INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
INFORME FINAL DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN:
DESARROLLO DE UN SISTEMA PARA SIMULAR IN VITRO LAS
CONDICIONES GASTROINTESTINALES HUMANAS PARA LA
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE BACTERIAS LÁCTICAS
PROBIÓTICAS.
CLAVE: 20082706
PERÍODO: DE ENERO A DICIEMBRE DE 2008
DR. ENRIQUE DURÁN PÁRAMO
DIRECTOR DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN UPIBI – IPN
1.- RESUMEN.
El presente proyecto de investigación tuvo como objetivo principal el desarrollo de un sistema para simular in vitro las condiciones gastrointestinales humanas para la evaluación de la viabilidad de bacterias lácticas probióticas. El proyecto comprendió dos etapas principales:
1.- El desarrollo del sistema de simulación in vitro de las condiciones gastrointestinales humanas, más complejo que los sistemas anteriormente utilizados en proyectos de investigación desarrollados con anterioridad a éste. 2.- La validación del sistema mediante la determinación de cinéticas de pérdida de viabilidad de bacterias lácticas probióticas. Para ello, se utilizó una cepa de Lactobacillus delbrueckii subs. bulgaricus y las cinéticas se realizaron con células libres e inmovilizadas, además en presencia o ausencia de algún alimento tipo mezclado con la preparación celular.
El trabajo realizado tuvo como antecedente los proyectos de investigación: “Aplicación de la inmovilización celular como vector de bacterias lácticas probióticas para la producción de alimentos funcionales” con clave 20060651 y “Evaluación de la viabilidad de Lactobacillus en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro”, con clave 20070160.
En dichos proyectos de investigación se realizó la simulación del sistema gastrointestinal humano in vitro con dos reactores muy simples y únicamente se emplearon los parámetros pH y presencia de bilis hepática, tratando de simular las condiciones fisicoquímicas existentes en el estómago y duodeno humano.
En el presente proyecto de investigación se desarrolló un sistema de simulación más complejo, en donde intervinieron dos reactores de 500 ml enchaquetados contando en sus cabezas salidas para la determinación de parámetros físicos y para la adición de las sustancias que permiten la simulación del sistema gastrointestinal humano. Uno de los dos reactores simuló in vitro el estómago humano y el segundo reactor simuló in vitro el duodeno humano. El reactor que
simuló el estomago humano contenía una solución que simuló el jugo gástrico humano, la cual estaba compuesta de: cloruro de sodio al 0.5% (p/v), pepsina (3 g/L) y mucina (4 g/L) todo ello a un pH de 2.0. Por otra parte, el reactor que simuló el duodeno contenía una solución que simuló el jugo pancreático humano, la cual estaba compuesta de cloruro de sodio al 0.5% (p/v), pancreatina (1 g/L), mucina (4 g/L) y bilis hepática 0.3% (p/v) todo ello a un pH de 6.8.
El sistema de simulación desarrollado en el presente proyecto fue más completo que los usados con anterioridad y permitió realizar cinéticas de pérdida de viabilidad bacteriana, más reproducibles que las anteriormente realizadas en proyectos de investigación precedentes.
2.- INTRODUCCIÓN.
El trabajo realizado tuvo como antecedente los proyectos de investigación: “Aplicación de la inmovilización celular como vector de bacterias lácticas probióticas para la producción de alimentos funcionales” con clave 20060651 y “Evaluación de la viabilidad de Lactobacillus en condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro”, con clave 20070160. En dichos proyectos se evaluó la técnica de inmovilización celular por atrapamiento utilizando Lactobacillus delbrueckii como cepa de estudio. Se evaluó el potencial de la técnica de inmovilización celular por atrapamiento como vector de bacterias lácticas probióticas. Se demostró que dicha técnica puede ser utilizada de manera eficaz para la producción de alimentos funcionales. Se realizaron experimentos de simulación in vitro bajo condiciones de acidez similares a las encontradas en el estómago humano. Se determinaron las pérdidas de viabilidad bacteriana en bacterias libres y en bacterias inmovilizadas en soportes de alginato. Así mismo, se determinó la influencia de la adición de un alimento tipo a las muestras bacterianas durante los experimentos de cinéticas de pérdida de viabilidad bacteriana mediante simulaciones in vitro de las condiciones gastrointestinales humanas.
La inmovilización celular representa un conjunto de técnicas que permiten localizar en un espacio definido a un conjunto de células para la realización de un gran número de bioconversiones. En proyectos anteriores, nuestro grupo de trabajo ha demostrado que la inmovilización de bacterias lácticas permite mantener los niveles de viabilidad de bacterias cuando son sometidas a procesos de conservación o de preservación de la actividad biológica, como la liofilización. Así también, se ha demostrado que la inmovilización de bacterias lácticas por la técnica de atrapamiento ha permitido el uso de reactores empacados para la inoculación continua de leche para la producción de cualquier producto lácteo.
Por otra parte, los alimentos funcionales son definidos como aquellos alimentos o componentes de éstos, que aportan un beneficio a la salud del consumidor, además de sus características básicas nutritivas. En los últimos años se han constatado los efectos benéficos de las bacterias lácticas en el organismo humano, lográndose evidenciar su efecto probiótico, es decir que estos microorganismos tienen efectos benéficos en la salud humana.
Dada la importancia de las bacterias lácticas probióticas, éstas se han introducido en una gran variedad de productos comerciales, llamados “alimentos probióticos”, debido a la inclusión de los microorganismos vivos. Uno de los principales alimentos probióticos es el yogurt en sus diferentes presentaciones.
Los productos lácteos con características probióticas están cada vez más presentes en la dieta humana. Es importante mencionar que las bacterias lácticas son microorganismos que pierden muy fácilmente su viabilidad, ya que son muy sensibles a los cambios bruscos del medio ambiente. Así mismo, es necesario considerar que en la actualidad las sociedades de consumo han establecido requerimientos para los alimentos que consume diferentes a los establecidos con anterioridad. Ahora, los consumidores buscan la adquisición de alimentos no solamente pensando en el aporte energético que éstos representan, sino en las características funcionales específicas que alguno de los componentes del alimento tiene. Con base en dicho fenómeno, se ha acuñado el término de alimentos funcionales como aquellos que proveen un plus, diferente al energético, a los mamíferos que los consumen.
En esta ocasión, el presente proyecto contempló el desarrolló un sistema de simulación más complejo, en donde intervinieron dos biorreactores de 500 ml enchaquetados contando en sus cabezas salidas para la determinación de parámetros físicos y para la adición de las sustancias que permiten la simulación del sistema gastrointestinal humano. Uno de los dos biorreactores simuló in vitro el estómago humano y el segundo reactor simuló in vitro el duodeno humano. El
biorreactor que simuló el estomago humano contenía una solución que simuló el jugo gástrico humano, la cual estaba compuesta de: cloruro de sodio al 0.5% (p/v), pepsina (3 g/L) y mucina (4 g/L) todo ello a un pH de 2.0. Por otra parte, el biorreactor que simuló el duodeno contenía una solución que simuló el jugo pancreático humano, la cual estaba compuesta de cloruro de sodio al 0.5% (p/v), pancreatina (1 g/L), mucina (4 g/L) y bilis hepática 0.3% (p/v) todo ello a un pH de 6.8.
Así mismo, también se evaluó la perdida de viabilidad de las bacterias lácticas, utilizando el sistema simulador, cuándo las bacterias están en presencia de algún alimento tipo.
3.- MATERIALES Y MÉTODOS.
En esta sección se explica de forma resumida la estrategia de trabajo y las técnicas utilizadas para el desarrollo del proyecto.
3.1.- Materiales.
El equipo requerido para el sistema de simulación del tracto gastrointestinal in vitro:
- 1 biorreactor de vidrio enchaquetado de 500 mL de capacidad, para simular condiciones fisicoquímicas similares a las del estómago humano in vitro. - 1 biorreactor de vidrio enchaquetado de 500 mL de capacidad, para simular condiciones fisicoquímicas similares a las del intestino humano in vitro, - 2 parrillas de agitación magnética,
- 2 agitadores magnéticos grandes, - 2 termómetros,
- 1 sistema de recirculación de agua con control de temperatura (baño), - 1 potenciómetro,
- 1 electrodo de pH, - 1 bomba peristáltica,
- 1 frasco de 250 mL para la solución de NaOH 1.5 M, - 1 frasco de 250 mL para la solución de HCl 5 M,
- 1 frasco de 100 mL para la solución de jugo gástrico simulado, - 1 frasco de 100 mL para la solución de jugo pancreático simulado, - 1 frasco de 250 mL para la muestra de alimento,
- pipetas automáticas de 1, 5 y 10 mL con puntas, - 1 vortex,
- manguera masterflex de15 mm de diámetro, - tubos de ensaye con rosca.
3.2.- Soluciones.
• Solución salina 0.9% (p/v).
• Solución de CaCl2 0.3 M. • Solución de NaOH 1.5 M.
• Solución de HCl 5 M.
• Solución de jugo pancreático simulado (solución salina estéril 0.5%, pancreatina 1%, mucina 4% (p/v) y bilis hepática Oxgall 0.3% (p/v) ajustando pH 6.8 con NaOH 1.5 M).
• Solución de jugo gástrico simulado (solución salina estéril 0.5% (p/v), pepsina 3% (p/v), mucina 4% (p/v) ajustando pH 2.0 con HCl 5 M).
• Solución de alginato de sodio 2% (p/v).
• Solución de citrato de sodio 0.1 M.
• Solución de dextran 2% (v/v).
• Solución de etanol 70% (v/v).
• 100 mL de muestra de alimento estéril
• Medio MRS líquido (ver Cuadro 1).
Cuadro 1. Formulación del medio MRS líquido (Man, Rogosa, M.E., 1960). REACTIVOS CANTIDAD Glucosa 20 g Peptona de caseína 10 g Extracto de carne 10 g Extracto de levadura 10 g Acetato de sodio 5 g Citrato de amonio 2 g
Fosfato ácido de potasio 2 g
Tween 80 1 mL
Sulfato de magnesio
héptahidratado 200 mg
Sulfato de manganeso 50 mg Agua destilada cbp. 1 L
Nota: para preparar medio sólido se agregan 12 g de agar bacteriológico.
3.3.- Desarrollo del sistema de simulación gastrointestinal in vitro.
El sistema constó de 2 biorreactores de vidrio con chaqueta que simularán el estómago y el duodeno humano in vitro (ver Figura 1), en los cuales se realizaron las cinéticas de pérdida de viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas, el desarrollo fue el siguiente:
a) Se adicionó la muestra de alimento estéril al estómago humano in vitro, el cual es simulado por el primer biorreactor enchaquetado, posteriormente, se adicionó la biomasa de Lactobacillus delbrueckii recuperada por centrifugación. La mezcla se homogenizó mediante agitación.
b) Después, se adicionó el jugo gástrico simulado y la mezcla (alimento, biomasa y jugo gástrico) contenida en el biorreactor se ajustó a pH de 2.0 utilizando una solución de HCl 5 M, la temperatura y la agitación se mantuvieron constantes a 37ºC y 50 rpm respectivamente durante toda la cinética.
c) Esta etapa tuvo una duración de 90 min, durante este tiempo la viabilidad bacteriana se monitoreó cada 30 min, se tomaron muestras de 1 mL se realizaron diluciones y se sembró en placa en medio MRS sólido, para la determinación de UFC/mL.
d) Al término de este tiempo la mezcla pasó al intestino delgado humano, el cual fue simulado in vitro por un segundo biorreactor enchaquetado, en esta etapa se adicionó el jugo pancreático simulado y se ajustó el pH a un valor de 6.8 con solución de NaOH 1.5 M, con ayuda de una bomba peristáltica se simuló la peristalsis intestinal. La temperatura y la agitación se mantienen constantes a 37ºC y 50 rpm respectivamente, la duración de esta etapa fue de 150 min.
e) Al igual que en la etapa anterior, se tomaron muestras cada 30 min para determinar la viabilidad bacteriana.
NaOH JUGO PANCREÁTICO + BILIS HEPÁTICA ALIMENTO M M JUGO GÁSTRICO
Figura 1. Esquema del diseño del sistema de simulación de estómago e intestino delgado humano in vitro, para el estudio de la viabilidad de bacterias lácticas.
A continuación se presenta el esquema y un diagrama de bloques de las etapas que conforman el estudio (Figuras 2 y 3).
Figura 2. Esquema de las etapas de división del estudio.
Células libres con alimento muestra y testigo.
Etapa 1: Estancia de células libres e inmovilizadas en el estómago in vitro. Jugo pancreático y (pancreatina, mucina y bilis hepática) pH 6.8, 50 rpm, 37ºC,
Células inmovilizadas con alimento muestra y testigo. jugo gástrico (pepsina, mucina) pH 2.0, 37ºC y 50 rpm, 90 min.
Etapa 1
Estómag
o
Etapa 2
I.
Células libres con alimento muestra y testigo.
150 min. Etapa 2: Estancia de células libres e inmovilizadas en el intestino delgado con peristalsis in vitro.
Células inmovilizadas con alimento muestra y testigo.
Figura 3. Diagrama de bloques de las etapas de la simulación gastrointestinal in vitro.
3.4.- Microorganismo.
La cepa de estudio fue Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus NRRL-734 obtenida del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos de Norteamérica.
3.5.- Cultivo.
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus se cultivó en medio líquido MRS a 38ºC y 180 rpm durante 24 horas. Posterior a la incubación, la biomasa se recuperó por medio de centrifugación (5000 rpm, 5 min, 4ºC).
3.6.- Pruebas de estabilidad del soporte sin células, en condiciones gastrointestinales in vitro.
Antes de inmovilizar las células de Lactobacillus delbrueckii fue necesario evaluar la estabilidad del soporte en las condiciones gastrointestinales in vitro en las cuales se trataron las células.
Dicha prueba consistió lo siguiente: se prepararon las partículas esféricas de alginato de sodio al 2% (p/v) y 2 mm de diámetro sin células, éstas se trataron durante 90 min bajo condiciones gástricas (pH 2.0) en el estómago humano simulado in vitro (etapa 1). Se tomaron muestras cada 30 min para medir el diámetro de las partículas (desgaste) y verificar si ocurrió debilitamiento del gel, esta observación se realiza de manera cualitativa. Posteriormente, las partículas de gel fueron tratadas durante 150 min en condiciones similares a las del intestino delgado humano, esto fue, en presencia de jugo pancreático (pH 6.8) y con peristalsis intestinal simulada por medio de una bomba peristáltica, todo esto se realizó en el segundo biorreactor que simuló el intestino delgado in vitro. Se evaluó la estabilidad del gel tomando muestras de 100 partículas cada 30 min y se midió el desgaste y el debilitamiento del gel. Durante los 240 min que duró la evaluación, la temperatura y la agitación se mantuvieron constantes a 37ºC y 50 rpm, respectivamente.
3.7.- Cinéticas de pérdida de viabilidad bacteriana.
Durante las cinéticas de pérdida de viabilidad bacteriana se simuló el paso de las células de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus libres e inmovilizadas a través del estómago e intestino delgado humano simulados in vitro, la duración de
la cinética fue de 4 h. Se simularon estos dos sitios de interés (estómago e intestino delgado), debido a que presentan condiciones fisicoquímicas agresivas para la viabilidad de las bacterias lácticas, pH muy ácido en estómago y presencia de bilis hepática en intestino delgado, específicamente en duodeno. Tales condiciones son de importancia por el efecto negativo que tienen sobre las bacterias lácticas, ya que pueden llegar a dañar a las células ocasionando incluso pérdida total antes de que éstas lleguen a su sitio de acción (colon).
Además de evaluar el efecto de las condiciones gastrointestinales arriba mencionadas, también se evaluó el efecto de diferentes muestras de alimento y bebidas sobre la viabilidad de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus libre e inmovilizado. Las muestras de alimento serán representativas de desayuno y comida tomando como base la alimentación mexicana, la muestra control consistirá de una solución de leche con almidón al 8% (p/v) estéril, en el cual estarán contenidas las células en forma libre e inmovilizada, según el caso.
La viabilidad bacteriana se determinó en UFC/mL y se reportó en porcentaje, tomando el 100% como la concentración de células inmovilizadas ó libres viables que existen en el tiempo cero de la cinética. Se estimó la velocidad de pérdida de viabilidad de las células inmovilizadas y libres para los diferentes tratamientos. Para tal fin, se graficaron los datos de viabilidad en porcentaje contra tiempo en minutos, a partir del gráfico resultante se calcularon las pendientes, las cuales son reportadas en UFC/ml-min de pérdida de viabilidad.
3.8.- Inmovilización celular por atrapamiento.
La biomasa se inmovilizó por atrapamiento celular (Figura 4) en alginato de sodio al 2% (p/v). Al término del proceso se tomó una muestra de células inmovilizadas (equivalente a 1 mL), mismas que fueron tratadas inicialmente con solución de citrato de sodio 0.1 M, a 40ºC y agitación con vortex para disolver la matriz de inmovilización y liberar las células. Posterior a esto, se hicieron diluciones
empleando tubos de ensaye con solución salina 0.9% (p/v) para determinar la viabilidad celular mediante la técnica de conteo en placa en medio MRS sólido.
Suspensión de soporte con biomasa
120 rpm Solución de CaCl2 0.3 M,
120 rpm Bomba peristáltica
Figura 4. Esquema de la técnica de inmovilización celular por atrapamiento. 3.9.-Determinación de viabilidad celular por conteo en placa.
En la Figura 5 se presenta el esquema del desarrollo de la técnica de conteo en placa, el procedimiento fue el siguiente: de una concentración de células se toma 1 mL de muestra y serealizaron diluciones de 10-1 a 10-6. De las diluciones 10-3 a 10-6, se tomaron alícuotas de 0.1 mL para sembrar por extensión en placa en medio sólido MRS. Posteriormente, las cajas de Petri se incubaron a 37ºC durante 48 h, al término de incubación se contaron las colonias y se reportaron como UFC/mL.
Figura 5. Esquema de la técnica de determinación de viabilidad por conteo en placa.
1 mL
Placas con medio MRS sólido Incubación 37ºC, 48 h 10 - 1 10 - 2 10 - 3 10 - 4 10 - 5 10 - 6 0.1 mL 0.1 mL 0.1 mL 0.1 mL 12 rpm
4.- RESULTADOS.
En este capítulo se presentan los resultados obtenidos relacionados con el desarrollo del sistema de simulación y aquellos sobre la pérdida de viabilidad de Lactobacillus delbrueckii libre e inmovilizado, y en ausencia o presencia de algún alimento tipo (yougurt simulado, como control, y alimentos tradicionales mexicanos y café negro), así como de la estabilidad del soporte de inmovilización.
4.1.- Pruebas de estabilidad del gel bajo condiciones gastrointestinales simuladas in vitro.
En el Cuadro 2 se presentan los resultados de la evaluación de la estabilidad del soporte de inmovilización (alginato de sodio al 2%) tratado bajo condiciones gastrointestinales simuladas in vitro.
Cuadro 2. Estabilidad del soporte (alginato de sodio 2%, diámetro de partícula 2 mm) en condiciones gastrointestinales simuladas in vitro.
CONDICIONES
OBSERVACIONES
Estómago in vitro
Jugo gástrico simulado: NaCl 0.5% (p/v); pepsina (3 g/L); mucina (4 g/L), pH 2.0, 90 min.
Diámetro inicial= 2.00 mm, diámetro final= 1.8. El soporte presentó ligero
debilitamiento.
Intestino delgado in vitro
Jugo pancreático simulado: NaCl 0.5% (p/v); pancreatina (1 g/L), mucina (4 g/L), bilis hepática
0.3% (p/v), pH 6.8, 150 min.
Diámetro inicial= 1.8 mm, diámetro final= 1.7 El soporte presentó ligero
debilitamiento pero sin deformación.
Nota: el pH se ajustó con solución de ácido clorhídrico 5 M y con hidróxido de sodio 1.5 N, la temperatura y agitación se mantuvieron constantes a 37ºC y 50 rpm respectivamente.
4.2.- Desarrollo del sistema de simulación gastrointestinal in vitro.
El sistema de simulación gastrointestinal in vitro desarrollado, fue instalado en una campana de flujo laminar del Laboratorio de Bioconversiones de la UPIBI. El sistema constó de 2 biorreactores de vidrio con capacidad de 500 mL enchaquetados, con tapa de vidrio desmontable que se sujeta con seguros tipo brida. Las tapas de los biorreactores cuentan con 2 entradas esmeriladas para adaptar conectores tipo “Y” para el suministro de las soluciones de HCl y NaOH; así mismo, cuentan con dos entradas esmeriladas más para la toma de muestra y para el electrodo de pH; por último tienen una quinta entrada con cuerda y sello de silicón para colocar el termómetro.
Los biorreactores están conectados en serie a un sistema de control de temperatura (baño de temperatura controlada) el cual los mantiene a 37ºC, temperatura fisiológica del organismo humano; así mismo, los biorreactores están colocados sobre parrillas para mantenerlos en agitación constante a 50 rpm. En el primer biorreactor se llevó a cabo la simulación de la estancia de células de Lactobacillus delbrueckii libres e inmovilizadas mezcladas con alimento en el estómago humano in vitro durante 90 minutos. Al término de este tiempo pasaron las células junto con la solución de jugo gástrico al segundo biorreactor, para simular in vitro la estancia de las mismas en el intestino delgado; a este biorreactor se le adaptó una manguera de silicón de 5 mm de diámetro interno para simular la peristalsis intestinal por medio de una bomba peristáltica y durante 150 minutos se simuló la estancia de las células libres e inmovilizadas.
El pH se controló manualmente durante toda la cinética (4 h), se verificó la temperatura y todo se llevó a cabo en condiciones de esterilidad (ver figura 6). La toma de muestra se realizó cada 30 min, se utilizó una pipeta automática de 1 mL y se realizaron diluciones para posteriormente sembrar en placa.
Figura 6. Sistema de simulación gastrointestinal in vitro para el estudio de la viabilidad de Lactobacillus delbrueckii.
4.3.- Resultados de las cinéticas de pérdida de viabilidad.
4.3.1.- Cinéticas de pérdida de viabilidad de Lactobacillus delbrueckii libre e inmovilizado tratado bajo condiciones gastrointestinales simuladas in vitro.
En el Cuadro 3 y la Figura 7 se presentan los resultados de viabilidad de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus libre e inmovilizado en alginato de sodio al 2% (p/v), tratado bajo condiciones gástricas in vitro (solución de NaCl 0.5% con pepsina 3% y mucina 4%, ajustando pH a 2.0) y condiciones intestinales in vitro (solución de NaCl 0.5% con pancreatina 1%, bilis 0.3% y mucina 4%, ajustando el pH a 6.8), ambos tratamientos en presencia de alimento testigo (solución de leche con almidón al 8%).
Las cinéticas de pérdida de viabilidad iniciaron con un 100% de células libres viables (1.27x109 UFC/mL) de Lactobacillus delbrueckii. Al término de la
evaluación en condiciones gástricas in vitro (minuto 90), el 40% (5.08x108 UFC/mL) de las células libres mantuvieron su viabilidad, esto es 1.3 veces menor viabilidad que las células inmovilizadas 52% (7.4x108 UFC/mL). Al finalizar el tratamiento en condiciones intestinales in vitro el 1.6% (2x107 UFC/mL) de las células libres mantuvieron su viabilidad, mientras que el 39% (5.5x108 UFC/mL) de las células inmovilizadas en alginato de sodio al 2% se mantuvieron viables, ello representa 24 veces mayor viabilidad respecto a las células en forma libre tratadas en las mismas condiciones in vitro.
0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 0 30 60 90 120 150 180 210 240 t iempo (min) Células libres Células inmovilizadas
*
Figura 7. Viabilidad de Lactobacillus delbrueckii libre e inmovilizado tratado en condiciones gastrointestinales humanas in vitro en presencia de alimento testigo.
Nota: n = 3, (*) indica que existen diferencias estadísticas significativas, Duncan (p<0.05).
Cuadro 3. Viabilidad de Lactobacillus delbrueckii libre e inmovilizado tratado en condiciones gastrointestinales humanas in vitro en presencia de alimento testigo.
Tiempo Cél. Libres Cél. Inmov h (%) (%) 0 100 + 0.0 100 + 0.0 30 68 + 5.4 90 + 9.1 60 56 + 3.0 63 + 8.9 90 40 + 2.7 52 + 3.9 120 9.8 + 0.9 48 + 6.2 150 5.7 +1.9 45 + 7.2 180 2.4 + 1.3 44 + 8.5 210 1.6 + 0.3 40 +10.7 240 1.6 + 0.3 39 +10.4
Cuadro 4. Velocidad de pérdida de viabilidad de células libres e inmovilizadas de Lactobacillus delbrueckii en condiciones gastrointestinales simuladas in vitro mezcladas con alimento testigo.
Tiempo (min) Células libres (%/min) Células inmovilizadas (%/min) 0-30 1.0797 0.3326 30-60 0.3934 0.8914 60-90 0.5357 0.3611 90-120 0.9968 0.1463 120-180 0.1228 0.0704 180-210 0.0283 0.1119
Los valores de velocidad estimados indicaron que las velocidades de pérdida de viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas en alginato de sodio al 2% fueron de 3 a 1.5 veces menores, comparados con los obtenidos para las células libres durante la etapa de simulación in vitro bajo condiciones gástricas simuladas. Al inicio de la etapa de simulación en condiciones intestinales in vitro, las velocidades de pérdida de viabilidad de las células inmovilizadas fue 7 veces menor respecto a las de células libres; durante los últimos 30 minutos de la cinética las células libres presentaron menor velocidad de pérdida de viabilidad que las células inmovilizadas (Cuadro 4).
En el Cuadro 5 y la Figura 8 se presentan los resultados de las cinéticas de pérdida de viabilidad de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus libre, obtenidos bajo condiciones gastrointestinales simuladas in vitro, en presencia de una muestra de comida (tortilla, pollo y picante), solución de café negro al 1% y como testigo solución de almidón al 8% (p/v).
Las cinéticas iniciaron en los tres casos con 100% de células libres viables. Al término de la etapa en condiciones gástricas (solución salina al 0.5% con mucina 4% y pepsina 3%, ajustada a pH 2.0) el 40% (5x108 UFC/mL) de las células libres
conservó su viabilidad, mientras que el 67% (8.45x108 UFC/mL) y el 80% (1.5x109 UFC/ml) de las células en presencia de café negro y chilaquiles respectivamente, se conservaron viables. Al finalizar el tratamiento en condiciones intestinales in vitro (solución de NaCl 0.5% con pancreatina 1%, bilis 0.3% y mucina 4%, ajustando el pH a 6.8), las células libres tratadas en presencia de café negro mantuvieron su viabilidad 3.5 veces mayor respecto a la muestra testigo. La viabilidad de células libres tratadas en presencia de muestra de chilaquiles (pollo, tortilla y picante) al final de la cinética fue 36.5 veces mayor que la viabilidad celular de la muestra testigo.
De acuerdo con los resultados obtenidos puede observarse que cuando se adicionó en el medio una muestra de alimento (tortilla, pollo y salsa), la viabilidad de Lactobacillus delbrueckii libre fue significativamente elevada respecto a la muestra testigo y en presencia de café negro al 1%. Dicho efecto puede atribuirse principalmente a la presencia del maíz contenido en la tortilla, puesto que se ha evidenciado que cereales como malta, cebada y trigo brindaron cierto efecto protector a las bacterias lácticas como Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri y Lactobacillus acidophilus cuando fueron tratadas en condiciones gastrointestinales simuladas in vitro. El efecto protector es debido a que los cereales tienen un alto contenido de vitaminas, minerales y fibra que actúa como prebiótico y estabiliza a estas bacterias minimizando la pérdida de viabilidad.
Cuadro 5. Viabilidad de Lactobacillus delbrueckii libre tratado en condiciones gastrointestinales humanas in vitro.
Tiempo Testigo Café negro Chilaquiles h (%) (%) (%) 0 100 + 0.0 100 + 00.0 100 + 0.0 30 68 + 5.0 86 + 18.0 91 + 6.0 60 56 + 3.0 72 + 16.0 85 + 7.0 90 40 + 3.0 67 + 17.0 80 + 11.0 120 10 + 1.0 39 + 11.0 76 + 9.0 150 6 + 2.0 11 + 07.0 76 + 9.0 180 2 + 1.0 9 + 07.0 75 + 9.0 210 2 + 0.0 7 + 04.0 75 + 9.0 240 2 + 0.0 7 + 03.0 73 + 11.0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 30 60 90 120 150 180 210 240 tiempo (min) Via b ilid a d (%) Testigo
Figura 8. Viabilidad de Lactobacillus delbrueckii libre tratado en condiciones gastrointestinales humanas in vitro en presencia de diferentes muestras de
alimento.
5.- CONCLUSIONES.
El sistema de simulación desarrollado en el presente proyecto fue más completo que los usados con anterioridad y permitió realizar cinéticas de pérdida de viabilidad bacteriana, más reproducibles que las anteriormente realizadas en proyectos de investigación precedentes. Dicho sistema contó con soluciones de mucina, pancreatina, bilis hepática y pepsina, lo que permitió contar con condiciones simuladas más cercanas a la realidad. Así mismo, los biorreactores diseñados exprofeso para el simulador permitieron un mejor control de la temperatura y la agitación de las soluciones y una operación facilitada del sistema de simulación.
El alginato de sodio presentó facilidad de manejo para inmovilizar las células de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, además presentó una ventaja importante ya que debido a su característica ionotrópica (gelifica únicamente en presencia de iones Ca2+) las bacterias no fueron expuestas a temperaturas elevadas que podrían afectar su viabilidad. Aunado a esto, el alginato de sodio no es tóxico para el ser humano y puede permitir la liberación de bacterias en el intestino humano.
Cuando Lactobacillus delbrueckii inmovilizado en alginato de sodio al 2% fue tratado en condiciones gástricas in vitro (pepsina a pH 2.0) e intestinales in vitro (pancreatina y bilis hepática pH 6.8) más agresivas, mantuvo mayor viabilidad respecto a las células en forma libre tratadas bajo las mismas condiciones.
Por lo anterior, se puede concluir que la técnica de inmovilización celular por atrapamiento en alginato de sodio, puede ser aplicada como vector probiótico, debido a su efecto protector de las células de Lactobacillus delbrueckii expuestas a condiciones agresivas, como son el pH ácido y la bilis hepática, en presencia de
enzimas como la pepsina y la pancreatina similares a las que se encuentran en el estómago e intestino delgado del ser humano, respectivamente.
El uso de prebióticos como la inulina en simbiosis con probióticos inmovilizados, representa un interesante campo de estudio y aplicación, debido al efecto evidenciado en el mantenimiento de viabilidad de células inmovilizadas. Por último, la técnica de inmovilización celular podría ser aplicada en la elaboración de alimentos funcionales destinados a remediar problemas de intolerancia a la lactosa y a la regeneración de la flora intestinal humana.
6.- IMPACTO.
El impacto del presente proyecto en el sector productivo puede llegar a ser importante en un futuro cercano, una vez que el desarrollo del simulador aquí presentado, basado en la inmovilización celular de bacterias lácticas probióticas, pueda ser utilizada para la validación de los alimentos lácteos funcionales existentes en el mercado. Además, el desarrollo del simulador y su validación con diversas bacterias lácticas probióticas puede tener un alto impacto social, en la medida que los resultados de los experimentos que se desarrollen en el simulador permitan emitir recomendaciones a los consumidores de alimentos probióticos sobre cómo y acompañado de qué tipo de alimentos es preferible consumir los alimentos lácteos funcionales; de tal forma que la mayor cantidad de microorganismos puedan sobrevivir a las condiciones fisicoquímicas existentes en el tracto gastrointestinal humano y tengan posibilidades de instalarse en el colon humano y ejercer su efecto probiótico.
