación directa/inversa entre los niveles de lactato y los analgésicos/sedantes (Iversen et al., 2003). Por otra parte, el lactato es un indicador de metabolismo anaerobio, debido a que en situaciones de estrés la adrenalina induce la glucogenólisis en las células hepáticas, obteniendo glucosa a partir del glucógeno y como producto final lactato (Teixeira et al., 2017), con el objetivo de obtener un aporte energético extra en caso de ser necesario, siendo esta vía anaerobia menos eficiente energéticamente pero más rápida. La disminución del lactato en todos los grupos transportados respecto al grupo Pre-Transporte es parecida a lo observado en otros experimentos con peces en los que también se observó una disminución de los niveles de lactato plasmáticos durante el transporte (Sampaio y Freire, 2016). Esta disminución puede deberse a una disminución del metabolismo en general, debido a que el transporte es un estrés crónico. Al prolongarse la situación de estrés en el tiempo (estrés crónico), y tras superar el manejo del pez (estrés agudo), la demanda energética es más baja y la energía se obtiene en su mayoría por glucolisis aeróbica, disminuyendo los niveles de lactato al no requerir tanto la glucólisis anaerobia. Por lo tanto, estos resultados podrían sugerir que una situación de estrés crónico no induce cambios en la concentración de lactato (Barandica y Tort, 2008). Aun así, el lactato también puede ser reciclado en diferentes tejidos como el músculo o el hígado a través del Ciclo de Cori para poder formar ácido pirúvico y su entrada directa en el Ciclo de Krebs (Perera et al., 2020), lo que apoyaría la idea de que las menores concentraciones observadas en plasma pudieran ser una combinación de este mecanismo y de la disminución del metabolismo asociado durante el transporte.
Por último, los TAG son un bioindicador de respuesta secundaria frente al estrés del organismo, siendo un sustrato en la gluconeogénesis en el caso de que un organismo necesite más fuentes de energía (Refaey y Li, 2018). En el experimento, el grupo Limoneno presentó una menor concentración de TAG que los grupos Control y Pre-
transporte, diferencias que se podrían atribuir a una menor demanda energética del grupo Limoneno debido a un bloqueo de la respuesta fisiológica frente al estrés y, en consecuencia, que no sea necesario utilizar TAG en la síntesis de glucosa (Mommsen et al., 1999).
4.2.3 Parámetros del agua
Los desechos nitrogenados en el agua producidos por los peces pueden desequilibrar los procesos de nitrificación y desnitrificación bacterianas, lo que produce una acumulación de nitritos que pueden resultar tóxicos (Deane y Woo, 2009). A pesar de que no hubo diferencias significativas entre los tres tratamientos expuestos al transporte, el grupo Limoneno es el que presentó menor concentración respecto a los demás, siendo más positivo para los peces que exista menor concentración. Ello puede deberse, de nuevo, a un metabolismo más lento a causa del sedante.
Además, los niveles de amonio (<0,003 ppm), junto con los niveles de nitritos (<0,3 ppm), se mantuvieron por debajo de los niveles tóxicos. Esto se puede relacionar con la falta de cambios en los niveles de proteína plasmáticos, ya que un incremento de amonio se asocia a un aumento del catabolismo de aminoácidos, que es frecuente en transportes de mayor duración (Tang et al., 2009).
Por otro lado, tras la simulación del transporte, se observó una acidificación del agua en todos los grupos transportados (pH=6,7) respecto a las condiciones iniciales (pH=7,5).
Esto suele ocurrir en transportes cortos (<8 horas) como resultado de un aumento del consumo de oxígeno y una mayor liberación de CO2 (Tang et al., 2009). De hecho, se observó una disminución del oxígeno tras el transporte, y aunque no de manera significativa, el grupo tratado con limoneno mostró una mayor saturación de oxígeno (84,2%) respecto al grupo Control (50,7%) y Etanol (60,8%).
5. Conclusiones
A la vista de los resultados obtenidos en el presente trabajo es posible llegar a las siguientes conclusiones:
I. Es necesario comprender los procesos que activan y regulan la respuesta fisiológica frente al estrés, así como su desencadenamiento a través de factores ambientales y biológicos.
II. El aceite esencial de Cymbopogon flexuosus no resulta un candidato adecuado para la sedación de dorada, al menos en las dosis testadas en este trabajo. En el futuro se debería investigar sus propiedades y efectividad en otras especies.
III. El limoneno resulta ser un sedante efectivo en dorada a la concentración de 30 µL/L, disminuyendo significativamente los movimientos operculares/minuto.
IV. El limoneno parece ser eficaz para mitigar la respuesta al estrés de ejemplares de dorada sometidos a condiciones de transporte durante 6 horas. Además, es capaz de causar una reducción de las funciones metabólicas generales resultado de un estado de sedación proporcionado por este compuesto. Aun
así, sería necesario estudiar, además, otros compuestos para predisolver el compuesto activo, debido a que el etanol parece generar efectos adversos en los peces que el AE es capaz de revertir, al menos de forma parcial.
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