INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
TESIS Presentada para obtener el grado de
MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOPROCESOS por
Luis Martín Morín Sánchez Ingeniero Bioquímico
ESTUDIO IN SILICO DE LA ESTRUCTURA-ACTIVIDAD INHIBITORIA DE COMPUESTOS DERIVADOS DE CUMARINAS 3,6-SUBSTITUÍDAS SOBRE TROMBINA,
MONOAMINO-OXIDASA B E INTEGRASA DEL VIH-1.
Dirigida por
Dra. Itzia Irene Padilla Martínez
Resumen
Se llevó a cabo un estudio utilizando exclusivamente experimentación in silico para formular las relaciones cuantitativas estructura-actividad (QSAR) de cumarinas 3,6-disustituidas actuando como inhibidores de las enzimas trombina, monoaminooxidasa-B (MAO-B) e integrasa del VIH-1. Se utilizaron diferentes sustituyentes con efectos hidrofóbicos, electrónicos y estéricos para determinar la influencia de éstos sobre la actividad inhibitoria de las cumarinas 3,6-disustituidas en las enzimas mencionadas. Se realizaron ensayos de docking con las tres enzimas seleccionadas utilizando como ligantes la combinación de diez cumarinas 3-sustituidas con catorce grupos funcionales sustituyentes en la posición 6, lo que da un total de ciento cuarenta compuestos diferentes y que corresponde al número total de experimentaciones por docking. Se practicó un análisis de Hansch, para obtener los modelos que relacionen los descriptores hidrofóbicos, electrónicos y estéricos de cada grupo de compuestos estudiados. Las regresiones univariadas de cada efecto con respecto a la constante de inhibición para cada enzima no generan coeficientes de correlación satisfactorios, lo que sugiere la existencia de una interdependencia entre los tres factores estudiados. Utilizando una regresión no lineal multivariada sobre los tres descriptores empleados, se encontró una dependencia cuadrática para cada uno de éstos efectos con respecto a la constante de inhibición, que resulta satisfactoria en casos particulares para cada enzima. Se observó una mayor afinidad de las cumarinas 3,6-disustituidas sobre MAO-B. El análisis de los modos de unión de los inhibidores sobre las diferentes enzimas estudiadas sugiere que la estabilidad de los complejos enzima-ligante es favorecida principalmente por interacciones hidrofóbicas que por puentes de hidrógeno. La unión de las enzimas con los inhibidores estudiados se da por puentes de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas con los residuos de aminoácidos característicos del centro activo de las enzimas, especialmente con aquellos que participan en los mecanismos de catálisis sugeridos por otros investigadores.
Abstract
A study was carried out using exclusively in silico experimentation to formulate the quantitative structure-activity relationships (QSAR) of 3,6-disubstituted coumarins acting as inhibitors of thrombin, monoaminooxidase-B (MAO-B) and HIV-1 integrase enzymes. A wide range of substituents with hydrophobic, electronic and steric effects were used to determine the influence of these effects on the inhibiting activity of 3,6-disubstituted coumarins on the above mentioned enzymes. Docking essays were carried out with the three selected enzymes using as ligands the combination of ten 3-substituted coumarins with fourteen functional substituent groups on position 6, which gives a total of one hundred and forty different compounds, equal to the total number of docking experimentations. A Hansch analysis was carried out in order to obtain the models which relate the hydrophobic, electronic and streric descriptors of each compounds group under study. The univariated regressions of each effect against the inhibition constant for each enzyme does not generate satisfactory correlation coefficients, which suggests the existence of an interdependence between the three studied factors. A quadratic dependency was found for each of these effects against the inhibition constant which was satisfactory on particular ligands for each enzyme, according to the obtained models using a multivariate non-linear regression. The biggest affinity shown on MAO-B was with the 3,6-disubstituted coumarins. The analysis of the inhibitors union modes over the different enzymes under study suggests that the stability of the enzyme-ligand complexes is mainly conducted by hydrophobic interactions instead of hydrogen bonds. The enzyme-ligand bonds here studied, are given by hydrogen bonds and hydrophobic interactions with the characteristic amino-acidic residuals of the active sites of the enzymes, especially with those which participate on catalytic mechanisms suggested by other investigators.
Agradecimientos
A mis padres:
Dr. Luis Morín Cárdenas
Profra. Irma Concepción Sánchez González ϯ
por su cariño, por estar a mi lado en todo momento y por creer y confiar en mí y en mi trayectoria profesional
A mis hermanos Ángel, Andrés y Azucena por su cariño fraternal. A mi padrino:
Ing. Rubén Humberto Sánchez González ϯ
por su motivación y de quien guardo un especial recuerdo. A mis familiares que siempre me han animado a superarme.
A mi asesora la Dra. Itzia Irene Padilla Martínez, por su gran labor orientadora en el transcurso de mi formación para la obtención de este grado y por su amistad.
A mis compañeros y amigos que me motivaron y apoyaron con sus consejos y su amistad: Amici in gaudium, fratres in tenebrae.
A mi Comité Evaluador:
Dr. Claudio Garibay Orijel
Dra. Maria Guadalupe Ramírez Sotelo Dr. Efrén Venancio García Báez Dr. José Guadalupe Trujillo Ferrara
A la Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología.
A la Secretaría de Posgrado e Investigación del Instituto Politécnico Nacional. Al Instituto Politécnico Nacional.
El presente trabajo se realizó en el laboratorio de Investigación del Departamento de Ciencias Básicas de la Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología, bajo la dirección de la Dra. Itzia Irene Padilla Martínez.
Resultados parciales del presente trabajo fueron publicados en:
Santos-Contreras R, Martínez-Martínez F, Mancilla-Margalli N, Peraza-Campos A, Morín-Sánchez L, Padilla-Martínez I, García-Báez E., A competition between OH•••O hydrogen bonding and multicentered halogen-dipole interactions on intramolecular three centered hydrogen bonding disruption in 2H-1-benzopyran-3-acyl derivatives., CrystEngComm., 2009, 11, 1451-1461
y fueron presentados en las siguientes reuniones de investigación científica
1.- Luis M. Morín Sánchez, Itzia I. Padilla Martínez. Efrén V. García Báez. Taller ―Jóvenes en la Investigación Química‖ del19 al 21 de noviembre de 2008 en México Distrito Federal.
2.- Luis M. Morín Sánchez, Itzia I. Padilla Martínez. 6ª Reunión de la Academia Mexicana de Química Orgánica 2010 del 26 al 30 de abril de 2010 en Toluca Edo. de México.
3.- Luis M. Morín Sánchez, Itzia I. Padilla Martínez. IV Coloquio de Ingeniería Farmacéutica del 12 al 14 de mayo de 2010 en México Distrito Federal.
Contenido
Resumen ... iv
Abstract ... v
Agradecimientos... vi
Índice de Figuras ... xi
Índice de Tablas ... xiv
Índice de Esquemas ... xv
1. Introducción ... 1
1.1. Antecedentes ... 1
1.1.1. Cumarinas ... 1
1.1.2. Enzimas blanco ... 4
1.1.2.1. Actividad biológica de las cumarinas sobre trombina. ... 4
1.1.2.2. Actividad biológica de las cumarinas sobre integrasa del VIH-1. ... 6
1.1.2.3. Actividad biológica de las cumarinas sobre MAO-B. ... 8
1.1.2.4. Actividad biológica de las cumarinas y estudios in silico. ... 10
1.1.3. Técnica de las Relaciones Cuantitativas Estructura-Actividad (QSAR) ... 10
1.1.4 Descriptores fisicoquímicos. ... 12
1.1.4.1. Descriptor de efectos hidrofóbicos. ... 12
1.1.4.2. Descriptores de efectos electrónicos. ... 13
1.1.4.3. Descriptor de efectos estéricos. ... 14
1.1.5. Herramientas de la bioquímica computacional ... 15
1.1.6. Relaciones cuantitativas estructura-actividad (QSAR) ... 19
1.2. Justificación ... 21 1.3. Objetivos ... 22 1.3.1. General ... 22 1.3.2. Específicos ... 22 2. Materiales y métodos ... 23 2.1. Inhibidores ... 23 2.2. Enzimas ... 24 2.3. Docking ... 26
2.3.1. Selección del tamaño de la caja (grid box) y número de residuos flexibles. ... 27
2.3.2. Parámetros generales en el proceso de docking. ... 28
2.4. Análisis de los datos obtenidos por docking. ... 29
2.4.1. Grupos de conformaciones. ... 29
2.4.2. Análisis de los modos de unión. ... 29
2.5. Método de cálculo de la constante de inhibición. ... 32
2.5.1. Constante de inhibición (Ki). ... 32
2.5.1. Cálculo de la constante de inhibición (Ki). ... 32
3. Resultados y discusión ... 34
3.1. Estructura molecular de los inhibidores ... 34
3.2. Elección del tamaño de la caja y número de residuos flexibles ... 37
3.3. Selección de los grupos flexibles en el sitio activo de las enzimas ... 38
3.3.1. Generalidades ... 38
3.3.4. MAO-B ... 41
3.4. Constantes de inhibición. ... 43
3.4.1. Generalidades, definiciones y criterios de selección. ... 43
3.4.2. Relación general de las constantes de inhibición con respecto a los sustituyentes en las posiciones 3 y 6 de la cumarina. ... 44
3.5. Estudio de las Relaciones Cuantitativas Estructura-Actividad (QSAR). ... 49
3.5.1. Modelos del análisis Hansch. ... 49
3.6. Modos de unión de los compuestos estudiados sobre trombina, MAO-B e integrasa del VIH-1. 56 3.6.1. Trombina. ... 56
3.6.2. MAO-B. ... 69
3.6.3. Integrasa del VIH-1. ... 77
3.7. Selección y modos de unión de los inhibidores con mejor respuesta biológica. ... 84
3.7.1 Criterio de selección. ... 84
3.7.2 Trombina. ... 85
3.7.3 MAO-B. ... 85
3.7.4 Integrasa del VIH-1. ... 86
3.7.5 Modos de unión de los inhibidores con mejor respuesta biológica. ... 86
3.8. Comparación de las cumarinas con mejor respuesta biológica contra inhibidores comerciales. ... 93
3.8.1 Trombina. ... 93
3.8.2 MAO-B. ... 95
3.8.3 Integrasa del VIH-1. ... 96
4. Conclusiones ... 99
5. Referencias ... 102
6. Anexos ... 108
A. Tablas de resultados de los ensayos de docking. ... 108
A.1 Trombina. ... 108
A.2 Integrasa del HIV-1. ... 113
Índice de Figuras
Figura 1.1. Complejos donador-aceptor de compuestos derivados de 3-carboxicumarinas
CO-NHC2H4C6H5 en verde, 2-aminobenzotiazol en rojo y benceno en azul... 2
Figura 1.2. Puente disulfuro entre los aminoácidos CYS-1 de la unidad A (verde) CYS-122 de la unidad B (gris) de trombina... 5
Figura 1.3. Centro activo de la trombina. Se muestran algunos de los aminoácidos que lo constituyen... 7
Figura 1.4. Centro activo de la integrasa del VIH... 6
Figura 1.5. Cumermicina A1... 8
Figura 1.6. Posición relativa del dinucleótido de adenina y flavina (FAD) en MAO-B. Queda a la vista la sección de rivoflavina... 9
Figura 1.7. Principales aminoácidos del centro activo de MAO-B... 9
Figura 2.1. Interface de usuario del programa Hyperchem 7.0... 23
Figura 2.2. Interface de usuario del programa Gaussian 98... 23
Figura 2.3. Interface de usuario del programa OpenBabelGUI 2.1.1... 24
Figura 2.4. Página principal del Protein Data Bank... 25
Figura 2.5. Interface de usuario del programa AutoDock Tools 1.5.0... 25
Figura 2.6. Se muestra una caja (grid box) dentro de la cual están incluidos los residuos del centro activo... 26
Figura 2.7. Interface de usuario del programa Visual Molecular Dynamics 1.8.6... 28
Figura 2.8. Presentación de los grupos obtenidos de acuerdo a su energía de unión enzima-inhibidor. El ejemplo muestra los resultados de docking del compuesto 1c sobre trombina. La raíz cuadrática media (rms) es de 2 Å. La energía en el eje de las abscisas está en kcal/mol... 29
Figura 2.9. Interface gráfica de usuario diseñada por el autor para automatizar parcialmente el cálculo y representación gráfica bidimensional de las interacciones enzima-inhibidor en los ensayos de docking realizados en el presente trabajo... 30
Figura 2.10. Interface gráfica del programa UCSF Chimera 1.4 (build 29530). La molécula mostrada es una representación en cartoon de una unidad de la integrasa del VIH-1... 31
Figura 2.11. Interface gráfica del programa Utilidades Post Docking v1.0 donde se observa el módulo ―Arreglar docked‖ listo para ser ejecutado sobre los datos presentados en la ventana principal... 31
Figura 3.1. Comparación de las energías moleculares de diferentes rotámeros de 2-oxo-2H-cromeno-3-(2-hidroxi-etil)-amida... 34
Figura 3.2. Conformaciones de menor energía de 2-oxo-2H-cromeno-3-(2-hidroxi-etil)-amida con 6-sustituyentes: Br (izquierda) y carboxila-to (derecha)... 35
Figura 3.3. Superposición de las series de compuestos 2 (izquierda) y 4 (derecha)... 36
Figura 3.4. Ejemplo de identificación de los átomos que componen los residuos de aminoácidos... 40
Figura 3.5. Imágenes que muestran las distancias y los ángulos correspondientes a los puentes de hidrógeno e interacciones entre los residuos señalados... 40
Figura 3.6. Representación de superficie del centro activo de la integrasa del VIH. Los residuos aquí señalados no presentan interacciones intermolecu-lares con otros residuos... 41
Figura 3.7. Representación de superficie donde se muestran las posiciones relativas de los residuos principales del centro activo de MAO-B. Todos estos residuos se localizan en la parte interna de la enzima... 42
Figura 3.8. Se muestra la superposición de dos confórmeros correspondientes al compuesto 1m
que resultaron del análisis de docking sobre integrasa del VIH-1. Nótese la escasa separación
entre los átomos correspondientes de los dos confórmeros del ligante... 44
Figura 3.9. Relación de Ki con respecto a los sustituyentes en 3 y 6 en trombina... 46
Figura 3.10. Relación de Ki con respecto a los sustituyentes en 3 y 6 en integrasa del VIH-1... 47
Figura 3.11. Relación de Ki con respecto a los sustituyentes en 3 y 6 en MAO-B... 48
Figura 3.12. Representación gráfica de los valores estimados utilizando la ecuación 3.2 contra los valores observados en los ensayos de docking. Las líneas punteadas en rojo indican los límites de confianza en un 95%... 50
Figura 3.13. Representación gráfica de los valores estimados utilizando la ecuación 3.4 contra los valores observados en los ensayos de docking. Las líneas punteadas en rojo indican los límites de confianza en un 95%... 52
Figura 3.14. Representación gráfica de los valores estimados utilizando la ecuación 3.6 contra los valores observados en los ensayos de docking. Las líneas punteadas en rojo indican los límites de confianza en un 95%... 53
Figura 3.15. Representación gráfica de los valores estimados utilizando la ecuación 3.7 contra los valores observados en los ensayos de docking. Las líneas punteadas en rojo indican los límites de confianza en un 95%... 54
Figura 3.16. Posición del compuesto 1f en el sitio activo de trombina... 56
Figura 3.17. Interface gráfica de usuario de la consola de comandos del programa PyMOL 0.99rc6. La utilidad ―Measurement‖ está lista para ser ejecutada... 57
Figura 3.18. Visor tridimencional del programa PyMOL 0.99rc6. En la región inferior derecha se encuentran los comandos para medir distancias entre átomos seleccionados con el dispositivo señalador (mouse o touch pad)... 57
Figura 3.19. Se muestran las interacciones por puente de hidrógeno entre trombina y el inhibidor.. 58
Figura 3.20. Interface gráfica de usuario del programa Utilidades Post Docking v1.0 donde el módulo ―CuentaInter‖ (contador de interacciones) está listo para ser ejecutado... 60
Figura 3.21. Ejemplo de los archivos XLS que crea el módulo ―CuentaInter‖ del programa Utilidades Post Docking v1.0... 60
Figura 3.22. Representación gráfica de la constante de inhibición contra el número de interacciones relativo de las pruebas de docking de la serie de compuestos con 3-sustityente 1 sobre trombina. Se muestra en la figura la línea de tendencia entre ambos valores... 62
Figura 3.23. Representación gráfica de la constante de inhibición contra la inversa del número de interacciones relativo de las pruebas de docking de la serie de compuestos 1a-n sobre trombina. La línea de tendencia corresponde a la regresión lineal cuyo coeficiente de correlación es 0.9558... 63
Figura 3.24. Conjunto de rectas obtenidas aplicando los parámetros mostrados en la tabla 3.6 sobre la ecuación 3.9. Los números colocados a la derecha de las rectas corresponden al código del 3-sustituyente. La enzima tratada aquí es trombina... 64
Figura 3.25. Representación gráfica de la constante de inhibición contra el número de interacciones relativo de las pruebas de docking de la serie de compuestos 1a-10ª sobre trombina. Se muestra en la figura la línea de tendencia... 65
Figura 3.26. Representación gráfica de la constante de inhibición contra la inversa del número de interacciones relativo de las pruebas de docking de la serie de compuestos con 6-sustityente a sobre trombina. La línea de tendencia corresponde a la regresión lineal cuyo coeficiente de correlación es 0.9734... 66
Figura 3.27. Conjunto de rectas obtenidas aplicando los parámetros mostrados en la tabla 3.6 sobre la ecuación 3.9. Las letras colocadas a la derecha de las rectas corresponden al código del 6-sustituyente. La enzima tratada aquí es trombina... 67
Figura 3.28. Posición del compuesto 1n en el sitio activo de MAO-B... 69
Figura 3.29. Se muestran las interacciones por puente de hidrógeno entre el hidrógeno del azufre
en CYS-172 y el inhibidor 1n... 70
Figura 3.30. Se muestran la cercanía del 6-sustituyente terbutilo del compuesto 1n con la sección
de rivoflavina de FAD... 70
Figura 3.31. Representación gráfica bidimensional de las interacciones totales calculadas por el
programa LIGPLOT. En negro se representan los átomos de carbono, en rojo los oxígenos, en
amarillo el azufre y en azul los nitrógenos... 71
Figura 3.32. Conjunto de rectas obtenidas aplicando los parámetros mostrados en la tabla 3.9
sobre la ecuación 3.9. Los números colocados a la derecha de las rectas corresponden al código del 3-sustituyente. No se presentan los datos para la serie de compuestos 6a-n. La enzima tratada aquí es MAO-B... 73
Figura 3.33. Conjunto de rectas obtenidas aplicando los parámetros mostrados en la tabla 3.10
sobre la ecuación 3.9. Las letras colocadas a la derecha de las rectas corresponden al código del 6-sustituyente. La enzima tratada aquí es MAO-B... 75
Figura 3.34. Posición del compuesto 10k en el sitio activo de integrasa del VIH-1... 77
Figura 3.35. Se muestran las interacciones por puente de hidrógeno entre el hidrógeno de
THR-115 y GLU-138 con el nitrógeno de la sulfamida del inhibidor 10k... 78
Figura 3.36. Representación gráfica bidimensional de las interacciones totales entre el compuesto 10k e integrasa del VIH-1 calculadas por el programa LIGPLOT. En negro se representan los
átomos de carbono, en rojo los oxígenos, en amarillo el azufre y en azul los nitrógenos... 79
Figura 3.37. Conjunto de rectas obtenidas aplicando los parámetros mostrados en la tabla 3.12
sobre la ecuación 3.9. Los números colocados a la derecha de las rectas corresponden al código del 3-sustituyente. La enzima tratada aquí es integrasa del VIH-1... 81
Figura 3.38. Conjunto de rectas obtenidas aplicando los parámetros mostrados en la tabla 3.13
sobre la ecuación 3.9. Las letras colocadas a la derecha de las rectas corresponden al código del 6-sustituyente. La enzima tratada aquí es integrasa del VIH-1... 83
Figura 3.39. Representación gráfica bidimensional de las interacciones totales entre el compuesto
con mejor respuesta biológica (2f) y trombina calculadas por el programa LIGPLOT. En negro se
representan los átomos de carbono, en rojo los oxígenos y en azul los nitrógenos... 87
Figura 3.40. Representación gráfica bidimensional de las interacciones totales entre el compuesto
con mejor respuesta biológica (3n) y MAO-B calculadas por el programa LIGPLOT. En negro se representan los átomos de carbono, en rojo los oxígenos, en amarillo el azufre y en azul los
nitrógenos... 89
Figura 3.41. Representación gráfica bidimensional de las interacciones totales entre el compuesto
con mejor respuesta biológica (10j) e integrasa del VIH-1 calculadas por el programa LIGPLOT.
En negro se representan los átomos de carbono, en rojo los oxígenos y en azul los nitrógenos... 90
Figura 3.42. Estudio de docking llevado a cabo por otros investigadores de (3-clorofenil)
6-(clorometil)-2-oxo-cromeno-3-carboxilato sobre trombina. 15 Pueden apreciarse los residuos de
aminoácidos (verde) que rodean al ligante (anaranjado)... 91
Figura 3.43. Estudio de docking llevado a cabo por otros investigadores utilizando
1,2-difenil-2-buteno sobre MAO-B... 92
Figura 3.44. Estudio de docking llevado a cabo por otros investigadores utilizando
1-[5-(1,1-dioxotiazina-2-il)-8-hidroxi-1,6-naftiridin-7-il]-2-(4-fluoroanilino)etanona como inhibidor sobre
Índice de Tablas
Tabla 1.1. Sustituyentes de las posiciones 3 y 6 de 2oxo-2H-1-benzopirano... 3
Tabla 3.1. Valores obtenidos de F por análisis de varianza de acuerdo a las cuatro respuestas
indicadas en el texto. F0.01, 1,8 = 11.2586... 38
Tabla 3.2. Resultados obtenidos de las pruebas de docking sobre trombina utilizando como
inhibidores la serie de compuestos 1. Se muestran las energías de enlace de los complejos enzima-ligante así como las constantes de inhibición. También se observa alguna información sobre los
grupos (clusters)... 45
Tabla 3.3. Relación de los compuestos con 3.sustituyente variable cuyos modelos resultaron
aceptables. Se señala la enzima sobre la cual fueron probados... 55
Tabla 3.4. Interacciones por puente de hidrógeno de algunos derivados 6-sustituidos de
2-oxo-2H-cromeno-3-(2-hidroxi-etil)-amida sobre trombina... 59
Tabla 3.5. Interacciones totales (puente de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas) para las
conformaciones de menor energía de los compuestos 3 y 6 disustituidos sometidos a docking
sobre trombina... 61
Tabla 3.6. Parámetros de las regresiones lineales sobre los datos de Ki contra 1/N para cada una
de las series de compuestos 3-sustituídos probados por docking sobre trombina... 64
Tabla 3.7. Parámetros de las regresiones lineales sobre los datos de Ki contra 1/N para cada una
de las series de compuestos 6-sustituídos probados por docking sobre trombina... 66
Tabla 3.8. Interacciones totales (puente de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas) para las
conformaciones de menor energía de los compuestos 3 y 6 disustituidos sometidos a docking
sobre MAO-B... 72
Tabla 3.9. Parámetros de las regresiones lineales sobre los datos de Ki contra 1/N para cada una
de las series de compuestos 3-sustituídos probados por docking sobre MAO-B... 72
Tabla 3.10. Parámetros de las regresiones lineales sobre los datos de Ki contra 1/N para cada una
de las series de compuestos 6-sustituídos probados por docking sobre MAO-B... 74
Tabla 3.11. Interacciones totales (puente de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas) para las
conformaciones de menor energía de los compuestos 3 y 6 disustituidos sometidos a docking
sobre integrasa del VIH-1... 80
Tabla 3.12. Parámetros de las regresiones lineales sobre los datos de Ki contra 1/N para cada una
de las series de compuestos 3-sustituídos probados por docking sobre integrasa del VIH-1... 80
Tabla 3.13. Parámetros de las regresiones lineales sobre los datos de Ki contra 1/N para cada una
de las series de compuestos 6-sustituídos probados por docking sobre integrasa del VIH-1... 82
Tabla 3.14. Valores de la constante de inhibición de los fármacos comparativos y el compuesto
2f... 94
Tabla 3.15. Valores de la constante de inhibición de los fármacos comparativos y el compuesto
3n... 96
Tabla 3.16. Valores de la constante de inhibición de los fármacos comparativos y el compuesto
Índice de Esquemas
Esquema 1.1. Lactonización del ácido cumarínico... 1
Esquema 1.2. Estructura de los derivados 3 y 6 disustituidos de 2oxo-2H-1-benzo-pirano... 2
Esquema 3.1. Compuesto 2f: 6-nitro-2-oxo-N-(1-feniletil)cromeno-3-carboxamida... 85
Esquema 3.2. Compuesto 3n: 6-terbutil-2-oxo-N-fenetil-cromeno-3-carboxamida... 85
Esquema 3.3. Compuesto 10j: (3-azaniomil-2-oxo-cromen-6-il)amonio... 86
Esquema 3.4. Dicumarol (4-hidroxi-3-[(4-hidroxi-2-oxo-cromen-3-il)metil]cromen-2-ona)... 93
Esquema 3.5. Warfarina (4-hidroxi-3-[(1S)-3-oxo-1-fenil-butil]cromen-2-ona)... 94
Esquema 3.6. Selegilina ((2R)-N-metil-1-fenil-N-prop-2-inil-propan-2-amina)... 95
Esquema 3.7. Rasagilina ((1R)-N-prop-2-inilindan-1-amina)... 95
Esquema 3.8. Raltegravir (4-[(4-fluorofenil)metilcarba-moil]-1-metil-2-[1-metil-1-[(5-metil-1,3,4-oxadiazol-2-carbo-nil)amino]etil]-6-oxo-pirimidin-5-olato de potasio)... 97
Esquema 3.9. Elvitegravir (ácido 6-[(3-cloro-2-fluoro-fenil)metil]-1-[(1S)-1-(hidroximetil)-2-metil-propil]-7-metoxi-4-oxo-quinolina-3-carboxílico)... 97
1. Introducción
1.1. Antecedentes
1.1.1. Cumarinas
Con el nombre de cumarinas se conoce un grupo muy amplio de principios activos fenólicos que se encuentran en forma natural en plantas medicinales y compuestos sintéticos que tienen en común una estructura química de 2H-1-benzopiran-2-ona, denominada cumarina. 1
Se han reportado, hasta el año 2002, mil novecientas cincuenta y cuatro cumarinas 2 de origen natural y debido a su gran actividad biológica se han desarrollado varios métodos de síntesis para la obtención de nuevos derivados cumarínicos. 3
La cumarina se obtiene biosintéticamente por lactonización del ácido cumarínico. (Esquema 1.1)
OHCOOH O O
Esquema 1.1. Lactonización del ácido cumarínico.
La disposición de los sustituyentes y su naturaleza química diversa, da lugar a distintos tipos de cumarinas: sencillas y complejas.
Las cumarinas constituyen un grupo importante de compuestos naturales a las que se le atribuyen una gran variedad de propiedades farmacológicas entre las que se destacan como anticoagulantes, espasmolíticos, antihelmínticos diuréticos e hipoglucemiantes. 4, 5, 6, 7
Nuestro grupo de trabajo ha realizado investigaciones detalladas en la caracterización por espectroscopía de RMN de 13C de 3-carboxicumarinas. 8 Se ha realizado un estudio cristalográfico en estado sólido que indica que las moléculas se asocian entre sí mismas formando dímeros. 9 Se han sintetizado y caracterizado
compuestos derivados de 3-carboxicumarinas así como la formación en estado sólido de complejos donador-aceptor (figura 1.1). 10, 11, 12
Figura 1.1. Complejos donador-aceptor de compuestos derivados de
3-carboxicuma-rinas 9. CO-NHC2H4C6H5 en verde, 2-aminobenzotiazol en rojo y
benceno en azul.
Se han reportado actividades inhibitorias específicas, en especial de los derivados de cumarinas 3 y 6 sustituidas. 8 (Esquema 1.2)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Esquema 1.2. Estructura de los derivados
3 y 6 disustituidos de 2oxo-2H-1-benzo-pirano.
Nuestro grupo de trabajo también ha sintetizado diversos tipos de cumarinas así como realizado su caracterización espectroscópica. 8, 9, 10, 11, 12, 13
Para la realización del presente trabajo se seleccionaron diferentes sustituyentes, con efectos electrónicos, hidrofóbicos y estéricos variados, en las posiciones 3 y 6. La
tabla 1.1 muestra esta selección refiriéndose los grupos R y G a los sustituyentes mostrados en el esquema 1.2.
Tabla 1.1. Sustituyentes de las posiciones 3 y 6 de 2oxo-2H-1-benzopirano.
R
G
1 = CONHC2H4OH a = H 2 = CONH(C2H4)-1’-C6H5 b = OH 3 = CO-NHC2H4C6H5 c = Br 4 = CO-Adamantanilo d = Cl 5 = CO-NC5H10 e = OMe 6 = bis-[N-(2-oxo-2H-1-benzopiranil-3-amidil)oxalil]piperazina f = NO2 7 = NHCOCH3 g = COOH 8 = NHCOCOOC2H5 h =COO 9 = COOC2H5 i = NH2 10 = NH3+ j = NH3+ k = SO2NH2 l = Met m = Propilo n = TerbutiloCuando se haga referencia a un compuesto específico, se utilizará un número seguido de una letra. El número se refiere al 3-sustituyente y la letra al 6-sustituyente. Así, el código 1b se refiere al compuesto:
O O O NH OH O H
el código 4f se refiere al compuesto:
O O NH O N+ O -O
1.1.2. Enzimas blanco
1.1.2.1. Actividad biológica de las cumarinas sobre trombina.
Una de las principales características terapéuticas de los derivados cumarínicos es su acción anticoagulante para prevenir la trombosis venosa. El dicumarol es un ejemplo de estos compuestos, el cual actúa como antagonista competitivo de la vitamina K, de la que dependen la síntesis de los factores funcionales II (protrombina), VII (proconvertina), IX (tromboplastina) y X (factor de Stuart-Prower). 14 La trombina y el factor X constituyen importantes proteasas serínicas semejantes a la tripsina, las cuales se encuentran involucradas en la cascada de coagulación. La trombina juega un papel importante en la trombosis y hemostasis. Además, como enzima terminal de la cascada de coagulación, la trombina es directamente responsable de la conversión de la glicoproteína fibrinógena a fibrina. Se ha encontrado que derivados cumarínicos actúan directamente sobre los sitios activos de la trombina. 15
La trombina es una glicoproteína que pertenece a la familia de la tripsina debido a su estructura semejante con dicha enzima y, como ésta, es una proteasa. Está integrada por dos unidades polipéptidicas. La unidad A que está formada por 36 aminoácidos y la unidad B constituida por 259 aminoácidos. Ambas unidades están unidas por un puente disulfuro entre los aminoácidos CYS-1 (A) y CYS-122 (B) (figura 1.2). Su sitio activo está determinado por los aminoácidos: HIS-57, ASP-102, ASP-189, GLY-193, SER-195, TRP-215, GLY-216, GLY-219 y TYR-228 (figura 1.3). 16
Figura 1.2. Puente disulfuro entre los aminoácidos CYS-1
de la unidad A (verde) y CYS-122 de la unidad B (gris) de trombina.
Como en todas las proteínas de la familia de la tripsina, el residuo SER-195 juega un rol fundamental en la acción catalítica de esta familia de enzimas, por lo que se les conoce como enzimas serínicas. La trombina tiene un peso molecular de 33701 dalton.
Figura 1.3. Centro activo de la trombina. Se muestran
1.1.2.2. Actividad biológica de las cumarinas sobre integrasa del VIH-1.
El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) ha sido objeto de innumerables estudios dentro del campo del diseño de fármacos durante los últimos 30 años. Hasta la fecha no ha sido posible encontrar una vacuna que sea eficaz, toda vez que este virus afecta al mismo sistema inmune, además de su rápida mutación. Desde el punto de vista práctico se han realizado esfuerzos para detener la propagación de dicho virus atacando diferentes puntos en su proceso de replicación. Uno de tales procesos es la integración del ADN viral al ADN de la célula infectada. La enzima responsable de dicho proceso se conoce con el nombre de integrasa.
La integrasa del VIH está codificada dentro del gen pol. Este último también codifica una proteasa y a la transcriptasa inversa. La integrasa del VIH se encuentra en forma de poliproteína justo después de la transcripción del gen pol. La integrasa se forma por acción de la proteasa sobre dicha poliproteína durante el proceso de maduración. La proteína está formada por tres dominios: N-terminal, catalítico y C-terminal y su peso molecular de 32166 Da. 17 El dominio N-terminal se expande por multimerización a través de un átomo de zinc por medio de enlaces de coordinación permitiendo la integración concertada de las dos terminaciones de cADN viral dentro del cromosoma del huésped. El dominio C-terminal es responsable de la unión al ADN e independiente del metal de coordinación y de la secuencia del ADN. Dentro del dominio catalítico se encuentra el sitio activo, el cual está constituido por tres aminoácidos esenciales: ASP-64, ASP-116 y GLU-152 18 (figura 1.4). Estos residuos ácidos se coordinan con al menos uno y probablemente dos cationes divalentes de magnesio o manganeso que forman un puente con los sustratos ADN. 19, 20 La mutación de cualquiera de estos residuos suprime la actividad enzimática y, por ende, la replicación viral. La integrasa del VIH funciona como un multímero.
Figura 1.4. Centro activo de la integrasa del VIH.
La integración requiere de varios cofactores además de la integrasa del VIH. 21 El complejo de integración (CPI) es una unidad estructural crucial requerida para la integración. El CPI contiene proteínas tanto del núcleo viral (matriz, nucleocápside, transcriptasa inversa) como de la célula huésped (factor de crecimiento del epitelio del cristalino (LEDGF/p75), INI1, factor de barrera a la autointegración (BAF), HMGA1). Probablemente el cADN viral se une a la integrasa del VIH inmediatamente después de la transcripción inversa. La integrasa se une también directamente al LEDGF/p75, INI1, la transcriptasa inversa y la matriz. 22 Después de la integración, las enzimas celulares reparan el sitio de integración. 23 La integración se lleva a cabo sin el auxilio de energía exógena (ATP). 23 El sitio e integración es influido por la accesibilidad del ADN cromosomal y no por una secuencia específica de ADN. 24
Se ha encontrado que algunas cumarinas hidroxiladas en la posición 4 así como sus derivados, como la cumermicina A1 (figura 1.5) muestran actividad inhibitoria sobre la integrasa del VIH-1. 5
Figura 1.5. Cumermicina A1.
1.1.2.3. Actividad biológica de las cumarinas sobre MAO-B.
Las monoaminooxidasas (MAO) de eucariontes catalizan la desaminación oxidativa de monoaminas aromáticas primarias y secundarias utilizando oxígeno molecular para remover el grupo amino de la molécula de sustrato obteniendo así las iminas correspondientes con la consecuente reducción del oxígeno a peróxido de hidrógeno. 25 Ya que contienen el cofactor FAD (figura 1.6) se clasifican como flavoproteínas. En los mamíferos existen dos tipos de monoaminooxidasas: monoaminooxidasa-A (MAO-A) y monoaminooxidasa-B (MAO-B). Son codificadas por genes diferentes que comparten alrededor del 70% de su identidad de secuencia. 26 La MAO-B es más activa sobre arilalquilaminas que sobre otros neurotransmisores comunes. Su principal rol podría estar en el metabolismo de aminas exógenas para prevenir su posible función como falsos neurotransmisores. 26 La MAO-B es particular-mente específica sobre serotonina, norepinefrina (noradrenalina) y epinefrina (adrenalina). La fenetilamina es atacada por la MAO-B. Ambas MAOs actúan con la misma eficacia sobre dopamina. La enzima nativa ha sido purificada de las mitocontrias del riñón de bovinos, 27 de las mitocondrias del hígado de ratas y humanos 28 y de plaquetas humanas. 29 Se ha determinado la estructura cristalina de la enzima humana.
2, 25, 30
La MAO-B de hígado humano recombinante se ha caracterizado así como su expresión a niveles elevados en Pichia pastoris. 31, 32 El peso molecular experimental de la MAO-B es de 59474 Da. 31 El sitio activo de MAO-B está compuesto por 7 aminoácidos principales que son 60, 188, ILE-198, ILE-199, 326, TYR-398 y TYR-435 2 (figura 1.7).
Figura 1.6. Posición relativa del dinucleótido de
adenina y flavina (FAD) en MAO-B. Queda a la vista la sección de rivoflavina.
Figura 1.7. Principales aminoácidos del centro activo
de MAO-B.
Se ha demostrado que inhibidores de la MAO-B son efectivos en el tratamiento del mal de Parkinson y posiblemente en la enfermedad de Alzheimer. 33 En el mal de Parkinson la disminución del estímulo de las células motoras de la corteza cerebral por los ganglios basales, es causada regularmente por la insuficiente formación y con ello la escasa acción, de la dopamina producida por las neuronas dopaminérgicas del cerebro. Al inhibir la MAO-B se reduce la desaminación oxidativa de dopamina y por lo
tanto se incrementa la concentración de ésta en los ganglios basales de la corteza cerebral.
Algunas investigaciones sugieren que derivados cumarínicos inhiben a las MAO, particularmente MAO-B. 6
1.1.2.4. Actividad biológica de las cumarinas y estudios in silico.
Como se ha referido, las cumarinas tienen actividades inhibitorias sobre enzimas específicas. Para dirigir las futuras investigaciones es conveniente conocer la influencia de los diferentes sustituyentes en variadas posiciones en cumarinas. Si se pudiera hacer una estimación de las actividades inhibitorias de estos compuestos se tendría la posibilidad de dedicar recursos en la síntesis y caracterización de los mismos. El docking es un método para estudiar la capacidad inhibitoria de moléculas que actúen como posibles ligantes sobre enzimas blanco específicas. 34 Para este fin se han realizado estudios de evaluación sobre los diferentes programas que existen hasta el momento para pruebas de docking. Estos programas presentan ventajas y desventajas unos sobre otros como se verá en la siguiente sección. 35 Se han realizado estudios de docking utilizando derivados cumarínicos cuyo objetivo ha sido el de dar una explicación estructural de la selectividad y actividad inhibitoria de dichos derivados sobre trombina. 16
1.1.3. Técnica de las Relaciones Cuantitativas Estructura-Actividad
(QSAR)
El desarrollo de la técnica de las Relaciones Cuantitativas Estructura-Actividad (QSAR) ha sido de gran utilidad en el desarrollo de nuevos fármacos. La estrategia general consiste en establecer un fármaco prototipo ("cabeza de serie" o farmacóforo) y sobre éste proponer diferentes sustituyentes en átomos específicos. Se ha demostrado que existe una dependencia entre parámetros fisicoquímicos como son la "sigma" de Hammett (efectos electrónicos), el logaritmo del coeficiente de reparto octanol-agua (LogP, efectos hidrofóbicos) y la refractividad molar (RM, efectos estéricos) entre otros, y una respuesta biológica que puede ser la constante de inhibición (Ki). Esta dependencia puede correlacionarse utilizando técnicas estadísticas de modelado
empírico y obtener así modelos matemáticos que permitan la optimización de un fármaco potencial. 36 Hansch y Fujita desarrollaron este sistema en 1963 y desde entonces se han reportado diferentes modelos que responden a pares específicos enzima-farmacóforo. 37 De acuerdo a la metodología extratermodinámica, el diseño general del modelo que supone la dependencia entre una respuesta biológica y los diferentes efectos fisicoquímicos se plantea como una suma de funciones que describen dichos efectos sobre la respuesta biológica y que puede representarse como:
A = F(xh) + F(xe) + F(xs) + F(xo)
donde A representa una respuesta biológica, xh, xe y xs son parámetros fisicoquímicos
que representan los diferentes efectos (xh: hidrófóbicos, xe: electrónicos y xs: estéricos)
y xo representa otros efectos como pueden ser la polarizabilidad, la formación de
puentes de hidrógeno, etc. 38 Por lo regular son modelos de segundo grado; al menos en uno de los parámetros fisicoquímicos empleados (generalmente el que representa los efectos hidrofóbicos), Vb. gr, la acción antitumoral de 1-(X-Aril)-3,3-dialquiltriazenos en ratones: 39
log 1/C = 0.100 (0.08) logP - 0.042 (0.02) (logP)2 - 0.312 (O.11) + - 0.178 (0.08) MR + 0.391 (0.18) Es + 4.124 (0.27)
donde C es la concentración molar de inhibidor que produce un incremento del 40% en la vida de los ratones, + es un parámetro electrónico, MR es la refractividad molar y Es es un parámetro estérico. Los valores entre paréntesis corresponden a los intervalos de confianza dentro de un 95%.
Para llegar a este tipo de modelos se requiere llevar a cabo un proceso en el que se distinguen las siguientes fases:
a) La selección del prototipo cabeza de serie (farmacóforo)
b) El diseño de una serie de exploración de análogos del prototipo. Síntesis de los mismos.
c) La caracterización fisicoquímica (xh, xe, xs) y biológica (A) de cada uno de los
d) La búsqueda mediante análisis de regresión de un modelo que relacione los parámetros fisicoquímicos y la actividad biológica. 36
1.1.4 Descriptores fisicoquímicos.
Para el desarrollo del presente trabajo se seleccionaron sustituyentes en las posiciones 3 y 6 de la cumarina con la finalidad de tener efectos hidrofóbicos, electrónicos y estéricos de diferentes magnitudes al interactuar con las enzimas blanco. Con este fin se eligieron los descriptores fisicoquímicos que se presentan a continuación.
1.1.4.1. Descriptor de efectos hidrofóbicos.
El logaritmo del coeficiente de partición octanol-agua, LogP, está definido como:
agua ionizado no ol tan oc soluto soluto log LogP 1.1Cuando se encuentran en equilibrio las fases de un sistema constituido por una mezcla de octanol, agua y un soluto, el coeficiente de partición octanol-agua de dicho soluto se define como la razón entre la concentración del soluto en la fase abundante en octanol y la concentración del mismo soluto no ionizado en la fase constituida principalmente por agua. 37 El descriptor LogP es un valor esencialmente experimental, pero puede ser calculado con suficiente precisión utilizando diferentes métodos de predicción: a) basadas en los fragmentos que integran el grupo de interés (contribución grupal, ClogP), b) minería de datos y c) basadas en la contribución atómica (AlogP, MlogP). En las predicciones basadas en los fragmentos que integran el grupo de interés, generalmente se suman los coeficientes de partición octanol-agua experimentales de los fragmentos que integran dicho grupo. 40, 41 La minería de datos es el proceso de extracción de patrones de información a partir de datos obtenidos o coleccionados. Utiliza métodos como las máquinas de vectores de soporte, 42 árboles de decisión, o redes neuronales. 43 Este método es por lo regular satisfactorio para el cálculo del LogP cuando se usa con compuestos que tienen estructuras químicas similares y valores de LogP conocidos. Las predicciones basadas en la contribución
atómica son los métodos más simples. Las predicciones se basan en la parametri-zación de la contribución de varios átomos al coeficiente de partición molecular total utilizando ajustes de mínimos cuadrados de los datos medidos experimentalmente de un conjunto de compuestos probados. 44, 45, 46 Para obtener correlaciones razonables, los elementos más comunes contenidos en los fármacos (H, C, O, S, N y halógenos) se dividen en diferentes tipos de átomos dependiendo del entorno del átomo dentro de la molécula. Aunque este método es el menos exacto, la ventaja que tiene es que es el más general, siendo capaz de proveer al menos un cálculo estimado para una amplia variedad de moléculas. El método de estimación más socorrido en el desarrollo de fármacos es el descrito por Moriguchi 46 (MlogP) por ser uno de los más exactos dentro de los métodos de predicción basados en contribuciones atómicas. En el presente trabajo es el que será empleado en el estudio QSAR y que fue calculado utilizando el programa Molecular Modeling Pro 3.6. 47
1.1.4.2. Descriptores de efectos electrónicos.
La llamada sigma de Hammett en compuestos aromáticos es el logaritmo de la relación entre la constante de disociación de ácidos benzoicos sustituidos (KX) y la
constante de disociación del ácido benzoico (KH) en agua (ecuación 1.2).
H X K K log 1.2
Según se trate de sustituyentes en posición orto, meta o para con respecto al ácido carboxílico en el anillo bencénico, se distinguen los tipos de sigma correspondientes: sigma orto (σo), sigma meta (σm) y sigma para (σp). El método de
estimación que se utiliza más frecuentemente para la determinación de estos parámetros se basa en el cálculo de incrementos de la energía de unión del electrón central (core electron binding energy shifts, ΔCEBE), ya que se ha demostrado un comportamiento lineal entre el cálculo de ΔCEBE y los valores de sigma (ecuación 1.3), 48 con k aproximadamente igual a la unidad, 49 por lo tanto el valor numérico de ΔCEBE corresponde aproximadamente al de la sigma de Hammett.
Debido a que los sustituyentes empleados no se encuentran en posición orto en los conjuntos de compuestos estudiados en el presente trabajo, para ensayo QSAR se emplean únicamente las sigmas meta y para (σm y σp), calculados en el presente
trabajo empleando el programa Molecular Modeling Pro 3.6. 47
1.1.4.3. Descriptor de efectos estéricos.
La refractividad molar (RM) representa el volumen molar (M/ρ, donde M es el peso molecular y ρ la densidad a 20 ºC) multiplicado por un factor que refleja la polarizabilidad de la molécula estudiada, responsable de las interacciones de London, que incluye el índice de refracción n: 37
2
1 M RM 2 2 n n 1.4La refractividad molar está expresada en unidades de volumen sobre mol. Por lo regular se representa en cm3/mol.
Un método para la estimación de la refractividad molar se basa en la asignación de 22 contribuciones atómicas obtenidas por la clasificación de cada fragmento atómico de acuerdo con el número y la naturaleza de los átomos conectados al fragmen-to. 50, 51, 52, 53 El coeficiente de correlación reportado entre los datos observados y los valores estimados de la refractividad molar empleando la ecuación 3.4 es 0.999, con una desviación estándar de 0.774. Este método es ampliamente utilizado para los estudios QSAR. 54
Para su utilización en el presente trabajo, la refractividad molar de los inhibidores se calculó utilizando el programa Hyperchem 7.0 55
Hasta el presente se han hecho estudios in vitro e in vivo para determinar la actividad biológica de diferentes fármacos sintetizados en el laboratorio y posteriormente realizar el análisis QSAR. Estos estudios consumen tiempo y recursos debido a su naturaleza. Algunos autores han hecho, además, simulaciones de docking sobre sus mismos trabajos con el fin de teorizar las formas de unión de los ligantes en
la enzima en cuestión. 16, 56, 57 El presente trabajo pretende seguir las fases de la técnica QSAR señaladas en el párrafo anterior utilizando exclusivamente métodos de la bioquímica computacional (in silico), para la determinación de la actividad biológica de los compuestos seleccionados sobre las enzimas blanco elegidas.
1.1.5. Herramientas de la bioquímica computacional
Los estudios de modelado molecular por computadora han sido útiles para entender mejor el mecanismo de acción de los inhibidores enzimáticos, así como de las diferentes características de las enzimas que condicionan el diseño de fármacos. Muchas características moleculares pueden ser difíciles de observar experimen-talmente, sin embargo, mediante simulaciones computacionales, pueden obtenerse conclusiones que complementen aquellas provenientes del laboratorio. El modelado molecular, además puede ser una herramienta útil en la planeación de experimentos, lo que permite ahorrar recursos. 58 Los diferentes métodos utilizados en el modelado molecular por computadora pueden clasificarse como sigue:
Métodos de orbitales moleculares
Ab initio:
Optimización geométrica de moléculas pequeñas (generalmente los inhibido-res)
Semiempíricos:
Optimización geométrica de moléculas pequeñas donde el costo tiempo-máquina con métodos ab initio resulta elevado
Métodos de mecánica molecular
Docking:
Cálculo de energías de unión entre moléculas de gran peso molecular o entre éstas y moléculas pequeñas
Los métodos ab initio (a primeros principios) se basan en la resolución de la ecuación de Schrödinger tomando exclusivamente las posiciones relativas de los
centros atómicos de una molécula en estudio y desplazar dichos centros hasta obtener posiciones relativas donde la energía de la densidad electrónica de la molécula obtenga un valor mínimo dentro del intervalo de tolerancia propuesto. 59
Los métodos semiempíricos utilizan la resolución de la ecuación de Schrödinger de forma semejante a los métodos ab initio, pero se introducen valores de parámetros específicos para cada tipo de átomo que provienen de parámetros experimentales. Estos métodos, por lo tanto, deben disponer de una base de datos con dichos parámetros para cada tipo de átomo. 59
Los métodos de la mecánica molecular se basan principalmente en el uso de las leyes de la electromecánica clásica aplicadas a partículas cargadas. Por lo general estos métodos también utilizan una base de datos con la información de afinidades electrónicas entre los diferentes tipos de átomos obtenidas experimentalmente. Las técnicas de docking están basadas en estos métodos. 59
Evidentemente, el costo en tiempo de máquina (el tiempo que dispone una computadora en realizar todos los cálculos de un modelado propuesto) es mayor en los cálculos ab initio que los semiempíricos, y éstos a su vez consumen mayor tiempo que los métodos de la mecánica molecular para una misma molécula. Por esta razón los métodos ab initio se prefieren para hacer el modelado de moléculas pequeñas como los inhibidores (de 2 a 30 átomos por regla general). Moléculas de mayor tamaño (entre 30 y 100 átomos) se prefieren modelar con métodos semiempíricos. Los elevados pesos moleculares de las enzimas hacen completamente impráctico (hasta el momento) el uso de métodos ab initio para el modelado molecular por computadora; se utilizan entonces métodos de la mecánica molecular. 59
La dinámica molecular es una herramienta muy poderosa ya que permite observar el ―movimiento‖ de los átomos de una molécula. En la mayoría de los métodos de modelado se trabaja comúnmente con estructuras rígidas, cuando en realidad las moléculas presentan movimiento y flexibilidad. 58
Con ayuda de la dinámica molecular ha sido posible observar diferencias en el comportamiento molecular entre enzimas similares que determinan la selectividad.
También es posible observar la actividad de inhibidores al estudiar dinámicamente la estabilidad de los complejos formados entre éstos y la enzima. Finalmente, la dinámica molecular permite hacer propuestas acerca de las bases moleculares de la inhibición tiempo-dependiente. 58
Entre los diferentes métodos, el docking ha sido particularmente útil en el diseño de inhibidores basado en la estructura de la enzima. Utilizando diversos programas se ha podido reproducir el modo de unión de inhibidores en el sitio activo de las enzimas, observado experimentalmente mediante difracción de rayos X. El docking permite además evaluar la fuerza con la que un inhibidor se une a la enzima. 60 De esta forma, el docking es una herramienta valiosa para predecir el modo de unión y la afinidad de un inhibidor en la estructura tridimensional de la enzima.
El método de docking consiste básicamente en ―incrustar‖ la estructura del ligante dentro de la estructura de la enzima en el sitio activo. Se busca la región en el sitio activo en donde exista mejor reconocimiento con el inhibidor, modelando una serie de interacciones no covalentes entre las moléculas. Además, se busca la conformación del inhibidor que mejor se adapte a la estructura de la enzima. Una vez formado el complejo enzima-inhibidor, es posible estimar una energía libre de unión. 58
De entre varios programas que existen en la actualidad para realizar docking destacan principalmente AutoDock, DOCK y GOLD. Se han hecho estudios de evaluación de dichos programas. 35 Los primeros dos programas se distribuyen gratuitamente para uso académico, mientras que GOLD es un programa comercial.
AutoDock se basa en un hibrido de un algoritmo genético y un método de búsqueda local de adaptación, llamado ―algoritmo genético lamarkiano‖. El algoritmo genético imita el proceso de selección natural para encontrar soluciones. En un estudio de docking la conformación del ligante representa a los cromosomas incluyendo los grados de libertad de conformación, orientación y translación, y el individuo representa un candidato de solución. Una población aleatoria de individuos se selecciona basándose en su adaptabilidad con el advenimiento de la mutación y la cruza de cromosomas individuales. El ciclo de generación es seguido por una búsqueda local de adaptación. Las soluciones se dan en dos anotaciones de energía: la energía final de
docking (FDE) y la energía de unión final estimada (EFEB), la que incluye las interacciones electrostáticas y de van der Waals, la pérdida de entropía en el ligante y el número de puentes de hidrógeno. 35
DOCK se basa en un algoritmo de construcción incremental y un algoritmo de búsqueda aleatoria. En el algoritmo de construcción incremental, una porción rígida del ligante (referida como ―áncora‖ en el programa) es superpuesta dentro de un sitio de unión definido por el usuario. Luego, la conformación del ligante se construye por adición de las partes remanentes al áncora paso a paso. La función que decide si la posición candidata del ligante es favorable está basada en términos intermoleculares de los campos de fuerza de la mecánica molecular. La función de energía usada aquí incluye interacciones de van der Waals y electrostáticas. 35
GOLD está basado en un algoritmo genético como el usado por AutoDock. Incluye dos funciones de decisión y varios ajustes de parámetros predefinidos. 35
DOCK tiene la ventaja de ser un programa rápido para la determinación de ubicaciones del ligante en el centro activo de la enzima. Esto se debe a que no realiza gran cantidad de cálculos para obtener las energías de unión más favorables. Sin embargo si se comparan los resultados obtenidos con este programa con los obtenidos por difracción de rayos X sobre los cristales crecidos en el laboratorio, existen variaciones entre las posiciones relativas de los ligantes en el centro activo. Para cálculos rápidos donde la posición exacta de los ligantes no es indispensable, este programa resulta suficiente. Los programas AutoDock y GOLD al utilizar algoritmos genéticos, tienden a imitar con mayor exactitud la unión entre el ligante y la enzima como sucede en la naturaleza. Para estudios QSAR estos dos últimos programas resultan más adecuados ya que por medio de la energía libre de unión del complejo enzima-ligante se puede estimar la constante de inhibición y utilizarla como respuesta biológica en un análisis de Hansch.
Los métodos de la bioquímica computacional han permitido el desarrollo de poderosas metodologías que combinan diferentes técnicas. Muchas de estas metodologías se aplican comúnmente a las enzimas blanco o diana propuestas,
ayudando en el desarrollo de nuevos fármacos y contribuyendo a dilucidar los diferentes mecanismos moleculares que rigen su actividad sobre estas enzimas. 61
Hablando particularmente de los estudios de docking, éstos tratan de simular la unión entre las enzimas y los inhibidores de la forma más semejante a la llevada a cabo en la naturaleza. Los métodos utilizados por los programas que simulan esta unión incluyen características aleatorias o de ensayo y error como los algoritmos genéticos. Esto hace de los resultados obtenidos mediante cálculos computacionales datos que pueden emplearse tal y como se tratan los datos que se obtienen en un laboratorio y por lo que puede considerárseles resultados experimentales. En años recientes ha crecido el uso de dichos cálculos y se les ha comparado con los resultados obtenidos en el laboratorio (in vitro) con excelentes correlaciones. Es por esto que se ha venido empleando el concepto ―estudios in silico‖ dando a entender que estos experimentos se llevan a cabo sobre los materiales que constituyen los componentes electrónicos de las computadoras fabricados con base en el silicio a semejanza de los materiales vítreos utilizados en el laboratorio.
1.1.6.
Relaciones cuantitativas estructura-actividad (QSAR)Los estudios de las relaciones cuantitativas estructura-actividad (QSAR) no sólo permiten la generación de modelos para la predicción de la actividad inhibitoria en función de propiedades fisicoquímicas de los inhibidores, además es posible obtener información acerca del ligante, incluso cuando no se le conoce en lo absoluto. Existen muchos estudios QSAR realizados con inhibidores de las enzimas seleccionadas. 62 Estos han permitido la optimización de numerosas series de análogos obteniéndose compuestos con alta actividad y selectividad por las enzimas.
Con el fin de llevar a cabo una línea de investigación más eficaz es posible hacer una predicción de la actividad inhibitoria de las cumarinas utilizando los recursos de la bioquímica computacional, además de conocer cuáles son las variables estructurales que puedan incrementar la actividad o selectividad sobre diversas enzimas y determinar qué compuestos serían susceptibles de una investigación posterior más detallada in vitro.
En la actualidad existen las herramientas computacionales necesarias tanto en materia de software como de hardware. En cuanto al software algunas aplicaciones son de tipo comercial y otras se distribuyen como software libre. El trabajo de anteriores investigadores ha demostrado que la calidad de estas últimas es tan buena como las comerciales. 35 Por lo que respecta al hardware, en estos momentos una computadora personal resulta bastante poderosa para realizar una gran cantidad de cálculos en tiempos relativamente breves.
El presente trabajo se refiere al estudio in silico de la estructura-actividad inhibitoria de derivados cumarínicos sobre trombina, monoamino-oxidasa B e integrasa del VIH.
1.2. Justificación
En la actualidad el estudio in vitro o in vivo de las relaciones estructura-actividad cuantitativas (QSAR) proporciona información útil en el desarrollo y la optimización de nuevos fármacos. La metodología empleada incluye procesos de purificación y caracterización de las enzimas a estudiar, síntesis y caracterización de la serie de compuestos que tienen como base el farmacóforo que se sabe actúa sobre las enzimas en estudio, medición de la actividad de los inhibidores sobre dichas enzimas utilizando parámetros que representen la respuesta biológica del fármaco (mortalidad, dosis media letal, constantes de inhibición, etc.). Para un posterior análisis estadístico, esta secuencia metodológica debe repetirse tantas veces sea necesario para recolectar los datos suficientes y obtener así resultados representativos dentro de los límites de confianza establecidos. Todo lo anterior presupone un gasto de recursos humanos, materiales y ambientales que resulta oneroso en todos los casos. Es posible establecer criterios en la selección de los grupos funcionales que se van a introducir en el farmacóforo con base en los efectos hidrofóbicos, estéricos y electrónicos de dichos grupos que se sabe que actúan de un modo particular en las enzimas estudiadas. Sin embargo, el no incluir algunos grupos funcionales en el farmacóforo de interés disminuye la eficiencia de la optimización debido al tamaño reducido de la población. Como se ha mencionado en la introducción de éste documento, en la actualidad existen las herramientas computacionales necesarias para llevar a cabo esta metodología en todas sus fases. Se ha dicho también que existe similitud entre los resultados obtenidos en estudios in vivo e in vitro con los conseguidos en experimentos in silico.
Con base en lo anterior, el presente trabajo queda justificado ya que el estudio in silico de las relaciones estructura-actividad cuantitativas ofrece un costo considerable-mente menor en los tres rubros mencionados. La adquisición de una computadora personal con características superiores y el software apropiado con sus respectivas licencias resulta, en la actualidad, poco onerosa. Si bien los estudios in vitro e in vivo no pueden ser sustituidos completamente por los estudios in silico, los resultados de éstos últimos pueden servir como un criterio base más racional en la elección de los experimentos in vitro e in vivo que deben llevarse a cabo en el desarrollo y optimización en la búsqueda de nuevos fármacos.
1.3. Objetivos
1.3.1. General
Establecer mediante el uso de herramientas de la bioquímica computacional los factores que favo-recen la actividad específica de cumarinas 3,6-sustituidas sobre las enzimas trombina, integrasa del VIH-1 y MAO-B.
1.3.2. Específicos
1. Diseñar una familia de compuestos derivados cumarínicos 3,6-substituidos, con variaciones estructurales que incluyan efectos estéricos, hidrofóbicos y electrónicos, y optimizar de su geometría mediante cálculos a primeros principios.
2. Modelar la acción inhibitoria de un conjunto de derivados cumarínicos 3,6-sustituidos sintetizados por nuestro grupo de trabajo, sobre trombina, MAO-B e integrasa del VIH-1, mediante docking.
3. Establecer las relaciones estructurales de los compuestos estudiados con su actividad inhibitoria sobre trombina, MAO-B e integrasa del VIH-1.
4. Relacionar el efecto de los sustituyentes con el modo de unión de los compuestos estudiados sobre trombina, MAO-B e integrasa del VIH-1.
2. Materiales y métodos
2.1. Inhibidores
Las estructuras de los inhibidores propuestos se dibujaron utilizando el programa Hyperchem 7.0 55 (figura 2.1). Dichas estructuras se optimizan estructuralmente usando cálculos de orbitales moleculares ab initio utilizado el programa Gaussian 98 63 (figura 2.2) para Windows con un nivel de teoría RHF/6-31G**. Se hicieron cálculos de frecuencias de un solo punto para verificar los mínimos globales así como las cargas Merz-Kollman-Singh. 64 Se empleó para este fin una PC P4 a 1.6 GHz con 512 MB en RAM.
Figura 2.1. Interface de usuario del programa Hyperchem 7.0.
Las estructuras optimizadas se convirtieron a formato *.PDB con el programa OpenBabelGUI ver. 2.1.1. 65
Figura 2.3. Interface de usuario del programa OpenBabelGUI 2.1.1.
2.2. Enzimas
Se realizó una búsqueda exhaustiva de los modelos moleculares de trombina, monoaminooxidasa-B e integrasa del VIH para la especie Homo sapiens en la página de internet del Protein Data Bank 66 (figura 2.4). La selección de los modelos moleculares de las tres enzimas que se utilizaron para la realización de este proyecto se hizo tomando en cuenta la resolución del modelo, así como las secuencias de aminoácidos más completas. A los modelos moleculares seleccionados se les eliminaron las moléculas de agua y otros inhibidores y se adicionaron átomos de hidrógeno a toda la estructura utilizando el programa AutoDock Tools ver. 1.5.0 rev. 6. 67 Se archiva el modelo en formato *.PDB.
Figura 2.4. Página principal del Protein Data Bank.
2.3. Docking
El diseño de los mapas de afinidad atómica y rejillas electrostáticas se realizaron utilizando el programa AutoGrid 4.0 68 utilizando para esto una PC AMD Sempron de 1.81 GHz y 1.5 GB de memoria. El procedimiento que se siguió consistió en colocar una caja (grid box) (figura 2.6) en el espacio que ocupan los residuos del centro activo de la enzima estudiada. El tamaño de dicha caja no debe ser menor que el de la molécula del inhibidor ya que éste será posicionado por el método genético lamarkiano en diferentes posiciones dentro del espacio que comprende la caja y así encontrar la ubicación donde el inhibidor genere menor energía libre de unión (docking). Se señalan los heteroátomos de los residuos flexibles y del inhibidor. Todos estos parámetros se almacenan en un archivo (pdbid.GPF). El programa AutoGrid 4 genera los archivos que corresponden a los mapas de afinidad atómica y rejillas electrostáticas (pdbid_rigid.MAP) y otro archivo denominado ―archivo de campo del sistema de visualización de la aplicación‖ y que contiene la información espacial de las rejillas electrostáticas (pdbid_rigid.MAPS.FLD)
Figura 2.6. Se muestra una caja (grid box) dentro de la
