CITOMETRIA DE FLUJO Y LMA C.H.U.S.

(1)

CITOMETRIA DE

FLUJO

Y

LMA

Jos

José

é Á

Ángel D

ngel D

í

az Arias

C.H.U.S.

(2)

INTRODUCCI

Ó

_Ó

N

_N

–

¿

Qu

é

es la citometr

í

a de flujo (CMF)?

§

Es una tecnologí

Es una tecnolog

ía para caracterizaci

a para caracterizació

ón y el an

n y el an

á

lisis

de c

é

lulas que mide y analiza simult

á

neamente

m

ú

ltiples caracter

í

sticas f

í

sicas de part

í

culas que se

mueven en un fluido a traves de un haz de luz

§

Un cit

ó

metro tiene 3 partes fundamentales:

–

– FluFlu íí dica dica –

– ÓÓ ptica ptica –

(3)

INTRODUCCI

Ó

_Ó

N

_N

–

Puede analizar partí

Puede analizar part

í

culas de 0.2 a 50 micras

–

Nos indica el tamañ

Nos indica el tama

ño relativo, complejidad interna

o relativo, complejidad interna

(granularidad) e intensidad de fluorescencia

–

De forma general un nú

De forma general un n

úmero conocido de c

mero conocido de cé

é

lulas

(generalmente 2 x 10e6) se incuba con los

monoclonales elegidos tras lo cual se somete a un

proceso de lisado de hematies y posterior lavado

(4)

(5)

(6)

(7)

INTRODUCCI

Ó

_Ó

N

_N

§

¿

Para que sirve la CMF?

§

Se ha convertido en una herramienta indispensable

para el diagnostico, clasificaci

ó

n, estadiaje y

monitorizaci

ó

n de neoplasias hematol

ó

gicas

–

– Identifica cIdentifica c éé lulas de diferentes llulas de diferentes l íí neas, asneas, as í í como su como su maduraci

maduracióó n n –

– Detecta cDetecta c éé lulas lulas ““ anormalesanormales ” ” –

– Nos indica el fenotipo de las cNos indica el fenotipo de las c éé lulas lulas ““ anormalesanormales ”” , sobre lo , sobre lo que podemos emitir una diagnostico/sospecha diagnostica

que podemos emitir una diagnostico/sospecha diagnostica

–

(8)

¿

Existe una poblaci

_{Existe una poblaci}

ó

_ó

n

_n

“

_“

at

_at

í

_í

pica

_pica

”

_”

?

_?

§

Una vez recibida una muestra con sospecha de LA se

realiza un panel de screening para:

–

– Determinar si existen cDeterminar si existen c éé lulas lulas ““ atat íí picaspicas ” ” –

– Saber si estas cSaber si estas c éé lulas son inmaduras lulas son inmaduras –

(9)

MARCADORES A ESTUDIAR

§

EGIL:

§

Screening y posterior panel orientado

§

Marcadores en screening:

– CD34, CD33, CD13, CD10, CD19, CD45, CD7, CD14, MPOcito, CD3cito, CD3s, HLA DR

§

Posteriormente para serie mieloide,

monocitica,megacariocítica y eritroide:

– CD15, CD11b, CD16, CD10, CD33, CD13, CD56, CD64, CD65, CD117, CD19, Tdt, CD2, CD7, CD3, CD4, CD14, CD61, CD41a, CD42b, CD71, CD36, Glicoforina A, CD45 Woods. Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 72B:S14–S22 (2007) Sumeet Gujral Indian J Pathol Microbiol 2008 Ortuño J, Orafo A. Medicina Clinica 2002, 118(11)

(10)

(11)

(12)

LINFOCITOS + ERITROBLASTOS

MONOCITOS SERIE

(13)

(14)

(15)

(16)

¿

Como sabemos que es mieloide?

§

EGIL

EGIL, Catovsky et al EGIL, Catovsky et al

(17)

Definici

ó

_ó

n de l

_n de l

í

_í

nea

_nea

§

Se precisa una puntuaci

ó

n >2 en esa l

í

nea seg

ú

n

EGIL. Para definir una L.A. Bifenot

í

pica (BAL) se

precisan m

á

s de 2 puntos en 2 lineas diferente.

§

Esto es

ú

til para diferenciar las aberrancias de

l

(18)

Definici

ó

_ó

n de l

_n de l

í

_í

nea

_nea

§

En la nueva clasificaci

ó

n OMS las BAL se han

“

renombrado

”

y se ha hecho una definici

ó

n m

á

s

estricta:

–

– ““ Leucemias agudas de fenotipo mixtoLeucemias agudas de fenotipo mixto ” ” –

– Linea mieloide: MPO, o en diferenciaciLinea mieloide: MPO, o en diferenciaci óó n monocn monoc íí tica al menos dos tica al menos dos de los siguientes CD11c, CD14, CD64, lisozima, o bien esterasas

de los siguientes CD11c, CD14, CD64, lisozima, o bien esterasas

inespecificas (citolog

inespecificas (citologíí a)a) ‏ ‏

–

– LL íí nea linfoide T: CD3 citoplnea linfoide T: CD3 citopl áá smico o de superficie (msmico o de superficie (m áá s raro)s raro) ‏ ‏

–

– LL íí nea linfoide B: requiere de varios marcadores. nea linfoide B: requiere de varios marcadores.

§

§ Si CD19 es fuerte uno de los siguientes CD79a, CD22, CD10 Si CD19 es fuerte uno de los siguientes CD79a, CD22, CD10

§

(19)

MADURACIÓN

(20)

MADURACIÓN

(21)

(22)

(23)

(24)

CFM

FAB

_FAB

(25)

GENOTIPO

FENOTIPO

_FENOTIPO

(26)

GENOTIPO

(27)

(28)

M4/M5

(29)

EMR

§

§ La detecciLa detecci óó n de EMR por CMF presenta algunas dificultadas debido a n de EMR por CMF presenta algunas dificultadas debido a la heterogeneidad de los fenotipos leuc

la heterogeneidad de los fenotipos leucéé micos. micos. §

§ Para su detecciPara su detecci óó n se precisa la localizacin se precisa la localizaci óó n previa de LAP (fenotipos n previa de LAP (fenotipos asociados a leucemia) en los blastos al

asociados a leucemia) en los blastos al

diagn

ó

stico

. . §

§ Estos LAP sEstos LAP s óó lo se pueden detectar en un 50lo se pueden detectar en un 50 80% de las LAM 80% de las LAM y se basan y se basan en:

en:

–

– Asincronismos antigAsincronismos antig éé nicos nicos –

– Infidelidad de lInfidelidad de l íí nea nea –

– SobreexpresiSobreexpresi óó n de antn de ant í ígenos genos –

– Ausencia de antAusencia de ant íí genos especgenos espec íí ficos de lficos de l íí nea nea

–

– Alteraciones evidentes en FSC/SSC Alteraciones evidentes en FSC/SSC §

§ La sensibilidad alcanzable habitualmente es de 10eLa sensibilidad alcanzable habitualmente es de 10e 3 / 10e3 / 10e 4 y hasta 4 y hasta 10

(30)

EMR

§

§ Diversos estudios han mostrado que la detecciDiversos estudios han mostrado que la detecci óó n de EMR, asn de EMR, as í í como como su cuant

su cuantíí a se asocia a distintos riesgos de recaa se asocia a distintos riesgos de reca íí da da §

§ San Miguel et al Post inducciSan Miguel et al Post inducci óó n 0.5% (recaida 67% vs 20%), n 0.5% (recaida 67% vs 20%), Postintensificaci Postintensificacióó n 0.2% (69% vs 32%)n 0.2% (69% vs 32%) ‏ ‏ § § Venditti et al PostconsolidaciVenditti et al Postconsolidaci óó n 0.035% (77% vs 17%)n 0.035% (77% vs 17%) ‏ ‏ § § Al Mawali et al 0.15% postinducciAl Mawali et al 0.15% postinducci óó n n § § San Miguel et al 2001 4 categorias: San Miguel et al 2001 4 categorias: – – 1)Muy bajo riesgo recaida: <10 1)Muy bajo riesgo recaida: <10 4 4 –