INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

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(2)

Manual para el Laboratorio de técnicas microbiológicas. UPIBI-IPN

Autoras: Juárez Juárez M., Pérez Sánchez R., Rodríguez Pascual P. 1

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA

ACADEMIA DE MICROBIOLOGÍA

MANUAL DE PRÁCTICAS PARA LA ASIGNATURA:

“LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS”

PRIMERA EDICIÓN

AUTORAS:

Q.B.P. MIRIAM JUÁREZ JUÁREZ Q.B.P. REFUGIA PÉREZ SÁNCHEZ BIOL. L. PATRICIA RODRÍGUEZ PASCUAL EDITORAS:

Q.B.P. MIRIAM JUÁREZ JUÁREZ M. EN C. GLORIA LÓPEZ JIMÉNEZ

(3)

PRÁCTICA No. 1: MICROSCOPÍA UNIDAD I: Normatividad en el laboratorio y microscopía

1. OBJETIVOS:

1.1 Objetivo general

• El alumno aprenderá a enfocar correctamente una preparación para ser observada en el microscopio compuesto, así como la forma correcta de utilizarlo

1.2 Objetivos específicos

• Utilizar correctamente el microscopio compuesto

• Realizar la técnica de iluminación de Köhler

• Observar preparaciones temporales en el microscopio compuesto 2.- INTRODUCCIÓN

El microscopio es un instrumento óptico que amplifica la imagen de un objeto pequeño. Mediante un sistema de lentes y fuentes de iluminación se puede hacer visible un objeto microscópico. Los microscopios pueden aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamaño original. Los diversos elementos que existen en la naturaleza, presentan tamaños, formas y composiciones distintas, la mayoría de ellas pueden verse, algunas a simple vista, y otras mediante instrumentos.

Para poder observar a la célula es necesario recurrir a equipos como el microscopio, de este existen diversas variedades, los cuales están diseñados a lo que pretendemos observar y como ejemplo tenemos a:

Microscopio óptico

Es un instrumento (de un lente o varios lentes), que amplifica una imagen y permite la observación de mayores detalles de los posibles a simple vista. El microscopio más simple es una lente de aumento o un par de anteojos.

El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos objetos separados estos deben estar como mínimo a esa distancia. El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina, para captar la información. La resolución depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor de la muestra, la calidad de la fijación y la intensidad de la coloración. Teóricamente la máxima resolución que se puede alcanzar es de 0,2 µm dada por una luz con longitud de onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible por el ojo humano) y con objetos condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el objetivo, pero no puede aumentar la resolución. Existen distintos microscopios ópticos generales y de investigación que se diferencian en factores tales como la longitud de onda de la iluminación, la alteración física de la luz que incide en la muestra y procesos analíticos que se aplican a la imagen final.

El microscopio compuesto esta formado por tres sistemas: 1. Sistema de iluminación; 2. Sistema óptico y 3.

Sistema mecánico.

El sistema de iluminación corresponde a la fuente de luz y sus aditamentos para iluminar eficazmente la preparación y esta formado principalmente por la lámpara (6V), el diafragma de campo y el condensador (lente frontal, diafragma de iris y lente auxiliar)

El sistema óptico esta formado por una serie de lentes de vidrio en los objetivos y oculares que permiten agrandar la imagen y esta formado por los objetivos, tubo y el ocular.

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El sistema mecánico esta formado por una serie de engranes y botones que permiten realizar el movimiento y cambio de las lentes así como el enfoque de la preparación y esta formado por la base, estativo, tornillos macrométrico y micrométrico, platina, revólver y portarevólver.

Función básica de cada parte del microscopio:

a.- Sistema mecánico

Base. Pieza metálica que sostiene a todo el aparato

Estativo. Lugar de donde se debe tomar para trasladar al microscopio

Platina. Es una plancha cuadrada y gruesa de metal con un orificio central en donde descansa la preparación, la cual es fijada por dos pequeñas pinzas, se puede mover hacia arriba y hacia abajo con los tornillos macrométrico y micrométrico por medio de un sistema de engranes. Posee escalas numéricas que permiten ubicar fácilmente la posición de lo que se observa y, al mismo tiempo, deslizar la preparación en forma de cruz (ejes X y Y) para su localización.

Pinzas. Sirve para sujetar al portaobjetos.

Tornillo macrométrico. Permite el enfoque mayor.

Tornillo micrométrico. Permite el enfoque con precisión.

Tubo del ocular. Sostiene el lente del ocular.

Revolver: Es un dispositivo giratorio en donde se atornillan las lentes de los objetivos de distinto aumento.

Tubo binocular. Cada uno de los tubos contiene en el interior un sistema de prismas y espejos que dividen el haz de luz en dos haces, cada uno de los cuales se envía por separado a cada tubo, estos tubos se deslizan hacia los lados para ajustar la distancia interpupilar ya que cada persona posee una diferente separación entre sus ojos. Los microscopios binoculares tienen entre los tubos una escala grabada para poder ajustar la distancia y cada persona debe memorizar su valor de apertura interpupilar; uno de los tubos tiene el ocular fijo y el otro tiene un sistema mecánico que sube o baja. Para realizar el enfoque de cada ojo primero se enfoca con el tornillo micrométrico el tubo que tiene el ocular fijo y después se enfoca el que tiene el ocular móvil, pero en este caso sin mover el tornillo micrométrico, girando el ocular móvil hasta encontrar el foco.

b.- Sistema de iluminación

Lámpara. Es la encargada de proporcionar los haces de luz y tiene las siguientes características: 6V, 5-15 W ó 12 V, 50-100 W

Diafragma de campo. Esta situada en la base del microscopio y su función es la de regular el diámetro de la emisión de la luz a fin de que se ilumine solo el área de campo visual, es decir controla la cantidad de luz que atraviesa la preparación.

Condensador. Es un sistema de tres lentes convergentes que concentran los rayos luminosos sobre el objeto a observar, el condensador utilizado es capaz de agrupar todos los rayos que provienen del foco y permite aprovechar toda la luz posible que inciden sobre él y los dirige hacia el plano focal del objeto.

c. Sistema óptico

Oculares

(5)

El ocular es la parte óptica final externa, situados en el tubo a través de los cuales se obtiene la imagen final, el ocular tiene aumento propio (los aumentos son denominados con la letra X), en nuestro caso es de 10X. El ocular consta de una lente cercana al ojo, collar, tubo del ocular y una lente cercana al objetivo.

Tubo

El tubo es la parte óptica – mecánica, situada en la parte superior del microscopio, este puede ser monocular o binocular, además esta adaptada para poderle colocar una cámara fotográfica ó una cámara de televisión. El tubo generalmente esta diseñado para trabajar a una distancia mecánica fija entre ellos y este valor puede ser de 160 mm, el factor del tubo del microscopio a utilizar en el laboratorio es de 1,25X, dato que nos sirve para calcular el aumento total.

Objetivos

Son lentes que captan la imagen a observar, están construidos de cristal o fluorita, poseen aumento propio, apertura numérica y esta diseñada para trabajar con diferentes campos. Todos los objetivos tienen anillos de colores y números grabados sobre el tubo metálico, que nos permite saber a detalle cuales son sus ventajas, la disposición de estos caracteres es la siguiente:

1.- El anillo de color superior indica los aumentos (Tabla 1) 2.- El lado superior izquierdo indica el número de aumentos 3.- El lado superior derecho la apertura numérica.

4.- El lado inferior la distancia mecánica

5.- El lado inferior derecho el espesor del cubreobjetos

6.- El anillo de color inferior indica en qué medio se hace la inmersión del objetivo (Tabla 2) En ocasiones el objetivo puede traer en lugar de 0.17, el número 1, el cual indica que:

Acepta cubreobjetos desde 0,17 a 0,22 mm de espesor, 10= No requiere cubreobjetos ó

0,11 – 0,27 = Es ajustable a diferentes espesores de los cubreobjetos, desde 0,11 mm hasta 0,27 mm.

Anillo superior

Los anillos de color cerca del anillo moleteado facilitan el reconocimiento del coeficiente de aumento:

Tabla 1. Correspondencia entre los aumentos y los anillos de colores

grabados

Aumentos Color anillo

superior

1.0X Negro

2.5 X Pardo

4.0 X Rojo

6.3 X Anaranjado

10 X Amarillo

16 X Verde claro

25 X Verde oscuro

40 X Azul claro

63 X Azul oscuro

100X Blanco

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Aumentos totales:

El número total de aumentos que se puede lograr en un microscopio se obtiene multiplicando el número de aumentos que tiene el ocular por el número de aumentos que tiene el tubo y por el número de aumentos que tiene el objetivo con el que se esta observando.

Distancia mecánica:

Se llama distancia mecánica a la distancia que recorre a luz por el interior del microscopio desde que penetra por el objetivo, pasando por los tubos y espejos, hasta llegar al ocular, la distancia mecánica se mide desde la superficie de la rosca del objetivo hasta la base del ocular, esta distancia en el caso de nuestro microscopio es de 160 mm.

Poder de resolución:

El poder de resolución de una lente se define como la capacidad que tiene para discernir entre dos puntos muy cercanos entre sí y que puedan verse separada.

El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm, el microscopio óptico de 0,2 µ y el microscopio electrónico de 6 Ángstrom.

Apertura numérica:

Es una medida de la amplitud del cono luminoso que se forma por las lentes del microscopio, ya sea del condensador o del objetivo.

Microscopio de contraste de fase

Permite observar células sin colorear y resulta especialmente útil para células vivas.

Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor índice de refracción experimenta una deflexión y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos ópticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porción fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste útil sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espécimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar células vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados.

La resolución de este microscopio no puede ser mejor que la del microscopio de campo oscuro porque emplea la misma fuente de longitud de onda, sin embargo puede detectar partículas individuales más pequeñas en las imágenes de campo oscuro, debido al contraste creado. Es útil para observar autorradiografías, cristales en la orina y para detectar espiroquetas en particular el Treponema pallidum microorganismo causante de la sífilis.

Cada uno de los microscopios tiene una función determinada, en este y en este caso este tipo de microscopio utiliza un microscopio auxiliar y un filtro verde, además en este tipo de microscopio también se realiza la técnica de iluminación de Köhler.

Tabla 2. Colores para el anillo inferior que indican en qué medio se debe hacer la inmersión del objetivo

Carácter Sustancia Índice de refracción Color del anillo

Oil Aceite 1,515 Negro

W Agua 1,333 Blanco

Glyz Glicerina 1,455 Anaranjado

Metileno Yoduro de metileno 1,740 Amarillo

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Fig. Diafragma de iris de un microscopio de contraste de fases, microscopio auxiliar y filtro verde 3. MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO

3.1 MATERIAL POR EQUIPO

• Microscopio compuesto

• Preparaciones fijas de bacterias

• Preparaciones en fresco de mohos

• Preparaciones en fresco de agua estancada

• Frasco con benzal

• Esponja

• Papel seda

• Lámpara de alcohol 3.2 REACTIVOS

• Aceite de inmersión

• Atomizador con benzal

3.3 MATERIAL QUE DEBE TRAER EL ALUMNO

• Una muestra de agua estancada

• Comida con mohos

• Colores

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL 4.1 Cuidado y limpieza del microscopio

Un proceso de limpieza debe considerar los siguientes aspectos:

a.- Para limpiar la parte óptica, se elimina primero las partículas de polvo, ya sea con un bulbo inyector de aire, un pincel o soplando fuertemente sobre la lente.

b.- Algunos solventes como la acetona disuelven los revestimientos de barniz, la pintura y aún el cemento de las molduras y los objetivos compuestos, por lo que no se deben usar.

c.- Las guías mecánicas deben mantenerse lubricadas.

Se enlistan algunos compuestos recomendados sólo para ciertas partes del microscopio.

a.- Espuma de jabón suave.- Solo para remover lo sucio de la superficie de instrumentos b.- Agua destilada con algún detergente sin aditivos alcalinos.- para un prelimpiado de la óptica.

c.- Solución para limpiar la óptica.- etanol al 40 %, éter al 20 %, para limpiar superficies de la óptica o remover residuos de aceite de inmersión.

4.2 TÉCNICA DE ILUMINACIÓN MÉTODO KÖHLER

A fin de evitar toda serie de inconvenientes y poder utilizar lámparas de filamento espirilado, Köhler propone un método que actualmente es utilizado. Su iluminación comporta dos diafragmas: un diafragma denominado de campo, situado generalmente a nivel de la lámpara colectora y un diafragma llamado de abertura, situado generalmente debajo del condensador.

Pasos a seguir para la iluminación de Köhler en un microscopio 1.- Luz amarilla (bajo voltaje)

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2.- Ajustar la distancia interpupilar 3.- Ajustar las dioptrías

4.- Abrir el diafragma de campo e iris

4.3 Observación de una preparación temporal

a.- Tomar un portaobjetos limpio y desengrasado con una torunda que contenga alcohol b.- Colocar una gota pequeña del agua estancada con una pipeta Pasteur

d.- Cubrir la preparación con el cubreobjetos

e.- Observar al microscopio de contraste de fases a 10 y 40 X

f.- Observar la preparación temporal realizada en el microscopio compuesto y comparar los resultados obtenidos g.- Realizar esquemas de las preparaciones observadas.

4.4 Observaciones de preparaciones fijas

a.- Tomar una preparación fija y enfocarla a 10 y 40 X.

b.- Adicionarle aceite de inmersión y observarlo a 100 X

c.- Observar la preparación que contiene una gran cantidad de muestra y realizar el esquema biológico d.- Ahora mover la preparación para enfocar la preparación con poca cantidad de muestra.

e.- Comparar ambas muestra y concluir

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5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO

5.1.- Imagen a color de la preparación en fresco de agua estancada con el microscopio óptico a 10X y 40X.

5.2.- Imagen a color de la preparación fija a 40X y 100X, Nombre del microorganismo, Forma y agrupación 5.3 Consulta la bibliografía y llena la siguiente tabla:

Tipo de microscopio Poder de resolución Aplicaciones Compuesto

Contraste de fase

Electrónico Estereoscópico

Fluorescencia Interferencia

Polarización

5.4 En la siguiente tabla resume la función de cada una de las siguientes partes:

Parte del microscopio Función Sistema al que pertenece:

(mecánico, óptico, iluminación) Condensador

Diafragma de campo Diafragma de iris Filtro azul Lámpara Objetivo Ocular Platina Revólver

Tornillo macrométrico Tornillo micrométrico

6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

6.1 Ventajas y desventajas de utilizar la iluminación de Köhler.

6.2 Ventajas y desventajas de un microscopio compuesto, con respecto a su uso, Tipo de preparación y cantidad de muestra utilizada

6.3 Tamaño de las imágenes observadas en cada aumento 7.- CONCLUSIONES

Elabora tus conclusiones tomando en consideración los objetivos de la práctica, los resultados obtenidos y la bibliografía consultada.

8.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

8.1 Barrera Escorcia Héctor El Microscopio Óptico 1ª edición. 1997. Editores Plaza y Valdez, S.A. de C.V.

8.2. Freifelder, D. Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular. Reverté Mexicana, S.A. de C.V. 1991. 139.

8.3 Locquin Marcel, Manual de Microscopía I 1° edición, 1985. Ed. Labor S.A.

8.4 Rincón-Sánchez A.R.y Reyes–Ortiz N. Manual de Microscopía Óptica 1ª edición. 1991. Editado por la Asociación de Químicos del Instituto Nacional de Nutrición, Secretaría de Salud., México..

(10)

9 Autoras: Juárez Juárez M., Pérez Sánchez R., Rodríguez Pascual P.

PRACTICA No. 2

PREPARACIONES FIJAS Y EN FRESCO

UNIDAD I: Normatividad en el laboratorio y microscopía.

TEMA: 1.3 Preparación de un frotis microbiano.

1.3.1 Preparaciones fijas 1.3.2 Preparaciones en fresco 1. OBJETIVOS

El alumno realizará preparaciones en fresco y fijas para ser observadas en el microscopio óptico por medio de tinciones.

I.2 Objetivo específicos

1.2.1 Realizar preparaciones en fresco y fijas de bacterias y mohos 1.2.2 Realizar tinciones simples, diferenciales y específicas.

1.2.3. Realizar esquemas coloridos de las observaciones a 40X y 100X 2. INTRODUCCIÓN

La gran mayoría de los microorganismos son invisibles para el ojo humano, por lo que el uso del microscopio resulta indispensable para observar a estos seres vivos. Para lograr una buena observación microscópica es necesario tomar en cuenta la preparación de la muestra, debido a que los objetos deben tener un cierto grado de contraste con el medio circundante para poder ser percibidos a través del microscopio, además de que los microorganismos carecen de una coloración natural, hay que teñirlos previamente para hacerlos resaltar de manera artificial del fondo de la imagen. Una forma de conseguir este contraste consiste en realizar tinciones simples con un colorante o tinción diferencial.

Tinción simple: En las tinciones simples se utiliza un solo colorante, que siempre es de tipo básico, se utiliza solamente para incrementar el contraste de la célula que absorberá el colorante y quedará teñido del mismo color.

Tinción diferencial: Se utilizan una combinación de colorantes para dar diversos complejos coloridos y como ejemplo tenemos la tinción de Gram y la tinción de Ziehl-Neelsen.

Tinciones específicas: Incrementan el contraste en las células microbianas y revelan estructuras particulares, entre las que se incluyen las endosporas, los flagelos y la cápsula. Estas técnicas se basan en la estructura que se desea poner de manifiesto tiene un grado de afinidad por los colores utilizados mayor que el resto de la célula.

Las bacterias no teñidas muestran pocos detalles morfológicos, el diagnóstico bacteriológico generalmente se basa en las diferentes afinidades tintoriales de las bacterias para identificarlos más adecuadamente, Sin embargo, también resultan útiles las preparaciones no teñidas en la determinación de la movilidad.

Las preparaciones fijas y teñidas son de uso casi universal, tanto a partir de especimenes recibidos como de colonias cultivadas. En general una muestra del espécimen original puede ser colocada directamente sobre el portaobjetos o bien ser recogida con una asa, recordando siempre tener una preparación delgada y homogénea.

Una colonia puede ser examinada haciendo con ella una suspensión tenue en una gota de solución salina, y luego extendiéndola con una asa sobre un portaobjetos. Las películas secadas al aire son fijadas con calor suave sobre la flama de un mechero y luego pasadas a través de ella. Debe tenerse cuidado para evitar el calor excesivo, que puede alterar la forma bacteriana. El calor deseable es aquel en el que el portaobjetos sea apenas caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano.

Aunque cuando tenemos la necesidad de observar preparaciones en fresco podemos utilizar el microscopio de contraste de fases, en donde la característica más importante de este tipo de microscopio es que nos permite ver a los microorganismos sin la necesidad de teñirlos.

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3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO 3.1 EQUIPO

• Microscopio óptico 3.2 MATERIAL

• Portaobjetos

• Cubreobjetos

• Pipeta pasteur

• Gradilla

• 1 tubo de ensaye de 13 X 100 mm

• Asa bacteriológica

• Frasco gotero con solución de cristal violeta

• Frasco gotero con solución de lugol

• Frasco gotero con solución de alcohol – acetona

• Frasco gotero con solución de safranina

• Frasco gotero con solución de fucsina fenicada

• Frasco gotero con solución de alcohol ácido

• Frasco gotero con solución de azul de metileno

• Frasco gotero con solución de verde de malaquita

• Solución salina o agua de la llave

• Mechero

• Asa y porta asa

• Puente de coloración

• Gradilla metálica

• Lámpara de alcohol 3.3 CEPAS MICROBIANAS

• Staphylococus aureus

• Escherichia coli

• Sacharomyces cerevisiae

• Mohos que se encuentren disponibles 3.4 REACTIVOS

• Atomizador con benzal

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL 4.1 Preparación de Frotis:

Método A

4.1.1 Limpiar el portaobjetos con una torunda de algodón y que contenga alcohol.

a.- Etiquetar la preparación, solo sobre la superficie superior del portaobjetos, la etiqueta será preferentemente pegada a la izquierda de la preparación, si con una etiqueta no basta colocar otra del lado derecho, la etiqueta llevará el nombre del microorganismos, el nombre de la tinción, el equipo, el grupo y la fecha.

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b) En la gradilla se tiene un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con 2 ml de agua, de ahí tomar con el asa una pequeña gota de agua y colocarla en el centro de la superficie de un portaobjetos.

c) En el mechero, flamear el asa al rojo vivo y en un radio de 20 cm de la flama del mechero, abrir el tubo de ensaye y flamearlo, tomar la muestra con el asa, volver a flamear la boca del tubo y taparlo. Dejar el tubo sobre la gradilla y con la mano izquierda tomar el portaobjetos y con la mano derecha en la que tenemos el asa extender el inoculo aproximadamente un cm²para obtener una película delgada de microorganismos. Flamear el asa para esterilizarla.

d) Dejar secar el frotis a temperatura ambiente.

d) Fijar el frotis con calor, es decir pasarlo rápidamente por la flama del mechero, luego colocarlo en el dorso de la mano, si soportamos el calor pasarlo nuevamente.. El calor deseable es aquel que soportamos en el dorso de la mano. Realizar esta operación una vez más Dejar enfriar el portaobjetos antes de teñir.

Nota: Procurar no tomar una gran cantidad del inóculo de lo contrario quedará un frotis grueso, la luz no pasará y no observaremos; en caso de haber ocurrido esto entonces, observa en la periferia del frotis

Método B

a) Si se proporciona un tubo con una suspensión bacteriana, entonces encender el mechero.

b) En un radio de 20 cm abrir el tubo, flamearlo y con el asa tomar un inóculo de la suspensión.

c) Flamear la boca del tubo de ensaye, cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla

d) Colocar el inóculo en el centro de un portaobjetos limpio. Extender el inóculo por lo menos 1 cm², y flamear el asa. Dejar secar el frotis y fijarlo al calor.

4.2 Examen en fresco de una muestra agua estancada

4.2.1 De la muestra de agua estancada que se ha traído al laboratorio, colocar una gota en un portaobjetos limpio

4.2.2 Con la ayuda de una pipeta Pasteur colocar en el centro una gota de la muestra y cubrirla con un cubreobjetos.

4.2.3 Al colocarle el cubreobjetos dejarlo caer con un movimiento rápido para evitar que se formen burbujas.

4.2.4 Observar al microscopio óptico o de contraste de fases con el objetivo de 10 X y 40 X.

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4.3 Preparación en fresco de un moho

4.3.1 Colocar una gota del colorante azul de algodón lactofenol 4.3.2 Colocar el inoculo y hacer una pequeña extensión 4.3.3 Colocarle el cubreobjetos sin realizar burbujas

4.3.4. Observar la preparación al microscopio con el objetivo 10X y 40X. Si se requiere que la preparación dure un poco más se sellar los bordes del cubreobjetos con barniz de uñas transparentes.

4.4 Tinción simple

a) Tomar la preparación fija de Staphylococcus aureus y colocarla el colorante que previamente les ha tocado b) Tomar el tiempo por 1 minuto

c) Enjuagar el portaobjetos en el recipiente que contiene el agua

d) Dejar secar la preparación y observarla al microscopio con el objetivo de 40 y 100 X.

4.5 Tinciones diferenciales 4.5.1 Tinción de Gram completa:

a) Colocar los frotis correspondiente de cada uno de los microorganismos Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus en el puente de coloración.

b) Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.

c) Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante.

d) Cubrir los frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto.

e) Lavar los frotis con agua de la llave.

f) Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante) durante 15 segundos.

g) Lavar inmediatamente con agua de la llave.

h) Cubrir los frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos i) Lavar los frotis con agua de la llave.

j) Dejar secar los frotis, colocar una gota de aceite de inmersión y observarlos al microscopio con el objetivo de 100X. (Previamente realizar la técnica de iluminación de Köhler y enfocar a 10 y 40X)

4.6 Tinción de Gram decolorada:

a) Colocar un frotis fijado de Bacillus subtilis y de Escherichia coli en el puente de coloración.

b) Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.

c) Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante.

d) Cubrir los frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto.

e) Lavar los frotis con agua de la llave.

(14)

h) Cubrir los frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos i) Lavar los frotis con agua de la llave.

j) Dejar secar los frotis, colocar una gota de aceite de inmersión y observarlos al microscopio con el objetivo de 100 X.

4.7 Tinción de Gram completa aplicada a una suspensión de microorganismos:

a) Colocar un frotis fijado de una mezcla de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

b) Cubrir el frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.

c) Lavar el frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante.

d) Cubrir el frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto.

e) Lavar el frotis con agua de la llave.

h) Cubrir el frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos i) Lavar el frotis con agua de la llave.

j) Dejar secar el frotis, colocar una gota de aceite de inmersión y observarlos al microscopio con el objetivo de 100 X.

4.8 Tinción de Ziehl-Neelsen.

a) Colocar el frotis correspondiente en el puente de coloración

b) Cubrir los frotis con fucsina-fenicada y calentar con una lámpara de alcohol, hasta que emita vapores, aplicar calor periódicamente durante cinco minutos sin que se seque la preparación y esperar a que se enfríe.

c) Enjuagar con agua de la llave.

d) Cubrir los frotis con alcohol ácido por un minuto.

e) Enjuagar con agua de la llave.

f) Cubrir los frotis con azul de metileno por un minuto

g) Enjuagar y dejar secar los frotis y observarlos con el microscopio utilizando lente de inmersión 4.9 Tinción específica

4.9.1 Tinción de Shaeffer–Fulton

a) Cubrir el frotis correspondiente con verde de malaquita y calentar con una lámpara de alcohol, hasta que emita vapores, aplicar calor periódicamente durante cinco minutos, sin que se seque la preparación.

b) Dejar que el frotis se enfríe.

c) Lavar con agua de la llave.

d) Cubrir el frotis con safranina por un minuto.

e) Enjuagar, dejar secar y observar con el microscopio utilizando lente de inmersión.

(15)

5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO

5.1 Realiza el esquema de la preparación en fresco del moho observado.

5.2 Realiza un esquema de lo observado en el microscopio en la siguiente tabla

5.3 ¿Cuales son los inconvenientes al realizar un frotis con una gran carga microbiana?

5.4 ¿Cual es la finalidad de observar una muestra en fresco?

5.5 ¿Por qué se coloca un cubreobjetos sobre la muestra?

5.6 ¿Cuál es el propósito de fijar los frotis?

5.7 ¿Cómo afecta la edad del cultivo en la técnica de Gram?

5.8 ¿Por qué la tinción de Gram no se emplea para teñir mohos?

5.9 ¿Cuando es recomendable utilizar una tinción simple y que colorante utilizarías?

5.10 ¿Cuál es la finalidad de utilizar el barniz de uñas en las preparaciones en fresco?

6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

6.1 Discutir las ventajas y desventajas de las preparaciones en fresco, preparaciones fijas y tipos de tinciones adecuadas para cada una de ellas.

7. CONCLUSIONES

7.1 Elaborar las conclusiones con base al análisis y discusión de las ventajas y desventajas en la realización de preparaciones en fresco y fijas, el fundamento de las tinciones diferenciales, comparando con la bibliografía consultada y los objetivos de la práctica.

8 BIBLIOGRAFÍA

8.1 Lymch, M.J.; S.S. Raphael: L. D. Mellor; D.D. Spare, M. J., Inwood. Métodos de Laboratorio. 2ª Edición.

Interamericana. México. 1140 pags.

Aumento Agua estancada

Tinción Simple

Tinción diferencial:

Gram completa

Tinción de Gram:

decoloración

Tinción de Ziehl-Neelsen

Tinción específica Shaeffer y Fulton 40X

100X

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Autoras: Juárez Juárez M., Pérez Sánchez R., Rodríguez Pascual P.

15 PRACTICA No. 3

ESTERILIZACIÓN UNIDAD II: Esterilización

TEMA: Agentes físicos. Calor húmedo, calor seco Filtración a través de membrana

Prueba de esterilidad (Método de la tira de papel impregnada con esporas) 1. OBJETIVOS

El alumno preparará material de uso en microbiología para su esterilización Utilizará el método adecuado de esterilización de acuerdo al tipo de material I.2 Objetivo específicos

Lavar el material a esterilizar para uso en el área microbiológica

Preparar el material de vidrio e instrumental para ser esterilizado por calor seco Preparar el material de vidrio e instrumental para ser esterilizado por calor húmedo Esterilizar el material previamente preparado, por calor seco y calor húmedo.

Realizar el proceso de filtración a través de membrana 2. INTRODUCCIÓN

La esterilización es un proceso que destruye o elimina los microorganismos. La esterilización se puede realizar a través de métodos físicos y químicos. Para seleccionar el más adecuado es necesario conocer la naturaleza del material, aunque algunos pueden tener varias formas de esterilización.

Métodos físicos Calor húmedo:

La aplicación de calor es el método más simple para esterilizar un material, a condición de que no sufra daño en sí mismo. Una temperatura de 100 °C matará a todas las formas vegetativas de Eubacterias, pero no las esporas ni a las Arqueobacterias extremófilas, para matar a estas es necesario una temperatura de 121 °C, 15 minutos y 15 libras de presión. La muerte microbiana se produce por la desnaturalización de las proteínas, generalmente se utiliza vapor, tanto porque las bacterias se mueren más rápidamente cuando se encuentran húmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas las partes del recipiente.

Calor seco:

Para esterilizar materiales que deben permanecer secos se dispone de hornos eléctricos por los que circula aire caliente, en vista de que el calor es menos eficaz en materiales secos, se aplica una temperatura de 160 –170

°C durante una h.

Para ambos tipos de calor aplicadas en los tiempos ya mencionados el calor actúa desnaturalizando las proteínas y los ácidos nucleicos de la célula y fragmentando las membranas celulares.

Incineración:

La llama es un agente esterilizador eficaz, y el más simple de todos. Es frecuentemente utilizado para esterilizar el asa bacteriológica para sembrar o resembrar un cultivo. Al flamear el asa, debe evitarse de ser posible, que dicha asa lleve grandes cantidades de material biológico, pues éste podría “saltar” diseminándose partículas infectantes.

A veces para instrumentos como tijeras, hojas de bisturí o pinzas, se puede esterilizar el material mojándolo con alcohol y encendiéndolo éste. Se debe repetir varias veces para lograr una esterilización completa. El método es rápido pero produce carbonización y pérdida del filo.

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16 Radiaciones ionizante y no ionizante:

La radiación ultravioleta provoca daño en el DNA, la luz ultravioleta induce el entrecruzamiento entre pirimidinas adyacentes en una u otra de las dos tiras de polinucleótidos, formando dímeros pirimidínicos, las radiaciones ionizantes producen roturas en las tiras sencillas y en las dobles.

Pueden emplearse también ondas supersónicas o ultrasónicas para romper o desintegrar a la célula.

Filtración a través de Membranas

Algunas sustancias no pueden ser esterilizadas por calor húmedo o seco pues son termolábiles, es decir que se desnaturalizan o que pierden alguna propiedad deseable, en tal caso se utilizan sistemas de filtración de membranas para retener a los microorganismos. Aquí debemos de conocer las dimensiones del microorganismo a eliminar para poder utilizar el filtro adecuado (diámetro).

Los filtros utilizados son fabricados con porcelana, cuarzo, tierra de diatomeas, vidrio pulverizado, asbesto o ésteres de celulosa, para la filtración a través de membrana, se utiliza como bioindicador a Pseudomonas diminuta para filtros con porosidad de 0.22 µm, como mínimo.

Métodos químicos

Gases (oxido de etileno) y líquidos (formaldehído y β propiolactona)

Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógeno lábiles como los que tiene grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos e hidroxilos. Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en la industria farmacéutica, sirve para esterilizar material termosensible como el plástico, equipos electrónicos, bombas cardiorrespiratorias. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo y además cancerigeno, por lo que se suministra normalmente con una concentración entre el 10 y el 20 % de CO2. La concentración de óxido de etileno, la humedad y la temperatura influyen sobre la velocidad de esterilización. Un objeto limpio puede esterilizarse si se trata de 5 a 8 h a 38 °C o de 3 a 4 h a 54°C, cuando la humedad relativa se mantiene entre el 40 y el 50 % y la concentración de óxido de etileno es de 700 mg/L. Una vez esterilizado el material es necesario airear para eliminar el óxido de etileno residual porque es muy tóxico.

La β-propiolactona se emplea para esterilizar vacunas y suero, se degrada hasta una forma inactiva después de varias h y, por ello, no es tan difícil de eliminar. Destruye a los microorganismos más rápidamente que el óxido de etileno, pero no penetra tan bien en los materiales y puede ser cancerígena.

Indicadores biológicos para el proceso de esterilización

En todo lugar en donde se realice esterilización se debe de contar con indicadores de calidad que manifiesten que la esterilización se ha llevado correctamente y que dicho material se encuentra estéril, para ello existen en el mercado varios indicadores que se introducen con el material a esterilizar y posteriormente se verifica un cambio de color o turbidez de la ampolleta.

Jeringas y portamembranas

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17 Método de la tira de papel

Las esporas de Geobacillus stearothermophilus.- En un proceso de esterilización por calor húmedo, se utilizan tres tiras impregnadas con las esporas del microorganismo, colocando una que se esteriliza previamente y servirá como control negativo; una tira sin esterilizar que fungirá como control positivo y una tira más se coloca en la muestra que se va a esterilizar. Una vez concluido el proceso de esterilización, cada tira se transfiere, bajo condiciones asépticas, a tubos con caldo de un medio enriquecido estéril y se incuban a 55 °C durante 7 días. Al término de la incubación, se observa si hay crecimiento en cada uno de los tubos. Si la tira control positivo no presenta crecimiento o si la tira control negativo presenta crecimiento, se invalida el proceso. Si hay crecimiento solamente en la tira que corresponde al seguimiento del proceso, este se realizó en condiciones incorrectas y no hubo esterilización. Si no hay crecimiento solamente en la tira control negativo y en la tira de la muestra, el proceso se realizó correctamente.

Método de la ampolleta:

Son ampolletas que contienen una suspensión de Geobacillus stearothermophilus en medio de cultivo con púrpura de bromocresol como indicador. Las ampolletas indicadoras se colocan entre el material que se va a esterilizar por calor húmedo. Al término del proceso de esterilización, las ampolletas (sin abrir) se incuban entre 55 y 65 °C durante 24 h, la turbidez y la aparición de un color amarillo indica un proceso de esterilización incorrecto. Al mismo tiempo se incuba una ampolleta sin esterilizar como control positivo, la cual debe mostrar desarrollo bacteriano y el medio se vuelve amarillo.

OTROS AGENTES ESTERILIZANTES:

Para instrumentos como hojas de bisturí, tijeras o pinzas, se esteriliza el material, impregnando con alcohol y poniéndolo a la flama hasta que se apague solo repitiendo el procedimiento tres veces. El método tiene la ventaja de ser rápido pero se produce carbonización y pérdida de filo.

Pueden emplearse ondas supersónicas o ultrasónicas de 9000 ciclos / s, para romper y desintegrar las células.

Se cree que las bacterias se dañan y destruyen por la formación de pequeñas burbujas de gas en la suspensión a consecuencia de las ondas sonoras.

NOTAS:

-Los tubos o frascos con tapa de baquelita, nunca deben cerrarse completamente.

-Si existe material que ha estado en contacto con cultivo de microorganismos, éste debe ser esterilizado en autoclave a 121 ^oC, 1,05 atm de presión durante 15 minutos

- Recolectar los desechos del material esterilizado en recipientes adecuados para darle una disposición final ambientalmente responsable.

3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO 3.1 EQUIPO

• Autoclave a 121° C

• Autoclave a 110 ° C

• Horno a 170 ° C

• Incubadora a 35° C

• Baño María a 55°C

Membranas con porosidad de 0,45 µm de diámetro.

• Termómetros de 150

• Termómetro de 200 °C

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21 3.2 MATERIAL

• Papel aluminio

• Papel Kraft

• Algodón

• 2 cajas de Petri

• 2 matraces de 125 ml

• 3 pipetas de 2, 5 y 10 mL

• Una pinza de disección

• Una tijera

• Una gradilla

• Un cilindro pipetero

• Un cilindro para cajas de Petri

• Un mechero Fisher

• Un vaso de precipitados de 100 ml

• 8 tiras de papel filtro

• Ligas

• Un sistema Millex–HA

• Un portamembranas de filtración

• Membranas de 0.45 micrones de porosidad

• Escobillones de diferentes tamaños

• Una esponja

• Un tubo de ensaye 13 X 100 estéril con caldo nutritivo

•

3.3 MEDIOS DE CULTIVO

• 4 tubos de 16 x 150 mm con 3 ml de caldo nutritivo

• 2 matraces con 20 ml de caldo nutritivo estéril

• 2 tubos de 113 X 100 con 3 ml de caldo nutritivo sin esterilizar 3.4 CEPAS MICROBIANAS

• Tiras controles de esporas

• Suspensión microbiana de Escherichia coli 3.5 REACTIVOS

• Agua destilada

• Caldo nutritivo

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL

PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN 4.1 Lavado de material de vidrio e instrumental

a).Utilizando escobillones para pipetas, tubos y matraces y una fibra suave para las cajas de Petri, el material plano y el instrumental metálico lavar el material que se va a esterilizar, utilizando detergentes aniónicos que no dejan residuos

b) Enjuagar suficientemente con agua de la llave

c) Enjuagar con agua destilada, escurrir y secar en el horno o dejarlos secar a temperatura ambiente.

4.2 PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO 4.2.1 TUBOS DE ENSAYO

a) Tapar 2 tubos de 16 x 150 mm con tapones de algodón siguiendo las indicaciones del profesor

b) Colocar los tubos en un bote de lámina, taparlos con papel Kraft y asegurarlos con una liga, anotar fecha, equipo, grupo, medida de los tubos y cantidad preparada.

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21 4.2.2 CAJAS DE PETRI

a) Envolver 8 cajas de Petri con papel Kraft siguiendo las indicaciones del profesor. Anotar en el papel, la cantidad de cajas envueltas, fecha, equipo, número de equipo de laboratorio y grupo.

4.2.3 PIPETAS

a) Colocar en la boquilla de cada una de las pipetas un tapón de algodón cuidando que no quede muy compactado, utilizar para ello una aguja de disección o un clip

b) Flamear en la flama del mechero las boquillas de las pipetas a fin de eliminar el exceso de algodón

c) Envolver de manera individual cada una de las pipetas con una tira de papel Kraft, fijar el extremo con masking-tape y anotar sobre el papel la capacidad de la pipeta, la fecha, el grupo y el número de equipo de laboratorio. Con una fecha indicar el sentido de la punta de la pipeta.

4.2.4 MATRACES

a) Colocar en la boca de cada matraz un tapón compacto de algodón, envuelto con gasa, siguiendo las instrucciones del profesor.

b) Con papel Kraft, elaborar un gorro ligeramente más grande que el tapón de algodón.

c) En una tira de Masking-tape anotar la fecha, grupo y equipo, adherir el Masking-tape al matraz. No anotar los datos sobre el gorro de papel.

4.2.5 PINZAS Y TIJERAS

a) Envolver con papel Kraft una pinza o tijera y con lápiz señalar con una flecha la punta.

b) Anotar en el papel la pieza de que se trate, la fecha, grupo y equipo.

4.2.6 PORTAMEMBRANAS Y MEMBRANAS DE 0.45 MICRONES DE POROSIDAD

a) Abrir el portamembranas, revisar que contenga el empaque y con la ayuda de pinzas, colocar una membrana de 0.45 micrones de porosidad, del diámetro adecuado al tamaño del portamembrana, cerrar adecuadamente, envolver en papel Kraft, siguiendo las instrucciones del profesor.

4.3 PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO 4.3.1 TUBOS DE ENSAYE

a) Colocar en 2 tubos de ensaye, una cubierta de papel aluminio y colocarlos en una canastilla metálica.

b) Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, grupo y equipo, sujetar el papel con masking-tape.

4.3.2 CAJAS DE PETRI

a) Colocar en el interior de un cilindro de acero inoxidable para cajas de Petri dos cajas en posición invertida perfectamente secas. (NUNCA ESTERILIZAR POR ESTE MÉTODO MATERIAL CONTAMINADO)

b) Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, el número de cajas que contiene el cilindro, el grupo y la fecha.

Colocar la tira de papel entre la tapa del cilindro.

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22 4.3.3 PIPETAS

a) Poner en la boquilla de cada una de las pipetas un tapón de algodón cuidando que no quede muy compactado.

b) Flamear las boquillas en la flama del mechero a fin de eliminar el exceso de algodón, antes colocar en el interior un poco de papel aluminio para evitar que las pipetas se despunten en el momento de introducirlas.

c) Colocar en el interior de un cilindro pipetero, las pipetas preparadas.

d) Anotar en una tira de papel Kraft la cantidad de pipetas, su capacidad, fecha, grupo y equipo. Fijar la tira entre la tapa del cilindro pipetero.

4.3.4 MATRACES

a) Colocar en la boca de un matraz de 125 ml una tapa de papel aluminio.

b) En una tira de papel Kraft anotar fecha, grupo y equipo. Fijar la tira al cuello del matraz sujetándolo con masking-tape o etiquetar con un marcador indeleble.

4.3.5 PINZAS Y TIJERAS

a) Envolver en papel aluminio una pinza o una tijera.

b) En una tira de masking-tape, anotar fecha, grupo y equipo. Fijar el masking-tape a la envoltura.

PRUEBAS DE ESTERILIDAD POR CALOR SECO Y CALOR HÚMEDO 4.4. REDUCCIÓN DE LA CARGA MICROBIANA

a) Preparar 2 tubos de ensaye de 13 X 100 mm con 3 ml de caldo nutritivo sin esterilizar y etiquetar cada uno de ellos como tubo 1 y 2. (Etiqueta con la siguiente información, grupo, equipo, temperatura efectuada y fecha) b) Colocar en el tubo 1, una tira de esporas de Geobacillus stearothermophilus, mantener el tubo número 1 sin esterilizar. (Testigo positivo)

c) En el segundo tubo de ensaye sin esterilizar y que contiene el caldo nutritivo, colocarle una tira de esporas de Geobacillus stearothermophilus, tapar el tubo con un tapón de algodón, y someterlo a una temperatura de 110

°C durante 10 minutos y una presión de 10 lb/pulg

d) Un tercer tubo con 3 ml de caldo nutritivo estéril será nuestro testigo negativo en toda la práctica

e) Incubar los tres tubos a 55 ^oC ± 2°C durante 5 días en baño maría y observar diariamente durante el tiempo señalado. Anotar en la bitácora de laboratorio cualquier cambio en cuanto a la aparición de turbidez.

4.5 ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO

a) Preparar un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con 3 ml de caldo nutritivo estéril y etiquetarlo.

b) Colocar en el tubo una tira de esporas de Geobacillus sthearothermophilus, tapar el tubo con un tapón de algodón y esterilizarlo a 121 °C, 15 min y 15 lb.

c) Los tubos del punto 4.4 inciso b y d son los testigos positivo y negativo respectivamente.

e) Incubar el tubo a 55 ^oC ± 2°C durante 5 días en baño maría y observar diariamente. Anotar en la bitácora de laboratorio cualquier cambio en cuanto a la aparición de turbidez.

NOTAS: Consideraciones importantes para llevar a cabo el proceso de esterilización adecuado:

-Tener cuidado de eliminar todo el aire del autoclave.

-Colocar agua suficiente hasta el nivel de la rejilla o en la marca de la autoclave vertical

-Cuando se caliente la olla observar que no salga vapor por la tapa, en caso de suceder cambiar el empaque.

-Si se esta utilizando la autoclave vertical utilizar agua destilada.

-Observar que el manómetro registre la presión

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23 4.6 ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

a) Precalentar el horno a 170°C, colocar el material preparado para esterilizar y esperar que la temperatura se vuelva a ajustar a 170 ^oC, en este momento empezar a contar el tiempo de 1 h.

b) En un tubo de ensaye sin esterilizar y vacío, colocar una tira de papel filtro que contenga esporas de Bacillus subtilis var. niger, cubrir la boca del tubo con papel aluminio y colocarlo junto con el material indicado en el inciso a. Esterilizar a 170 ^oC durante 1 h. En caso de que no se te proporcione la tira impregnada con esporas introduce una ampolleta que ya contenga el papel filtro impregnada con esporas, etiqueta el tubo con los datos correspondientes de preferencia con un marcador indeleble.

c) Los tubos del punto 4.4 inciso b y d son los testigos

d) Después de transcurrido el tiempo de esterilización, apagar el horno y esperar a que el termómetro indique la temperatura ambiente. Abrir, retirar el material y el tubo de ensaye con la tira de esporas.

e) Con ayuda de la pinza estéril (flamear con alcohol) y bajo condiciones asépticas, colocar la tira de papel filtro conteniendo las esporas de Bacillus subtilis a un tubo de ensaye que contenga 3 mL de caldo nutritivo estéril y etiquetado. Incubar a 55 ± 2 ^oC durante 24 – 48 h. Observar diario y anotar cualquier cambio en cuanto a la aparición de turbidez. (esto se hará extraclase)

NOTA:-Registrar en su cuaderno de notas la temperatura y el tiempo de esterilización

Características de las tiras impregnadas con esporas (uso a nivel industrial).

1.- Colocar estratégicamente las ampolletas No. 1 (12 por m³) y operar el sistema de esterilización.

2.- Una vez concluido el proceso de esterilización, transferir bajo condiciones asépticas,la tira con esporas a la ampolleta No. 2, cortándole en la parte cintada.

3.- Incubar las ampolletas No. 2 de 35 a 37 ^oC durante 24 –48 h.

Testigo positivo.- Sin haber sido esterilizada incubar una tira de esporas con las condiciones anteriores Interpretación

Ampolletas con desarrollo.-Proceso de esterilización inadecuado Ampolletas sin desarrollo.- Proceso de esterilización adecuado Testigo positivo.- Deberá mostrar desarrollo

La ampolleta tiene un disco con esporas de Bacillus subtilis (niger) con no menos de 5 X 10⁵ esporas.

4.7 PROCESO DE FILTRACIÓN A TRAVÉS DE MEMBRANA a) Colocar 1 ml de la sustancia a filtrar en una jeringa desechable

b) Bajo condiciones asépticas, ensamblar la jeringa al portamembrana con la membrana previamente esterilizada

c) Filtrar gota a gota y recibir el filtrado en un tubo de ensaye estéril.

d) Transferir la membrana con la ayuda de una pinza estéril, a un tubo que contiene 3 mL de caldo nutritivo estéril

d) Incubar el filtrado y el tubo que contiene la membrana, a 35 ± 2 ^oC de 48 a 72 h.

e) Colocar la jeringa en un bote de lámina para su esterilización.

d) Observar diariamente y anotar en el cuaderno de notas del laboratorio cualquier cambio en cuanto a la aparición de turbidez durante 3 días.

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24 NOTAS:-El bioindicador utilizado en los procesos por filtración a través de membrana es Pseudomonas diminuta, para membranas con un diámetro de poro de 0,22 µm

5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO

5.1 Completa el siguiente cuadro indicando presencia o ausencia de turbidez.

Método Reducción de la carga

microbiana (110°C/10/´10lb)

Calor seco 170°C/2 h

Calor húmedo 121°C/15´/15lb

Filtración a través de membrana Testigo -

Testigo +

Resultado

5.2 ¿Cuál es la finalidad de utilizar agua destilada en el enjuagado del material?

5.3 Explicar porqué utilizamos un tapón de algodón en las pipetas, en matraces y tubos de ensaye 5.4. ¿Porque utilizamos el papel Kraft para envolver el material?

5.5 Anota 3 ejemplos de materiales que se esterilicen por calor seco, húmedo y por filtración

5.6 Qué concluyes si al término de la incubación: se observa que la tira control positivo no presenta crecimiento, la tira control negativo presenta crecimiento y en la tira de la muestra, no hay crecimiento.

6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

6.1 Discutir cuales son los inconvenientes o riesgos de preparar el material con papel aluminio y papel Kraf para su esterilización por calor seco y húmedo.

7. CONCLUSIONES

7.1 Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de estos, así como a la bibliografía consultada y los objetivos de la práctica.

8. BIBLIOGRAFÍA

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25 PRACTICA No.4

NUTRICIÓN Y CULTIVO MICROBIANO UNIDAD: III. Nutrición y Cultivo Microbiano

TEMA: 3.1 Formulación de medios de cultivo 3.2 Agar, fuentes de carbono y nitrógeno 3.3 Preparación de medios de cultivo

3.4 Cultivo de microorganismos 1.- OBJETIVOS

1.1 Objetivo General.

• El alumno cultivará microorganismos en los diferentes medios de cultivo, previa preparación y clasificación con base a sus componentes, uso y consistencia.

Objetivos específicos

• Determinar las especificaciones mínimas que deben tener los medios de cultivo para microorganismos en general de acuerdo a la NOM-065-SSA1-1993

• Preparar y clasificar diversos medios de cultivo en base a sus componentes, complejidad, uso y consistencia.

• Cultivar bacterias y hongos en placa y tubo e identificar los requerimientos nutricionales de estos microorganismos.

2.- INTRODUCCIÓN

Las células están formadas por grandes cantidades de pequeñas moléculas como agua, iones inorgánicos, carbohidratos y aminoácidos y contienen un número todavía más pequeño de moléculas grandes, los polímeros de las células, siendo los más importantes las proteínas y los ácidos nucleicos. La célula puede obtener la mayoría de las moléculas pequeñas de su medio ambiente de manera preformada, mientras que las grandes moléculas son sintetizadas dentro de ellas. Existen complejas interrelaciones entre los compuestos incorporados por la célula y los que son sintetizados.

Nutrición.

A las sustancias en el medio ambiente utilizadas por los organismos para el catabolismo y el anabolismo se les llama nutrientes, y pueden dividirse en dos clases:

(1) nutrientes necesarios, sin los cuales la célula no podría crecer, y

(2) nutrientes útiles pero no indispensables, que se emplean si están presentes pero no son esenciales.

Algunos nutrientes son los “ladrillos” a partir de los cuales las células forman las macromoléculas y otras estructuras, mientras que otros nutrientes sirven solo para la obtención de energía sin ser incorporados directamente en las sustancias celulares, aunque en ocasiones un nutriente puede desempeñar ambas funciones. Las sustancias pueden dividirse en dos grupos: macronutrientes y micronutrientes, dependiendo de si son necesarios en cantidades grandes o pequeñas respectivamente y factores de crecimiento como compuestos orgánicos, vitaminas, ácidos orgánicos etc. Es fácil detectar cuando se requiere un macronutriente, simplemente porque se necesita en gran proporción. Frecuentemente los micronutrientes son necesarios en cantidades tan pequeñas que es imposible determinar cuánto se requiere; muchas veces ni siquiera se sospecha que un micronutriente esté presente en el medio en que un microorganismo está creciendo, debido a que los componentes del medio pueden contener tales micronutrientes en pequeña cantidad como contaminantes.

(25)

26 Los microorganismos se desarrollan a partir de sustancias nutritivas que se obtienen del medio que las rodea. En el laboratorio los microorganismos se desarrollan en medios de cultivo que contienen los nutrimentos adecuados para cada uno y requeridos para la síntesis de sus constituyentes celulares, además estos medios proporcionan las condiciones de pH, osmolaridad y humedad que le permiten un buen crecimiento.

Existe una gran diversidad de sustancias que pueden utilizarse en la preparación de medios de cultivo, formulado con un fin específico, y el cual deberá contener:

• Fuente de carbono

• Fuente de nitrógeno

• Fuente de azufre

• Factores de crecimiento (que actúan como cofactores, oligoelementos como aminoácidos o vitaminas que no pueden sintetizar)

• Fuente de enriquecimiento para microorganismos exigentes (huevo, sangre, suero etc).

• Inhibidores de crecimiento microbiano como los colorantes, sales biliares, detergentes, antibióticos o metales pesados.

• Indicadores de potencial oxido-reducción.

• Agar como el agente gelificante o soporte.

Medios de cultivo: Según la NOM-065-SSA-1993. Que establece las especificaciones sanitarias de los medios de cultivo.Generalidades.

Medios selectivos.

Son medios que contienen sustancias que impiden el desarrollo de algunos microorganismos, pero en una flora mixta permiten el aislamiento y recuperación del germen o grupo de gérmenes de interés.

Medios selectivos de enriquecimiento.

Son medios líquidos que estimulan la multiplicación de algún germen determinado e impiden o inhiben la reproducción de otros.

Medios diferenciales.

Son aquellos que contienen indicadores de ácido base, redox o sustancias que detectan cambios en el medio o en las características típicas de las colonias.

Medios para cultivar gérmenes anaeróbicos.

Son medios de cultivo para aquellos gérmenes que requieran condiciones de anaerobiosis o de microaerofilia.

Medios de transporte.

Sirven para transportar los especímenes que contienen a los microorganismos, del sitio de la toma del producto hasta el laboratorio donde va a efectuarse el estudio.

Estos medios impiden que se altere la proporción original de la flora microbiana en los especímenes.

Medios para filtración a través de membrana.

Pueden ser líquidos o sólidos. En el primer caso, se preparan a la concentración usual y permiten el crecimiento de microorganismos presentes en la membrana.

Los medios sólidos tienen un contenido mínimo de agar para favorecer la difusión de nutrientes del medio de la membrana.

Medios especiales para cultivo de hongos y levaduras.

En el caso de los hongos, el medio de cultivo descrito por Sabouraud es el que más se utiliza, ya que tiene un pH de 5.6 lo que inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias. Este medio puede ser más selectivo al adicionarle ciertos antibióticos tales como: cloranfenicol, eritromicina o gentamicina; para eliminar los hongos filamentosos de rápido crecimiento se adiciona cicloheximida (este medio se llama mycosel o micobiótico). Se emplea también el medio de agar papa y dextrosa para promover la esporulación de hongos filamentos y para recuento, se acidifica con

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27 ácido tartárico al 0.1 M hasta un pH de 4.5 El agar rosa de bengala se emplea para inhibir el crecimiento radial de hongos con micelio cenocítico.

Otros medios de cultivo que pueden ser utilizados son los siguientes:

Medios especiales para cultivo de protozoarios.

Medios de cultivo para medir la potencia de los antibióticos.

En la formulación de un medio de cultivo deben considerarse, no sólo el tipo de microorganismo, sino también el tipo de muestra que se va a analizar, y el objetivo final que se persiga: aislamiento, recuento o identificación.

Por otro lado, es de suma importancia los cuidados que deben observarse en la preparación de los medios de cultivo como son:

a. La calidad del agua utilizada (que se prefiere libre de sales)

b. Los materiales y utensilios que deben encontrase en condiciones de limpieza (libres de otras sustancias o reactivos que interfieran en la formulación original)

c. Si se debe añadir calor y cuánto para no incurrir en problemas de homogeneidad, desnaturalización, caramelización o pérdida de actividad nutricional.

d) pH final del medio que deberá ajustarse según indicaciones del fabricante o fórmula estandarizada.

e) Esterilidad del medio de cultivo de acuerdo a indicaciones del fabricante si es una formulación comercial, o en otras condiciones si los componentes lo requieren.

Cultivo microbiano.

Los microorganismos obtenidos a partir de suelo, aire, alimentos, etcétera se encuentran asociados, y en raras ocasiones se encontrará un solo tipo de microorganismo. A partir del cultivo inicial de una muestra, se encontrará una variedad de tipos de colonias y posteriormente se pretenderá lograr un cultivo puro. Un cultivo puro es aquel que está constituido por microorganismos de la misma especie. El cultivo de microorganismos se puede realizar en medio sólido, en medio semisólido y en medio líquido.

Se conoce como cultivo en medio sólido al que se hace en una caja Petri con el medio de cultivo gelificado (agar).

Las variantes del cultivo en caja son diversas pero todas se centran en la formación de estrías sobre la superficie del medio de cultivo con el asa en el caso de bacterias y por punto si se trata de hongos filamentosos.

Las siembras en tubos con medio sólido, por lo general se emplean para la conservación de un cultivo proveniente de una placa.

Existen dos variedades de cultivo en tubo:

a) Por estrías: se utilizan los medios de cultivo inclinados, se toma una muestra de alguna colonia inclinada y en forma recta, se toma la colonia y se arrastra el asa en forma zigzagueante en el medio por la superficie inclinada del agar.

b) Por picadura: se utilizan los medios de cultivo en un tubo solidificado ó semisólido en forma inclinada y en forma recta, se toma la colonia y se introduce en el medio picándolo longitudinalmente.

La siembra en tubos de cultivo en medio líquido se realiza tomado el inóculo con el asa y se introduce en el medio líquido agitando suavemente el asa.

a) Desarrollo en medio sólido inclinado. Se siembran los microorganismos por estría en tubos con agar inclinado

b) Desarrollo en medio líquido. Las características que se observan en el cultivo son:

turbidez, un sedimento, una película superficial, o combinados.

c) Desarrollo en medio semisólido por picadura hasta ¾ partes del tubo

Cabe señalar que la identificación de microorganismos por el estudio de sus características de cultivo es solo parcial ya que se requiere otras pruebas bioquímicas, fiosiológicas e inmunológicas.

Mediante la evaluación de las características de las colonias descritas y la acción en el medio, se puede hacer una identificación preliminar de los diferentes microorganismos aislados en un cultivo primario. Estas características son

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28 útiles para seleccionar otros medios y pruebas diferenciales apropiadas para completar la identificación de los microorganismos.

3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS 3.1 MATERIAL POR GRUPO

Sesión I

Sesión II

♦ Incubadora a 28° C

♦ Incubadora a 37° C 3.2 MATERIAL POR EQUIPO Sesión I

1 mechero Fisher

● 1 espátula

● 6 matraz Erlenmeyer de 250 mL

● 7 tubos de ensaye de 16 x 150 mm

● 2 matraces de 125 mL

● 6 cajas Petri

5 tubos de ensaye de 13 x 100 mm

● 1 gradilla metálica

● 1 probeta de 100 mL

● 1 termómetro

● 1 pipeta de 10 mL Sesión II

♦ 3 tubos con 3 ml de medio SIM

♦ 3 cajas con agar EMB

♦ 3 tubos con agar PDA

♦ 3 tubos con agar nutritivo

♦ 3 cajas con agar nutritivo

♦ 1 matraz con 150 ml de caldo glucosa sales

♦ 1 matraz con 150 ml de caldo nutritivo

3.3 REACTIVOS

150 mL de caldo glucosa sales

● 100 mL de agar nutritivo

● 75 mL de agar EMB

● 25 mL de PDA

● 25 mL de medio SIM

● Glucosa

(NH4) 2SO4

● K2HPO4

● MgSO4 7H2O

● MnSO4 4H2O

● 6 g de agar bacteriológico

● Agua destilada 3.4 CEPAS

Escherichia coli Bacillus sp.

Penicillum sp.

Aspergillus sp.

Balanza granataria

● Autoclave

● Horno 170° C

● Potenciómetro

Algodón

● Gasa

● Papel Kraft

● Refrigerador