1. INTRODUCCIÓN
La integridad de un epitelio corneal autorrenovable reside en la existencia de una subpoblación particular y única de célu-las madre del epitelio corneal localizadas en la región limbar (1,2). Característicamente, esta región limbar proporciona un medio óptimo —también llamado nicho— donde las células madre epiteliales limbares están físicamente protegidas de los peligros ambientales, mientras son aportados un flujo sanguí-neo apropiado, inervación y señalización celular para mantener su condición de células madre (fig. 1). Dentro de la región lim-bar, las células madre se localizan en la capa basal. Fenotípi-camente estas células madre corneales se caracterizan
princi-palmente por la falta de expresión del par de queratina K3/K12 (3,4) y la conexina 43 (5) (fig. 2). Cuando las células madre epiteliales limbares o su medio estromal de soporte —nicho— se vuelven disfuncionales o son destruidos, se manifiesta un estado patológico conocido como deficiencia de células madre límbicas (6,7) (ver capítulo 4). Clínicamente, el sello del défi-cit de células madre limbares es la conjuntivalización, es decir, la superficie corneal se cubre de un epitelio conjuntival que crece hacia el interior y que contiene células caliciformes (8). Este proceso de conjuntivalización está invariablemente aso-ciado a la destrucción de la membrana basal, la aparición de neovascularización superficial, inflamación crónica, cicatriza-ción y pobre integridad del epitelio corneal (6,9,10).
Conse-EXPANSIÓN EX VIVO DE CÉLULAS MADRES
LIMBARES
Edgar Mauricio España, Mario A Di Pascuale, Martin Grueterich, Scheffer C. G. Tseng
Figura 1: Las células madre del epitelio corneal residen en el nicho límbico. Como resultado, estas células madre epiteliales limbares están protegidas de la radiación ultravioleta mediante grandes can-tidades de pigmento (A). La microfotografía de contraste de fase muestra la superficie ondulada con un patrón en empalizada que protege las capas basales epiteliales y proporciona un área de super-ficie mucho mayor para albergar a las células madre (B). La región limbar está de forma característica ricamente vascularizada (C).
cuentemente, los pacientes con grave conjuntivalización expe-rimentan irritación importante, fotofobia y disminución de la visión y los trasplantes corneales convencionales no funcionan bien.
Una vez establecido el diagnóstico de déficit total de células madre límbicas, el trasplante de células madre epite-liales limbares es la solución final para mejorar los síntomas y la visión del paciente. En función de la afección uni o bila-teral, de la extensión de la insuficiencia límbica y de la acep-tación y expectativas por parte del paciente, se pueden consi-derar varios procedimientos para transplantar las células madre límbicas (tabla 1). Recientemente, varios estudios in vivo en humanos (11-14) y conejos (15,16) y varios in vitro
(15,17,18) han demostrado los beneficios de la expansión corneal ex vivo para la reconstrucción corneal en ojos con una insuficiencia límbica total. Esta última tecnología hace referencia a la expansión ex vivo de células madre limbares autólogas o heterólogas obtenidas mediante una biopsia de un pequeño segmento de limbo sano (11-14,19,20) (fig. 3).
2. INDICACIONES
Hasta ahora, el autoinjerto limbar, en el que se retiraban dos injertos lamelares que habitualmente abarcaban 2-3 horas e incluían conjuntiva, limbo y córnea periférica, ha sido consi-derado el procedimiento de elección para la defiencia unilate-ral total de células madre limbares. Desgraciadamente, nubé-cula corneal localizada (21), pseudopterigión (22,23),
Figura 2: Fenotipo de epitelio limbar único. El epitelio estratifica-do de la córnea descansa sobre una gruesa capa de Bowman (pun-tas de flecha negras), mientras que el epitelio estratificado limbar muestra una capa basal ondulada sobre un estroma poco denso (fle-chas negras) (A). La queratina K3 está ausente en la capa basal lim-bar (B) pero presente en la capa basal corneal (las líneas blancas discontinuas delimitan la membrana basal epitelial) (C). La conexi-na 43 define la membraconexi-na celular del epitelio corneal basal y suprabasal (izquierda) pero está ausente en la capa basal limbar (derecha) (D). El receptor de alta afinidad para NGF, el TrkA, es expresado en el epitelio basal y suprabasal del epitelio limbar y cor-neal (señal indicadora) (E). La integrina β1 es expresada en las capas basales del epitelio corneal en el limbo y córnea central (F).
Figura 3: Expansión ex vivo de epitelio limbar humano en mem-brana amniótica (AM). Se toma una pequeña biopsia limbar (1-2 mm) de un ojo sano donante. La biopsia se cultiva en membrana amniótica durante 3 a 4 semanas. El injerto semitransparente com-puesto de epitelio limbar expandido (HLE) y membrana amniótica es transplantado al ojo receptor donde se vuelve gradualmente más transparente con el tiempo. Área roja: limbo.
Procedimiento Abreviatura Donante
Trasplante de membrana amniótica TMA Placenta humana
Autoinjerto limbar AUTL Limbo contralateral
Aloinjerto limbar de familiar vivo ALOTL-fam Limbo de familiar vivo
Aloinjerto queratolímbico ALOTL Anillo corneo-escleral de cadáver
Expansión ex vivo (autóloga) ExVivo Limbo contralateral Tabla 1. Procedimientos quirúrgicos usados para la reposición de células madre limbares en el manejo de
queratitis filamentosa (24), depresión corneal y microperfora-ciones (25) son algunas de las potenciales complicamicroperfora-ciones refe-ridas en este procedimiento. Para superar estas complicacio-nes, la expansión autóloga ex vivo está indicada en pacientes con probado diagnóstico de déficit unilateral total de células madre límbicas en los que la retirada de un gran autoinjerto lamelar del ojo sano puede comprometer la homeostasis del epitelio corneal. En aras de aumentar el éxito del resultado de esta técnica quirúrgica, se formulan las siguientes estrategias:
2.1. La primera estrategia es restablecer las defensas de la superficie ocular
Han sido identificados varios factores de riesgo que pue-den empeorar el resultado de cualquier procedimiento reconstrutivo de la superficie ocular. Son la sequedad grave, las anomalías del párpado y borde palpebral no corregidas, la queratinización y la inflamación crónica. Dado que estos fac-tores reflejan deficiencias en los mecanismos necesarios para mantener una superficie ocular sana y en buen estado, sin una corrección previa de las mismas se presentan como factores de riesgo que amenazan el buen estado de las células limba-res transplantadas. Por consiguiente, es un requisito previo el restablecer una defensa de la superficie ocular en buen esta-do previamente a realizar la reposición ex vivo (fig. 4).
La identificación de dichos indeseables factores de ries-go mediante un examen externo y biomicroscópico y mediante el uso de tests de la función lagrimal, tinción y citología de impresión son pasos cruciales previos al plante-amiento de cualquier trasplante. Algunas medidas que pue-den tomarse para corregir una queratitis sicca grave incluyen la oclusión del punto lagrimal y la aplicación frecuente de gotas de suero autólogo. Las anomalías del margen palpebral y las pestañas como triquiasis, entropión o metaplasia de los orificios de las glándulas de Meibomio han de ser corregidas
mediante la cirugía plástica apropiada y las lentes de con-tacto esclerales. El simbléfaron, si causa deficiencias en la protección de la superficie ocular, puede ser corregido antes o en el momento de la reconstrucción ex vivo mediante un injerto de membrana mucosa o amniótica. Los problemas de exposición también pueden corregirse mediante una ptosis inducida con Botox o una tarsorrafia. Si no se restablece una protección de la superficie ocular en buen estado, estas defi-ciencias representan contraindicaciones mayores para la reconstrucción ex vivo.
2.2. La segunda estrategia es restablecer un medio estromal limbar
Un entorno estromal limbar sano es esencial para mantener y promover una función de las células madre limbares
adecua-Figura 4: Representación esquemática de diferentes medidas que deben ser tomadas en consideración previamente a la reconstruc-ción quirúrgica.
Estructura de la membrana amniótica EPITELIO AMNIÓTICO
Proporciona citoquinas (principales: EGF,KGF, HGF, bFGF, NGF; menores: TGF-α, TGF-β1, TGF-β2). Inhibidores tisulares de metaloproteinasas. Trombospondina-1.
MEMBRANA BASAL AMNIÓTICA
Colágeno IV (cadena a) y VII. Laminina 1 y 5.
Fibronectina.
ESTROMA AMNIÓTICO
Citoquinas (principales: NGF, HGF, KGF; menores: TGF-α, TGF-β1+2, EGF, bFGF).
Inhibidores tisulares de metaloproteinasas. Trombospondina-1.
Mecanismo potencial de acción para la expansión ex vivo de células madre limbares
Previene el contacto temprano con los componentes de la membrana celular epitelial
Proporciona citoquinas que afectan al ciclo y la supervivencia celulares.
Facilita migración y adhesión de la célula a la membrana celular epitelial.
Desencadena las vías de diferenciación a través de las integrinas.
Proporciona un microambiente no inflamatorio. Proporciona citoquinas de vías de diferenciación principales que están involucradas en la comunicación entre estroma y epitelio limbar.
Tabla 2. Características de la membrana amniótica que imitan el nicho de las células madre y promueven la expansión de células madre limbares
da, basándose en la premisa de que las células madre residen en un nicho especializado que mantiene su pluripotencialidad y dicta su plasticidad (7,26). El nuevo concepto en desarrollo de la biología de las células madre enfatiza el papel del nicho estromal circundante y, por tanto, el restablecimiento del entor-no estromal limbar es una estrategia adyuvante primordial. Con una adecuada obtención y preservación, la membrana amnióti-ca puede utilizarse como un sustrato biológico ideal para con-seguir este propósito al proporcionar una membrana basal grue-sa y un estroma avascular, que suprime la inflamación, la cicatrización y la vascularización al mismo tiempo que mantie-ne los fenotipos de epitelio limbar y queratocito (7,27). Varios estudios han demostrado las múltiples ventajas de la membrana amniótica para restablecer un nicho adecuado para la expansión
epitelial limbar (tabla 2). Además, datos recientes del laborato-rio de Kinoshita también demuestran que la membrana amnió-tica puede suprimir las respuestas linfocíamnió-ticas mixtas en la pro-ducción de citoquinas de Th1 y Th2, un índice que reafirma su papel inhibidor de las respuestas inmunes (28). In vitro, las células epiteliales expandidas en una membrana amniótica intacta mantienen un fenotipo que asemeja el de las células madre epiteliales limbares in vivo (17,18,29). Las células madre expandidas en una membrana amniótica son pequeñas y com-pactas y no expresan la queratina K3 ni la conexina 43 en las capas de células basales. Además, las células epiteliales expan-didas descansan en una membrana basal gruesa necesaria para una apropiada supervivencia y diferenciación celular (fig. 5). Clínicamente, el beneficio de usar membrana amniótica para la
Figura 5: Expansión ex vivo de epitelio limbar humano obtenido de una biopsia limbar. Crecimiento a partir de una biopsia límbica tras tres semanas de cultivo (A). La microscopía de contraste de fase de las células limbares expandidas creciendo sobre la membrana amniótica reve-la un tamaño celureve-lar pequeño y uniforme (B). La membrana amniótica mantiene reve-la transparencia una vez reve-las célureve-las se han expandido hasta alcanzar la confluencia (C). Una sección transversal de las células epiteliales limbares expandidas en membrana amniótica muestra células (1) creciendo sobre epitelio amniótico desvitalizado (2) y una membrana basal amniótica gruesa (3) (D). Las células expandidas sobre mem-brana amniótica demuestran positividad a la tinción para queratinas K3 en las capas superficiales, con expresión negativa en las capas basa-les (E). Se demuestra una membrana basal gruesa mediante la tinción para colágeno IV (delimitada mediante estrellas blancas) (F).
expansión ex vivo al proporcionar una reconstrucción del nicho está apoyada por nuestro reciente estudio de un caso que mues-tra que el fenotipo epitelial resultante es limbar, como eviden-cia la auseneviden-cia de expresión basal de queratina K3 y conexina 43, que el sustrato de membrana amniótica que contiene mem-brana basal es preservado y que las células epiteliales basales expresan integrinas α3β1 y α6β4 para formar hemidesmoso-mas con laminina 5 (14) (fig. 6).
3. TÉCNICAS DE EXPANSIÓN EX VIVO
Se han descrito diferentes técnicas de expansión ex vivo (15,19,20,30-32). Aunque la expansión ex vivo se practica en varios centros en todo el mundo, no ha sido establecida
hasta ahora una técnica estandarizada. Aunque estas técnicas se basan en el mismo principio, difieren significativamente en lo que respecta a las condiciones de cultivo siguientes:
3.1. El uso de explante limbar que contiene epitelio y estroma o de células epiteliales solas
Cuando se usan explantes limbares para expansión, la pluripotencialidad del epitelio limbar puede mantenerse gracias a su microambiente normal, mientras que la pluri-potencialidad del crecimiento epitelial tendrá que ser man-tenida bien mediante una membrana amniótica intacta (11,18,32) o bien mediante capas nutrientes fibroblásticas 3T3 (20). Por otra parte, las células epiteliales limbares
Figura 6: Fenotipo tras trasplante de epitelio limbar expandido ex vivo sobre membrana amniótica. Un paciente varón con una deficien-cia limbar total secundaria a una quemadura química se presentó con agudeza visual disminuida, nubécula corneal y fotofobia. Dos meses tras el trasplante de epitelio limbar expandido ex vivo para la deficiencia limbar total, el epitelio estaba intacto y liso (A). Veintiún meses tras la queratoplastia penetrante que fue llevada a cabo 5,5 meses tras el procedimiento previo (B). La muestra corneal evidencia un epi-telio estratificado con una capa basal negativa para queratina K3 (fluorescencia verde) (C). La tinción para conexina 43 (fluorescencia verde) es también negativa en la capa basal (D). El color rojo muestra la tinción nuclear con yoduro de propidio. C y D asemejan un feno-tipo límbico para ambos marcadores.
pueden ser aisladas del limbo como una suspensión de célu-las sueltas y sembradas directamente en una membrana amniótica denudada, mantenidas mediante un cocultivo de capas nutrientes fibroblásticas 3T3 (31). Una variante con-siste en expandir las células madre epiteliales límbicas pri-mero mediante capas nutrientes fibroblásticas 3T3 antes de cultivar para el trasplante sin el uso de membrana amnióti-ca (19,30). Cuando se usan explantes limbares, permanece sin aclarar si las células madre epiteliales migran realmente de los explantes limbares. Si esto no ocurre, entonces es crucial mantener el estatus progenitor de las células que migran. A este respecto, la membrana amniótica intacta se ha revelado superior a la denudada (18). También se desco-noce si las células madre epiteliales limbares expandidas con 3T3 preservan realmente la deseada pluripotencialidad tras ser recultivadas en membrana amniótica. Koizumi et al (31) han sugerido que la suspensión de células epiteliales limbares es más adecuada para la expansión ex vivo. Advir-tieron que las suspensiones de células enzimáticamente disociadas producen una capa de células epiteliales sanas con más uniones tipo desmosoma con expresión del par de queratina específica corneal (K3/K12).
3.2. El uso de una capa nutriente fibroblástica 3T3 Esta maniobra está basada en el trabajo de Rheinwald y Green (33) para expandir células madre de queratinocitos de la piel. Para la expansión ex vivo de células progenitoras de epitelio limbar, este método ha sido modificado por otros (31) mediante el cultivo de células epiteliales limbares en
mem-brana amniótica denudada en un sistema de cocultivo con capas nutrientes fibroblásticas 3T3 (fig. 7A). Aparte del pro-blema de exponer células epiteliales limbares humanas expan-didas a células murinas, permanece sin aclarar si realmente la pluripotencialidad se mantiene en este sistema sin un contac-to direccontac-to con capas nutrientes fibroblásticas 3T3 (34).
3.3. Diferencias en el sustrato usado para la expansión epitelial
Las células progenitoras limbares expandidas ex vivo eran inicialmente colocadas en una gasa (19) y posterior-mente en un gel fibrinoso (30) para facilitar la comodidad al transferir las capas epiteliales expandidas a la superficie ocu-lar (fig. 7B). Tras ser colocadas en el ojo receptor, la capa de fibrina es degradada en unas semanas y las células transplan-tadas forman un nuevo complejo basal sobre el tejido recep-tor. Sin embargo, otros han usado membrana amniótica como sustrato. Nuestro laboratorio ha notificado que la membrana amniótica intacta con epitelio amniótico desvitalizado ayuda a mantener el fenotipo epitelial limbar, mientras que la mem-brana amniótica denudada promueve el fenotipo epitelial cor-neal (18). En pocas palabras, las células epiteliales limbares expandidas en la membrana amniótica intacta no expresan queratina K3 ni conexina 43 en la capa de células basales (fig. 7C). En contraste, las células epiteliales limbares expan-didas en la membrana amniótica denudada (es decir, el epite-lio amniótico es retirado mediante EDTA y medios mecáni-cos) expresan queratina K3 y conexina 43 en la capa basal. Estos hallazgos indican que la membrana amniótica no es uti-lizada simplemente como un sustrato que contiene membra-na basal, sino que sirve para mantener la pluripotencialidad proveyendo de un nicho estromal único (7).
4. RESUMEN DE LOS ESTUDIOS CLÍNICOS SOBRE LA EXPANSIÓN EX VIVO DE CÉLULAS EPITELIALES LIMBARES
El propósito final de la reconstrucción de la superficie ocu-lar es aliviar los síntomas de fotofobia, mejorar la agudeza visual y restablecer una superficie corneal normal sin vascula-rización. Esta meta ha sido alcanzada mediante células madre epiteliales limbares expandidas ex vivo en membrana amnióti-ca en varios informes clínicos de pacientes que sufrían una deficiencia uni o bilateral total de células madre limbares (tabla 3). Un ensayo clínico ha sido recientemente aprovado para la FDA en Estados Unidos y será iniciado por el Dr. Tseng en el Centro de Superficie Ocular para determinar la seguridad y eficacia de este nuevo procedimiento quirúrgico.
5. EL USO DE MUCOSA ORAL PARA LA EXPANSIÓN EX VIVO
La expansión de células madre limbares autólogas no puede utilizarse para la reconstrucción corneal en pacientes
Figura 7: Diferentes técnicas de expansión ex vivo de epitelio limbar. Las células son cultivadas en membrana amniótica denudada bajo la influencia de medio acondicionado 3T3 (A). Las células epiteliales limbares son cultivadas sobre una capa de fibrina adecuada para el trasplante (B). Las células son cultivadas en membrana amniótica intacta con células madre epiteliales limbares creciendo sobre el epi-telio amniótico muerto aún adherido a la membrana amniótica (C).
con déficit bilateral de células madre limbares causado por enfermedades como el síndrome de Stevens-Johnson, el penfi-goide ocular cicatricial y las quemaduras químicas graves. La expansión de células madre limbares alogénicas deberá ser considerada (12,13). No obstante, en este último caso, deberá instaurarse inmunosupresión sistémica que puede acarrear una toxicidad significativa. Para superar esta dificultad, la expan-sión ex vivo de epitelio de mucosa oral autólogo se ha pro-puesto como alternativa prometedora (35). En este nuevo abor-daje, el epitelio de mucosa oral es expandido en membrana amniótica de la misma manera que el epitelio limbar y se ha mostrado efectivo en restablecer las superficies corneales dañadas en estas difíciles enfermedades de la superficie ocular.
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Literatura citada Tsai et al. 11 Schwab et al. 20 Koizumi et al. 12 Koizumi et al. 13 Grueterich et al. 14 Shimazaki et al. 36
Número de ojos 6 14 3 13 1 13
Indicación
- LSCD total: 2 3 11 1
7 (no especificado) 13
- LSCD parcial: 4
- Otros: 0 Rec. pterigión (3) Pseudopterigión (3) Rec. NIE (1)
Sistema de cultivo Cultivo de explante Autólogo (10) y Cultivo de explante Cultivo de explente Cultivo de explante Cultivo de explante autólogo, MA intacta, alogénico (4), alogénico, MA alogénico, MA autólogo, MA alogénico (donante no 3T3, no transporte células limbares denudada, 3T3 en denudada, 3T3 en intacta, no 3T3, no familiar vivo n=5 ' en aire. sueltas expandidas plástico, transporte plástico, transporte transporte en aire. no familiar n=7)
directamente en 3T3 en aire. en aire. MA denudada, no
y luego sembradas 3T3, no transporte
en MA denudada, en aire.
transporte en aire.
Seguimiento Media: 15 (12-18) Mediana: 11 (6-19) 6 Media: 11,2±1,3 21 Resultados clínicos
(meses) a corto plazo
(no especificado)
Resultados: Auto Alo
— Superficie estable 100% 71% 71% 100% 77% Sí 46%
— AV 83%↑ 100%↑ 100%↑ 100%↑ ↑ 77%
— Conjuntivalización No 29% 29% No 23% No 38% (+8% dérmico
+8% defecto epit.) Inmunosupresión No CSA sistémica y Esteroides Esteroides No 100% CSA sist.
local (4 casos sistémicos, CSA, sistémicos, CSA, 38% CSA tópico alogénicos) Ciclofosfamida Ciclofosfamida adicional Histología
— Pre-op: Sí (HE y ME) Sí (HE) Sí (HE e IH para Sí (HE e IH para No Sí (HE y ME) K3+K12) K3+K12)
— Post-op: No No No No Sí (HE e IH para No
K3, Cx43, Ln-5, integrinas -α3b1, -α6β4)No
Tabla 3. Resumen de los estudios clínicos sobre uso de la expansión ex vivo de células madre limbares en membrana amniótica
LSCD: deficiencia en células madre limbares; MA: membrana amniótica; CSA: ciclosporina A; HE: hematoxilina; IH: inmunohistoquimia; K: keratina; Ln: laminina; ME: microscopía electrónica; NIE: neoplasia intraepitelial córneo-conjuntival.
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