UNIVERSIDAD REGIONAL AUTÓNOMA DE LOS ANDES UNIANDES
FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS
PROGRAMA MAESTRÍA EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL GRADO ACADÉMICO DE MAGÍSTER EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA
TEMA:
EFECTO IN VITRO ANTIMICROBIANO DE LA ALBAHACA (OCIMUM BASILICUM) SOBRE ESTREPTOCOCCUS MUTANS.
AUTORA: Q.F MORÁN SEVILLANO DENISSE XIOMARA TUTORES: OÑA CISNEROS FABIAN DAVID, BME MSC PHD(C). VITERI RODRIGUEZ JUAN ALBERTO, MD MSC
APROBACIÓN DE LOS ASESORES DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
CERTIFICACIÓN:
Quienes suscribimos, legalmente CERTIFICA QUE: El presente Trabajo de Titulación realizado por la Q.F Morán Sevillano Denisse Xiomara, estudiante del Programa de Maestría en Farmacia Clínica y Hospitalaria, Facultad de
Ciencias Médicas, con el tema “EFECTO IN VITRO ANTIMICROBIANO DE LA
ALBAHACA(OCIMUM BASILICUM) SOBRE ESTREPTOCOCCUS MUTANS”, ha sido prolijamente revisado, y cumple con todos los requisitos establecidos en
la normativa pertinente de la Universidad Regional Autónoma de los Andes
-UNIANDES-, por lo que apruebo su presentación.
Ambato, abril del 2018
_______________________________ _______________________________
DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD
Yo, Q.F Denisse Xiomara Morán Sevillano, estudiante del Programa de Maestría de Farmacia Clínica y Hospitalaria, Facultad de Ciencias Médicas,
declaro que todos los resultados obtenidos en el presente trabajo de
investigación, previo a la obtención del grado académico de MAGÍSTER EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA, son absolutamente originales, auténticos y personales; a excepción de las citas, por lo que son de mi exclusiva
responsabilidad.
Ambato, abril 2018
______________________________
Q.F. Denisse Xiomara Morán Sevillano
CI. 1205072901
DERECHOS DE LA AUTORA
Yo, Q.F Denisse Xiomara Morán Sevillano, declaro que conozco y acepto la
disposición constante en el literal d) del Art. 85 del Estatuto de la Universidad
Regional Autónoma de los Andes, que en su parte pertinente dice: El patrimonio
de la UNIANDES está constituido por:” La propiedad intelectual sobre las
Investigaciones, trabajos científicos o técnicos, proyectos profesionales y
consultoría que se realicen en la Universidad o por cuenta de ella;
Ambato, abril 2018
_______________________________
Q.F. Denisse Xiomara Morán Sevillano
CI. 1205072901
RESUMEN
La especie Acimut basilicón (albahaca) se ha utilizado en medicina tradicional
para tratar dolores de cabeza, trastornos renales y parásitos intestinales.
Además, se han incoado estudios de la actividad de sus extractos frente a
microorganismos. El presente estudio evalúa la actividad bactericida y/o
bacteriostática del extracto bruto de etanol obtenido de O. basilicón frente a la
bacteria cariogénica Streptococcus mutans, mediante la técnica de difusión en
agar Mueller Hinton-Sangre. Se evaluaron tres concentraciones del extracto
bruto etanólico al 25%, 50%, 75% y 100% en un cultivo in vitro sobre una cepa
de S. mutans por sextuplicado. Se realizó la lectura de los halos de inhibición
(HI) a las 18 horas de incubada la muestra y se encontró que los extractos brutos
etanólicos de Albahaca presentaron actividad antimicrobiana contra S. mutans
(25%, HI promedio= 6.9mm; 50% HI promedio= 7.0mm: 75% HI promedio=
10.5mm; 100% HI promedio= 12.6mm) de forma proporcional a la concentración
del extracto. En relación al control positivo (Amoxicilina) se evidencio que el
porcentaje del efecto inhibitorio se estableció en 76.8%. Todos los efectos
inhibitorios fueron menores al mostrado por el control positivo. En conclusión,
existe un efecto bactericida mostrado por el extracto bruto etanólico de O.
basilicum frente a S. mutans que es proporcional a su concentración, pero inferior
al antibiótico usado como control positivo.
Palabras clave: Ocimum basilicum, Streptococcus mutans, actividad
ABSTRACT
The species Acimut basilicón (basil) has been used in the traditional medicine to
treat headaches, renal disorder, an intestinal parasite. Furthermore, some
studies have been carried out regarding the activity of its extract before some
microorganisms. The present study evaluates the extract bacteria activity taken
from the Ethanol before the cariogenic bacteria Streptococcus mutans, through
the diffusion technique agar Mueller Hinton-Sangre. Three ethanolic extracts
were analyzed in a range of 25%, 50%, 75% y 100% in vitro tests of the S. mutans
strain.
The reading of the halos of inhibition (H1) after 18 hours of the incubated sample
was taken and it was found that the gross ethanolic extracts of basil presented
antimicrobial activity against S. mutans (25%, Hl mean = 50% Hl 6.9mm; mean
= 9.0mm: 75% HI mean=10.5mm; 100% Hl mean=12.6mm) in proportion to the
concentration of the extract. In relation to the positive control (Amoxicillin) showed
that the percentage of the inhibitory effect was established in 76.8%. All the
inhibitory effects were lower than shown by the positive control. In conclusion,
there is a bactericidal effect shown by the ethanolic crude extract of O. basificum
against S. mutans that is proportional to its concentration, but less than the
antibiotic used as a positive control.
INDICE GENERAL
1. INTRODUCCIÓN ... 1
1.1. ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACIÓN ... 1
1.2. SITUACIÓN PROBLÉMICA ... 3
1.3. PROBLEMA CIENTÍFICO ... 3
1.4. OBJETO DE INVESTIGACIÓN ... 3
1.5. CAMPO DE ACCIÓN ... 3
1.6. IDENTIFICACIÓN DE LA LÍNEA DE INVESTIGACIÓN... 4
1.7. OBJETIVO GENERAL ... 4
1.8. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 4
1.9. IDEA A DEFENDER ... 4
1.10. JUSTIFICACIÓN DEL TEMA ... 4
1.11. BREVE EXPLICACIÓN DE LA METODOLOGÍA INVESTIGATIVA A EMPLEAR ... 5
1.12. PARA EL PRESENTE ESTUDIO SE HAN EVALUADO LAS SIGUIENTES VARIABLES CATEGORIZADAS: ... 6
1.13. ESQUEMAS DE CONTENIDOS ... 6
1.14. APORTE TEÓRICO ... 8
1.15. SIGNIFICACIÓN PRÁCTICA ... 8
1.16. NOVEDAD CIENTÍFICA ... 9
2. CAPITULO I. MARCO TEÓRICO ... 10
2.1. ENFERMEDADES DENTALES Y BUCALES ... 10
2.1.1. Definición ... 10
2.1.2. Placa Bacteriana... 10
2.1.3. Caries ... 10
2.1.4. Agentes Etiológicos ... 10
2.2. MICROORGANISMOS DE IMPORTANCIA CLÍNICA EN PATOLOGÍAS BUCODENTALES. ... 13
2.2.1. Streptococcus mutans ... 13
2.4. ACTIVIDAD BACTERICIDA DE ACEITES ESENCIALES DE ESPECIES VEGETALES
18
2.4.1. Generalidades de Ocimun basilicum (Albahaca) ... 18
2.5. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN EN FITOQUÍMICA ... 19
2.5.1. Extracción sólido-líquido ... 20
2.5.2. Maceración ... 20
2.5.3. Percolación o lixiviación ... 21
2.5.4. Extracción líquido-líquido ... 21
2.6. CONCLUSIONES PARCIALES ... 21
3. CAPITULO II. MARCO METODOLÓGICO ... 23
3.1. DESCRIPCIÓN DE LOS PROCEDIMIENTOS METODOLÓGICO PARA EL DESARROLLO DE LA INVESTIGACIÓN ... 23
3.2. OPERACIONES PREVIAS ... 23
3.2.1. Limpieza. ... 23
3.2.2. Preparación de la muestra ... 23
3.2.3. Parámetros Físico - Químicos ... 23
Cenizas Totales en Agua ... 24
3.3. OBTENCIÓN DE EXTRACTOS Y ACEITE ESENCIAL DE OCIMUN BASILICUM... 25
3.4. AUTENTICACIÓN DE LA ESPECIE DE PLANTA VASCULAR ... 26
3.5. EXTRACTO ETÉREO. ... 26
3.6. EXTRACTO ETANÓLICO ... 26
3.7. DESTILACIÓN POR ARRASTRE DE VAPOR ... 26
3.8. ESTUDIO ETNOFARMACOLÓGICO DE PLANTAS MEDICINALES ... 26
3.9.ESTUDIO MICROBIOLÓGICO. ... 27
3.9.1. Selección de la cepa bacteriana ... 27
3.9.2. Ensayos de actividad bactericida in vitro. ... 28
3.9.3. Diluciones del extracto etanólico al 75% ... 29
3.9.4. Propuesta de Análisis Estadístico ... 29
3.10.ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS ... 30
3.10.1. Datos Obtenidos del estudio bactericida ... 30
3.10.2. Análisis estadístico de los datos obtenidos ... 30
4. CAPITULO III. MARCO PROPOSITIVO... 36
4.1. DISCUSIÓN Y ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS ALCANZADOS EN EL ESTUDIO . 36
5. CONCLUSIONES ... 39 6. RECOMENDACIONES ... 40 7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1 1. INTRODUCCIÓN
1.1. Antecedentes de la Investigación
Los aceites esenciales son mezclas de componentes volátiles, productos del
metabolismo secundario de las plantas, compuestos en su mayor parte por
hidrocarburos de la serie polimetilénica del grupo de los terpenos que
corresponden a la fórmula (C6H8)n, junto con otros compuestos casi siempre
oxigenados que otorgan el aroma que los caracteriza (1). Los extractos de
plantas medicinales han sido utilizados por el hombre desde la antigüedad para
la cura de múltiples dolencias. Se obtienen mediante la separación de porciones
biológicamente activas presentes en los tejidos de plantas, con el uso de un
solvente (alcohol, agua, mezcla de estos u otro solvente selectivo) y un proceso
de extracción adecuado (2)(3).
Ciertas especias como la pimienta negra, roja y jengibre son inhibidores de
microorganismos; siendo más efectivas frente a organismos Gram-positivos, que
frente a Gram-negativos. La función conservadora se debe tanto a los aceites
esenciales como a las oleorresinas que poseen, en cuya composición presentan
compuestos tipo eugenol o aldehído cinámico con poder antimicrobiano.
Ocimum basilicum es una planta de la familia Labiatae que está compuesta por
30 especies, de crecimiento espontáneo y que se cultiva en regiones
subtropicales y tropicales. El potencial antimicrobiano y antioxidante de extractos
y aceites esenciales de plantas aromáticas y medicinales es utilizado con el fin
de controlar patógenos causantes de enfermedades en humanos, animales y
vegetales(4) (5). Muchas estirpes de albahaca (Ocimum basilicum) producen
aceites volátiles que contienen esencialmente sólo uno o dos compuestos
fenilpropanos específicos(6). En los aceites esenciales de estas especies se han
encontrado compuestos biológicamente activos que han presentado actividad
alelopática, antibacterial, antioxidante, nematicidal, antistática, antifúngica, entre
2
El Aceite Esencial proveniente de las hojas de O. basilicum obtenido por
hidrodestilación, se utilizó para determinar la actividad antibacteriana utilizando
cepas de Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,
Salmonella enteritidis y Staphylococcus aureus. Las bacterias gram positivas (B.
subtilis y S. aureus), fueron las más susceptibles al Aceite Esencial (9). La
especie Ocimum basilicum L., al ser sometida a Cromatografía de Gases
acoplada a espectrometría de masas, reporta altos contenidos de fenilpropanos
y monoterpenos oxigenados con potencial terapéutico tales como: p-eugenol, E-
Z cinamato de metilo, eucaliptol y linalool; estudios farmacognósicos previos
indican que estos compuestos se caracterizan por presentar actividad
antimicrobiana. Estudios farmacognósicos en cepas Gram positivas de B. subtilis
y S. aureus presentaron mayor afectación frente al aceite esencial de albahaca.
Del mismo modo, ensayos in vitro del extracto hidroalcohólico de O. basilicum
en concentraciones del 10% y 15% mostraron un efecto bactericida significativo
frente a una cepa de Actinomyces viscosus(10).
La caries dental es una enfermedad crónica infecciosa transmisible muy común
en la niñez. El desarrollo temprano de la caries dental infantil es generalmente
causado por la presencia del Streptococcus mutans. Esta bacteria metaboliza el
azúcar y produce sustancias ácidas que desmineralizan la estructura del diente.
El S. mutans ha sido encontrado en lactantes antes de que tengan su primer
diente, en todas las superficies de la boca, especialmente en los surcos de la
lengua y la mucosa oral. La transmisión vertical del S. mutans de madre a hijo/a
es la causa de una colonización temprana, la cual se convierte en un alto riesgo
para el desarrollo de la caries dental en estos niños.
El aceite esencial y extracto etanólico de albahaca merecen una especial
atención para determinar su efecto en cepas de bacterias en las que aún no ha
sido probada su efectividad; profundizando de este modo su estudio y de esa
forma dejar las bases para posteriores investigaciones dentro del campo de la
3 1.2. Situación Problémica
El microorganismo S. mutans es considerado el más cariogénico de todos los
estreptococos orales(11). Es capaz de colonizar la superficie dental y producir
grandes cantidades de polisacáridos extra e intercelulares, además es también
altamente acidogénico y acidúrico, metaboliza diversas glicoproteínas salivales
y es responsable de la fase inicial de formación de la placa dental (biofilm) y
caries(12). Muchos productos han sido utilizados para controlar la caries dental,
tales como fluoruro, clorhexidina, y sus asociaciones (13). Sin embargo, los
productos naturales han contribuido significativamente al descubrimiento de
estructuras químicas para crear nuevos medicamentos a ser utilizados como
opciones terapéuticas innovadores o complemento a tratamientos actuales
contra patologías bucodentales (14)(15). Es así, que resulta necesario el estudio
fitoquímico de aceites esenciales y sus correspondientes extractos con la
finalidad de ofrecer una alternativa terapéutica a patologías bucodentales
altamente incidentes en la población en general y particularmente en niños y
adultos mayores.
1.3. Problema Científico
¿Cuál será el efecto antimicrobiano del extracto etanólico de la albahaca contra
Streptococcus mutans?
1.4. Objeto de Investigación
Actividad antimicrobiana del extracto bruto de etanol de Ocimum basilicum
(Albahaca).
1.5. Campo de Acción
Actividad antimicrobiana del extracto bruto de etanol de Ocimum basilicum
4
1.6. Identificación de la Línea de Investigación
Avances en nuevas tecnologías médicas: Microbiología y Farmacología Médica.
1.7. Objetivo General
Evaluar el efecto antimicrobiano in vitro del extracto bruto etanólico de Ocimum
basilicum (Albahaca) sobre un cultivo de Streptococcus mutans en agar Mueller
Hinton-Sangre.
1.8. Objetivos Específicos
• Extraer el extracto bruto etanólico a partir del follaje de Ocimum basilicum
(Albahaca).
• Caracterizar parámetros botánicos y físico-químicos de Ocimum
basilicum.
• Medir la actividad bactericida de una serie de diluciones de extracto bruto etanólico de Ocimum basilicum a través de un ensayo in vitro sobre un
cultivo de Streptococcus mutans.
1.9. Idea a Defender
El extracto bruto etanólico de Ocimum basilicum presenta actividad bactericida
contra Streptococcus mutans.
1.10. Justificación del tema
A pesar de las muchas terapias antifúngicas disponibles, las infecciones por
Streptococcus mutans muestran altas tasas de incidencia, especialmente en
individuos inmunocomprometidos. Además, tales terapias tienen muchos efectos
colaterales desagradables. Por lo tanto, es importante descubrir nuevos agentes
antifúngicos derivados de productos naturales. El objetivo de este estudio fue
investigar la actividad bactericida del extracto crudo de etanol de Ocimum
5
complementar las existentes a través de la sinergia de moléculas para el
tratamiento.
1.11. Breve explicación de la metodología investigativa a emplear
Este trabajo de investigación será realizado bajo la modalidad cuali-cuantitativa
de tipo descriptiva y exploratoria, aplicando el método hipotético deductivo como
guía en la descripción del método científico. Finalmente, el análisis de resultados
será desarrollado con métodos estadísticos que permitirán establecer la
discusión final. En lo referente a la Recolección de espécimen vegetal, para el
presente estudio la recolección de la especie vegetal (Ocimum Basilicum) se
llevó a cabo en mercados populares del norte de la ciudad de Guayaquil. Se adquirieron 5 “atados” de albahaca (ocimun basilicum) con un peso en seco de
aproximadamente 1000 gramos. Los criterios de inclusión y exclusión llevados a
cabo fueron los siguientes:
• Inclusión: hojas frescas, adultas, verdes brillante.
• Exclusión: hojas negras, con daños de putrefacción, hojas quemadas por el sol.
En lo que respecta a las pruebas analíticas, se establece que todas las pruebas
se trabajaron por triplicado. Se llevarán a cabo análisis de humedad, cenizas
totales, cenizas totales en agua y cenizas totales en ácido clorhídrico. En lo
referente a la preparación y obtención de extractos, estos se obtendrán mediante
la separación de porciones biológicamente activas presentes en los tejidos de
las plantas, con el uso de un solvente (alcohol, agua, mezcla de estos u otro
solvente selectivo) y un proceso de extracción descrito anteriormente (5). Para
el extracto etéreo se pesarán aproximadamente 24 gramos del espécimen, se
molerá y se procederá al proceso de macerado con 200 mL de éter etílico por 48
horas. El extracto etanólico se lo obtendrá por maceración con etanol al 75%
6
1.12. Para el presente estudio se han evaluado las siguientes variables categorizadas:
Variable Independiente: Concentración de extracto bruto etanólico de Ocimum
Basilicum (4%, 5% y 15%).
Variable Dependiente: Efecto antimicrobiano in vitro del extracto bruto
etanólico de Ocimum Basilicum frente a Streptococcus mutans.
1.13. Esquemas de Contenidos
Capítulo I. Marco Teórico
1. Enfermedades dentales y bucales
1.1. Definición
1.2. Placa Bacteriana
1.3. Caries
1.4. Agentes etiológicos
1.4.1. Candidiasis Oral (muguet)
1.4.2. Gingivitis No Complicada
1.4.3. Gingivitis ulcerosa aguda necrosante
1.4.4. Estomatitis herpética/herpes labial (calentura)
1.4.5. Úlceras orales
1.4.6. Periodontitis
2. Microorganismos de Importancia Clínica en Patologías Bucodentales
2.1. Streptococcus mutans
2.1.1. Características Generales
7
3. Actividad bactericida de aceites esenciales de especies vegetales.
3.1. Generalidades de Ocimun basilicum (Albahaca)
3.1.1. Taxonomía y Morfología
3.1.2. Uso Medicinal
4. Métodos de extracción fitoquímica de extractos
4.1. Extracción sólido-líquido
4.2. Maceración
4.3. Percolación o lixiviación
4.4. Extracción líquido-líquido
5. Conclusiones del capítulo
5.1. Conclusiones parciales generadas
Capítulo II. Marco Metodológico
1. Descripción de los procedimientos metodológico para el desarrollo de la investigación.
1.1. Operaciones Previas
1.1.1. Limpieza
1.1.2. Preparación de la muestra
1.2. Parámetros Físico - Químicos
1.2.1. Medición de Humedad
1.2.2. Medición de Cenizas Totales
1.2.3. Medición de Cenizas Totales en Agua
1.2.4. Medición de Cenizas Totales en Ácido Clorhídrico
1.3. Obtención de extractos y aceite esencial de Ocimun basilicum
1.4. Estudio microbiológico
1.4.1. Selección de cepa bacteriana
1.4.2. Ensayos de actividad bactericida in vitro
1.4.3. Propuesta de análisis estadístico
8
2.1. Datos obtenidos del estudio bactericida
2.2. Análisis estadísitico de los datos obtenidos
3. Conclusiones del capítulo
3.1. Conclusiones parciales generadas
Capítulo III. Marco Propositivo
1. Discusión y análisis de los resultados alcanzados en el estudio Conclusiones
Recomendaciones
Referencias Bibliográficas Anexos
1.14. Aporte Teórico
Mediante una adecuada recolección y acondicionamiento de la materia prima
vegetal, una destilación de vapor permitirá obtener un extracto esencial, cuya
pureza será evaluada tanto químicamente como en su efecto antimicrobiano. En
la presente investigación se harán estudios previos de esta planta en lo que
respecta a desarrollo de fitofármacos; considerando incluso de que buena parte
de la población está en riesgo de ser atacada por infecciones, entre estas las
caries dentales de los Streptococcus mutans vinculados a esta patología.
1.15. Significación Práctica
El efecto bacteriostático y/o bactericida del extracto etanólico de albahaca contra
la cepa Estreptococcus mutans; demuestra el uso de los metabolitos
secundarios de la planta en el tratamiento natural de enfermedades bucales.
Exponiéndose en esta investigación un procedimiento sencillo y reproducible en
la obtención de los compuestos terpénicos de las hojas de albahaca, en forma
9
posteriores de desarrollo de fitofármacos ya que la efectividad de la sustancia en
estudio ha sido demostrada in vitro. Esta investigación servirá como un aporte a
la sociedad para la prevención y pronta identificación de patologías de cavidades
bucales frente a este patógeno.
1.16. Novedad Científica
El extracto etanólico de Albahaca ha sido utilizado en estudios microbiológicos
con cepas de Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,
Salmonella enteritidis y Staphylococcus aureus, con fines alimenticios; el
presente estudio busca evaluar el comportamiento del Streptococcus mutans
frente a los metabolitos del extracto etanólico de la albahaca desde el punto de
vista farmacológico y junto con una posterior divulgación de las bondades
terapéuticas busca aportar al desarrollo farmacológico nacional, un futuro
10 2. CAPITULO I. MARCO TEÓRICO
2.1. Enfermedades dentales y bucales
2.1.1. Definición
Se refiere al conjunto de enfermedades manifestadas anatómicamente entre los
labios y la orofaringe, incluye patologías como la placa bacteriana (precursor la
gran mayoría de las patologías dentarias), caries dental, gingivitis, estomatitis
hasta la peligrosa periodontitis(16).
2.1.2. Placa Bacteriana
Capa que se forma en la superficie de los dientes, compuesta de saliva, restos
alimenticios y bacterias, que favorece la aparición de las caries entre otras
patologías bucales (16).
2.1.3. Caries
Es el resultado de la desmineralización del diente producto de la exposición
prolongada a la placa bacteriana (17). Clínicamente en su fase inicial, se
presenta como una mancha blanca y opaca en la superficie del diente. En su
fase final, la mancha inicial avanza en su proceso de desmineralización del
diente, provocando la pérdida de su estructura y generando una cavidad(17).
2.1.4. Agentes Etiológicos
Candidiasis oral (muguet)
Es una enfermedad micótica oportunista causada por cualquier especie del
género Cándida, prevalente en la actualidad, en la que es importante evaluar la
progresión del patógeno en el transcurso de la enfermedad(18). La candidiasis
es una enfermedad cosmopolita muy frecuente y una de las micosis más
11
ambos sexos y a todos los grupos etarios de forma similar aunque son más
frecuentes en los niños de cero a 5 años y en adultos mayores(18). El principal
agente causal de la candidiasis bucal es el hongo diploide asexual Candida
albicans; sin embargo, se pueden encontrar otras especies como Candida
dubliniensis, Candida glabrata, Candida famata, Candida krusei, Candida.
lusitaniae, Candida parapsilosis y Candida tropicalis(18).
La Cándida tiene numerosas moléculas en su superficie responsables de que se
adhiera al huésped entre las que se encuentran: 1) Un receptor homólogo de la
integrina humana CR-3, que se une con los grupos arginina-glicina-ácido
aspártico (RGD) de C3bi, fibrinógeno, fibronectina y laminina; 2) Una lectina que
se une con los azúcares de las células epiteliales; y 3) Proteínas con manosa
que se unen con las moléculas similares a lectina de las células epiteliales (18).
Otros factores de virulencia son las aspartil proteasas, que participan en la
invasión tisular al degradar las proteínas de la matriz extracelular, y una
adenosina secretada que bloquea la producción de radicales de oxígeno en los
neutrófilos y su desgranulación(18).
La sintomatología de la candidiasis es variable y generalmente mínima, desde la
asintomatología hasta cuadros de disgeusia o sensación urente de variada
intensidad(18). Se considera forma aguda aquella lesión de corta duración y que
desaparece con tratamiento (generalmente entre los 6 y 8 días). La presentación
aguda consta de dos formas, una pseudomembranosa (muguet) y una forma
eritematosa (lengua dolorosa antibiótica) de larga evolución(18).
Gingivitis No Complicada
La Gingivitis es la enfermedad gingival más común en niños sobre todo a partir
de los cinco años de edad hacia adelante. Esta patología es causada por una
placa bacteriana organizada, proliferante y patogénica, en la que se observan
cambios en el color, forma y textura(19). Se produce inflamación gingival, sin
pérdida detectable de hueso alveolar ni de inserción de encía adherida(19). Se
12
se involucra la dieta, higiene oral, anatomía dental, materia alba y tiempo de
exposición(19).
Gingivitis ulcerosa aguda necrosante
La gingivitis es una entidad patológica de tipo infeccioso que se caracteriza por
la existencia de colonización bacteriana del aparato de inserción, la cual
desencadena cambios de tipo inflamatorio. Esta colonización es a través de una
bio-película que está constituida por glicoproteínas salivales(20). Se caracteriza
por la ausencia de signos prodrómicos con aparición súbita que cursa con dolor,
inflamación y sangrado gingival; el signo principal que es considerado
generalmente como signo patognomónico de la enfermedad es la ulceración y
necrosis de las papilas interdentales con aparición de cráteres gingivales(21). El
estrés es el factor desencadenante principal y más destacado. Se ha demostrado
que durante los periodos de incremento de estrés se produce una respuesta
adrenocortical aumentada como mecanismo adaptativo. La liberación por parte
del hipotálamo de cortitropina hace que ésta actúe sobre la glándula adrenal
liberando corticoesteroides que regularán la respuesta inmune bloqueando la
interleucina 1 y 6 así como el factor de necrosis tumoral (TNF) de las células
inmunocompetentes. Esta supresión de la respuesta inflamatoria se traduce
también en un decrecimiento del nivel de fagocitos y agentes humorales con baja
producción de anticuerpos y disminución de la capacidad digestiva de los
macrófagos(21). Es así que la estimulación de la liberación de adrenalina en la
glándula adrenal y de norepinefrina por el sistema nervioso simpático, disminuye
el fluido sanguíneo circulante en la encía y también la posible llegada de
elementos protectores frente a la infección(21).
Úlceras orales
Las úlceras orales son una solución de continuidad en el epitelio de la mucosa
oral, signo que puede obedecer a distintos procesos patológicos. Su diagnóstico
y su tratamiento son, en ocasiones, una tarea difícil y suele corresponder a
13
Se han mencionado numerosas causas y factores asociados que podrían jugar
un rol en la génesis de estas lesiones. Entre ellas, destacan alteraciones
inmunológicas, infecciones, déficit nutricional, traumatismo repetitivo de la
mucosa oral, alergia alimentaria y de contacto, enfermedades autoinmunes y
neoplasias, junto con factores psiquiátricos y genéticos(23).
2.2. Microorganismos de Importancia Clínica en Patologías Bucodentales.
2.2.1. Streptococcus mutans
El microorganismo Streptococcus mutans es uno de los microorganismos
cariogénicos asociados a la caries dental de acuerdo con la hipótesis de la placa
ecológica, la caries dental es la consecuencia de cambios en el balance natural
de la microflora de la placa dental causados por la alteración de homeostasis
microbiana oral. El estudio de su participación en la colonización de tejidos
dentales, implantación e interacción con otros microrganismos es de mucha
importancia para la comprensión de la dinámica de las biopelículas dentales(24).
En los referente a la morfología, Streptococcus mutans es un estreptococo
α-hemolítico, que se visualiza como bacilo cuando se aísla de un medio con pH
ácido y como un cocobacilo cuando se sub-cultiva en un medio neutro o alcalino
(25). Su reproducción se caracteriza por ser asexual y binaria (26); su
clasificación se divide en los serotipos c,e,f y k, basado en la composición
química de polisacáridos específicos. Aproximadamente del 70 al 80% de cepas
encontradas en una cavidad oral son clasificadas como serotipo c, seguidos de
e (aproximadamente 20%), f y k (menos de 5% cada uno)(27).
S. mutans, generalmente conocido como el mayor patógeno en caries dental, es
también un posible agente causal de bacteremia y endocarditis infecciosa. El
riesgo de un individuo a presentar caries es variable en el tiempo dependiendo
del momento de la vida, donde a su vez, varía la epidemiología según la
población estudiada. Se han descrito como principales factores de riesgo la
composición y flujo salival, el número de bacterias cariogénicas, la exposición a
14
y factores genéticos(28). Otros factores que han sido relacionados con un mayor
riesgo de caries es el acceso a la atención dental, uso de sellantes de puntos y
fisuras, presencia de aparatos ortodóncicos o restauraciones dentales
defectuosas(28). En el caso de los niños con caries de inicio precoz, la historia
de caries de su madre y cercanos, refleja la importancia en la adquisición de
microorganismos relacionados en el proceso de caries a partir de la familia y
cómo las conductas del entorno donde se desarrolla el niño favorecen la
aparición de lesiones(28). Estudios que han usado metodologías que permiten
la fenotipificación y/o genotipificación sugieren que la madre es la principal fuente
de infección en niños portadores de S. mutans y que la saliva es el vehículo
principal para esta transferencia(28).
La formación de la biopelícula dental y su sistema de autoinducción son
fundamentales en la vida bacteriana de S. mutans. La superficie dental es un
hábitat natural indispensable para S. mutans y el tropismo por la biopelícula
dental se refleja en sus mecanismos de adaptación mediante la síntesis de
glucanos, fijar compuestos e instaurar un medio ácido. La competitividad por este
nicho ecológico está en relación con un sistema de regulación de un proceso
denominado Respuesta de Tolerancia al Ácido (RTA) dependiente de la
densidad celular. Este proceso de RTA forma parte de los sistemas de
señalización de quorum sensing desarrollado por algunas bacterias al formar la
biopelícula y S. mutans ha evolucionado para que su desarrollo, sobrevivencia y
persistencia en la cavidad oral dependa de su crecimiento en biopelícula y de la
densidad celular que alcance en ella(24).
La evidencia indica que una forma importante de transmisión de S. mutans
durante los primeros años de vida es la que se produce de madre a hijo por
contacto directo (transmisión vertical), mientras que el contacto con otros
familiares, incluidos el padre, los hermanos y demás posibles cuidadores
constituye otra vía de transmisión (transmisión horizontal) que cobra importancia
durante edades posteriores. Una característica importante de S. mutans es la
persistencia de sus genotipos en la cavidad oral de adultos, adolescentes y niños
mayores de cinco años. Este fenómeno es conocido como persistencia
15
hospedador y la relación con la expresión de características fenotípicas que les
pueden dar ventajas para la supervivencia, como la capacidad de formar
biopelículas, de adherirse y soportar fluctuaciones del pH. Se ha considerado
comúnmente que la colonización de la cavidad oral de los niños por S.
mutans (ventana de infección) ocurre al producirse la erupción del primer diente,
es decir, alrededor de los seis meses de edad. Sin embargo, es lógico pensar
que en niños expuestos a factores que facilitan los procesos de transmisión
promueva la colonización antes de la aparición de los primeros dientes. Hay dos
factores que sugieren que S. mutans pueda aparecer durante la etapa predental:
1) Streptococcus mutans y Streptococcus sobrinus son capaces de colonizar
superficies mucosas. 2) Algunos niños desarrollan lesiones de caries poco
después de la erupción dental. La colonización temprana de la cavidad oral
(antes de la erupción dental) por S. mutans puede aumentar el riesgo de caries
y hacer que su desarrollo se produzca a edades más tempranas(24).
Se ha aceptado que las glucosiltransferasas (Gtfs) de S. mutans desempeñan
papeles críticos en el desarrollo de la placa dental virulenta. Las Gtfs se absorben
para producir glucanos in situ sobre el esmalte, proporcionando los sitios para la
colonización por microorganismos y una matriz insoluble para la formación de la
placa (24).
S. mutans tiene la capacidad de adherirse a superficies, establecer uniones con
otros estreptococos y con bacterias de otras especies. Muchas cepas de S.
mutans se aglutinan (adherencia homóloga) por la adición de dextranos de alto
peso molecular. También se ha reportado que ciertas cepas de S.
mutans forman agregados con Nocardia, Neisseria al igual que con
Candidaalbicans (adherencia heteróloga). Estos procesos son complejos e
implican una variedad de componentes bacterianos y de factores externos como
dietas especialmente altas en sacarosa que puede influir también en la
proporción de las distintas especies bacterianas que constituyen la película, la
cual es fermentada por S. mutans y C. albicans, produciendo un entorno
acidogénico favorable para ambos(24).
Dentro del campo de la investigación científica, específicamente en cuanto al
16
obtener muestras representativas de diferentes sitios orales y para aislar, cultivar
y contar los microorganismos. No existe un solo método de cultivo para examinar
la variable y compleja placa dental que satisfaga todas las condiciones
necesarias. En algunos casos se requieren procedimientos estrictamente
anaeróbicos. Afortunadamente, muchas de las especies de estreptococos orales
pueden aislarse de varios sitios usando medios selectivos como el Agar
MitisSalivarius (MS). Aunque el Agar MS fue originalmente desarrollado para
aislar estreptococos fecales, su uso ha predominado sobre otros medios de
cultivo para el aislamiento de estreptococos orales, incluyendo Streptococcus
mutans. En el agar MS, muchos estreptococos orales muestran una morfología
característica de las colonias (blanquecinas, de bordes definidos, colonias firmes
muy adherentes al medio de cultivo) lo cual permite su diferenciación inicial.
Usualmente, la placa de agar se cultiva en una atmosfera del 95% de nitrógeno
y 5% de dióxido de carbono a 37°C por 1 o 2 días seguida de una incubación en
aire por 1 o 2 días. Además de la morfología característica de las colonias, los
estreptococos orales pueden diferenciarse por su habilidad para fermentar
ciertos azucares (especialmente manitol y sorbitol) y por adherirse a superficies
lisas en presencia de sacarosa(24).
2.3. Resistencia antimicrobiana de Streptococcus mutans
La actividad antimicrobiana es definida como la habilidad específica o capacidad
de una molécula de lograr un efecto inhibitorio de crecimiento o activas una
cascada de muerte celular en un microorganismo. La actividad antimicrobiana
debe ser una propiedad o atributo definible y medible para un producto biológico,
sintético o semi-sintético y debe estar presente en los estudios de estabilidad,
con el ánimo de verificar la conformidad del producto en lo que respecta a su
calidad(29). La actividad o potencia de un antibiótico puede ser demostrada
mediante el efecto inhibitorio de la sustancia en cuestión cuando es evaluado
frente a un microorganismo en un antibiograma. En los análisis de potencia, se
compara cuantitativamente el efecto de una muestra sobre un sistema biológico
con el efecto producido por una preparación estándar en las mismas condiciones
17
un valor de potencia relativo al del estándar de referencia. Si se prueban las
muestras en diferentes concentraciones se puede determinar una concentración
inhibitoria mínima del antibiótico hacia ese microorganismo(29).
La resistencia antimicrobiana (AMR por sus siglas en inglés) amenaza las
políticas o protocolos de tratamiento de una infección determina. La resistencia
antimicrobiana ocurre cuando el organismo muta su maquinaria metabólica y su
expresa nuevos genes en su genoma al ser expuesto a una dosis insuficiente o
que le permite la respuesta a este, desarrollando así resistencia en la siguiente
exposición al tratamiento o a la molécula(30). Little, Thomson y Bowen en su
estudio sobre la acción antimicrobiana de varias moléculas sobre S. mutans
encontraron que la bacitracina, polimixina B y meticilina flanqueaban la pared
celular como su sitio de acción. Más adelante conocieron que la polimixina B
actúa como detergente catiónico, uniéndose a los lipopolisacáridos y otras
moléculas cargadas negativamente en la pared celular bacteriana. Esto coincidió
con observaciones de otros investigadores que mostraron que las cepas del
serotipo b serían las más electronegativas de las cepas de S. mutans. Si las
cepas de serotipo b tienen una carga más negativa, su susceptibilidad polimixina
B podría ser el resultado de una afinidad más grande por la molécula. La
bacitracina en cambio, se reportó como un inhibidor de la síntesis de la pared
bacteriana que se une a una membrana fosfolipídica y de ese modo bloquea la
síntesis de peptidoglicanos. Se ha encontrado que las cepas del serotipo alfa
contienen un ácido graso único en este serotipo; de este modo, este ácido graso
puede ser involucrado en el enlace de la bacitracina a la membrana fosfolipídica
y así contribuye a una mayor susceptibilidad de las cepas del serotipo alfa a la
bacitracina. Se evidenció además que ciertos antibióticos y quizás otros agentes
que actúan en la superficie de la pared celular pueden no ser igual de efectivos
contra cepas representativas de S. Mutans. Este rango en actividad podría
deberse a diferencias en los componentes de la pared celular a lo largo de los
18
2.4. Actividad bactericida de aceites esenciales de especies vegetales
Los aceites esenciales pueden actuar como potenciales antimicrobianos de ese
modo, los aceites esenciales pueden incrementar el perfil antibiótico para el cual
la acción está limitada por mecanismos de resistencia a multifármacos(32). La
actividad antimicrobiana de los aceites esenciales depende principalmente de su
lipofilicidad debido a que las moléculas de carbono de cadena pequeña
interactúan con las membranas de los microorganismos acarreando cambios en
el potencial de membrana, con inhibición de la síntesis de la pared celular y la
consecuente fluidez de la membrana externa, conduciendo así, a una ruptura y
pérdida del material citoplásmico. La inhibición de las cadenas respiratorias
ocurre por disrupción mitocondrial(32).
Las moléculas de aceite esencial pueden unirse o inhibir proteínas específicas
causando daño al ARN y ADN inhibiendo la transcripción y replicación
cromosomal. De ese modo, los aceites esenciales pueden interferir con la
expresión de los genes codificadores de los factores de virulencia(32).
2.4.1. Generalidades de Ocimun basilicum (Albahaca)
La albahaca, Ocimun basilicum L., es una planta originaria de India y fue
introducida en Europa por los griegos y los romanos desde el siglo XVI. La
albahaca pertenece a la familia Lamiaceae y se conoce principalmente con este
nombre en los países de habla hispana. Recibe otros nombres vulgares como
basílica, basilisco y alhabaga. En países de habla inglesa recibe el nombre de
basil; en Francia, basilic; en Alemania, bergminze y en Italia, calamento(33).
Taxonomía y Morfología
La planta de albahaca hace parte del reino plantae, división magnoliophyta
(angiosperma) de clase magnoliopsoda (dicotiledónea), subclase asteridae,
orden tubiflorae perteneciente a la familia Lamiaceae, género Ocimum y su
19
La albahaca (Ocimun basilicum) es una planta aromática y medicinal, herbácea,
anual, de tallos erectos y ramificados, frondosa, que alcanza de 30 a 50 cm de
altura. Las hojas de 2 a 5 cm, suaves, oblongas, opuestas, pecioladas, aovadas,
lanceoladas y ligeramente dentadas. Las flores son blancas, dispuestas en
espigas alargadas, asilares, en la parte superior del tallo o en los extremos de
las ramas(33).
Uso Medicinal
Posee muchos efectos farmacológicos en gran variedad de enfermedades, como
potente antioxidante, anti-anginoso, anti-cancerígeno, antiviral e incluso
propiedades antibacterianas (35). El ácido rosmarínico es el componente
biológico más activo presente en la albahaca que se ha relacionado a sus efectos
medicinales(36). Se ha probado que los extractos de O. basilicum actúan como
antioxidantes, revirtiendo eficientemente el efecto de potentes agentes
oxidativos como el peróxido de hidrógeno. Estas acciones son explicadas por su
composición, la cual es rica en polifenoles y flavonoides componentes a su vez
del ácido rosmarínico que posee ya una muy bien conocida actividad
antioxidante (37). O. basilicum posee propiedades antiinflamatorias y el
mecanismo envuelto en este efecto es una interacción compuesta entre la
inhibición del mediador pro-inflamatorio y la estimulación de citokinas
antiinflamatorias (37).
2.5. Métodos de extracción en Fitoquímica
Durante el inicio de un estudio fitoquímico hay que tener presente qué tipo de
metabolitos es posible determinar en la especie de estudio y de manera más
específica, la parte de la planta de la que se va a realizar el extracto, debido a
que de la correcta selección de estos factores va a depender el método de
extracción a utilizar. Generalmente se hace la extracción del material vegetal
seco y pulverizado permitiendo así una mayor permeabilidad del solvente y por
ende un mayor rendimiento en la extracción debido a que muchas veces los
20
incorruptibles en la estructura de la planta sin volatilizarse; sin embargo, en
algunos estudios como aquellos relacionados con aromas es absolutamente
necesario la utilización del material vegetal fresco. La polaridad de los
compuestos a extraer determina el tipo de solvente a emplearse, de este modo
si se quieren extraer mayoritariamente compuestos como esteroles, se debe
utilizar un solvente como éter de petróleo; las cumarinas se extraen con hexano
y los alcaloides primero con etanol y posteriormente con un ácido diluido. El
etanol es un solvente de amplio uso, ya que con este se extraen sustancias de
todas las polaridades, además este es estable (poco reactivo), de fácil
evaporación y a la vez económico(38).
2.5.1. Extracción sólido-líquido
Consiste en la extracción de un componente de interés soluble de un sólido con
el contacto con un disolvente, en fitoquímica la fase portadora sólida sería el
material vegetal, el soluto sería el extracto resultante de este disolvente(38).
2.5.2. Maceración
Este procedimiento tiene como principio la obtención de extractos gracias al
duradero tiempo de contacto que el solvente debe tener con el material vegetal
que debe estar pulverizado o molido para lograr una mayor superficie de contacto
con el solvente, a una temperatura ambiente. Es conveniente realizar agitaciones
frecuentes para la homogenización del producto y así tratar de influenciar el
rendimiento de la extracción; el poder de extracción del solvente va
disminuyendo a medida que pasa el tiempo de contacto con el material vegetal;
para este tipo de extractos es útil la protección del recipiente de extracción de la
luz solar, debido a la descomposición de sustancias fotolábiles. Después de la
filtración se requiere lavar el material vegetal restante con más solvente para la
21 2.5.3. Percolación o lixiviación
Consiste en el paso del disolvente a temperatura ambiente sin la aplicación de
presión (solo por la acción de la gravedad) a través del material vegetal
finamente molido, el 46 hecho de que el solvente pase detenidamente por las
partículas del sólido hace que disuelva la mayor cantidad de metabolitos que le
es posible y debido a que es continua la adición de solvente se logra una
extracción muy efectiva utilizando esta técnica(38).
2.5.4. Extracción líquido-líquido
La extracción líquido-líquido consiste en la transferencia de una o varias
sustancias desde una fase líquida a otra líquida que es inmiscible con la primera.
Debido al reparto que ocurre entre las dos fases de compuestos de diversas
polaridades generalmente una fase es acuosa y la otra conocida como
extractante es orgánica, siendo esta la responsable de la transferencia de
compuestos de una fase acuosa(38).
2.6. Conclusiones Parciales
1. El Ocimum Basilicum posee compuestos polifenólicos que poseen actividad
antimicrobiana sobre bacterias Gram positivas y negativas.
2. Los polifenoles con catequinas pueden transformarse en una herramienta
para sustituir los antibióticos, proveyendo un producto de origen natural
inocuo para la salud humana. El aceite esencial de albahaca está compuesto
por monoterpenos como estragol, linalol, acetato de linaloilo, eucalipto,
eugenol y ácidos fenólicos derivados del ácido cinámico y flavonoides que
pueden extraerse con etanol.
3. El S mutans es una bacteria Gram positiva, cariogénica que habita en la boca,
especialmente en el biofilm.
4. Streptococcus mutans es un microorganismo capaz de adquirir nuevas
propiedades que permiten la expresión de determinantes de patogenicidad
22
5. El etanol es un solvente estable, adecuado y de fácil evaporación para la
extracción de sustancias de todas las polaridades.
6. El etanol tiene la capacidad de atravesar las membranas de las células de las
23 3. CAPITULO II. MARCO METODOLÓGICO
3.1. Descripción de los procedimientos metodológico para el desarrollo de la investigación
El presente trabajo de investigación se desarrolló en modalidad cualitativa y
cuantitativa, con diseño cuasi experimental. Por su alcance es una investigación
Correlacional. Se evaluó la actividad antimicrobiana de los extractos etanólicos
a distintas concentraciones de la albahaca expendida en la ciudad de Guayaquil,
siendo las muestras adquiridas en el Mercado de Sauces 9, al Norte de la ciudad.
Guayaquil, es la ciudad más grande y habitada de Ecuador, está ubicada a 4.0
msnm, localizada a 2°11´00´Sur y 79°53´00´ Oeste.
3.2. Operaciones Previas
3.2.1. Limpieza.
Se eliminaron cuidadosamente tallos, raíces y la tierra adherida, se utilizó
cuchillos de acero inoxidables de hoja roma con el fin de separar también las
raicillas (40).
3.2.2. Preparación de la muestra
Se toman las hojas seleccionadas y se almacena en refrigeración hasta el
siguiente proceso.
3.2.3. Parámetros Físico - Químicos Medición de Humedad
Llevar al horno secador las hojas para extraer la humedad de las mismas a 60ºC
24
Porcentaje de humedad de la muestra:
% H = (p – p”)/ p x 100 (Ecuación 1)
Donde:
p = peso inicial de la muestra
p” = peso final de la muestra
Medición de Cenizas Totales
Con la ayuda de 2 crisoles previamente tarados, se pesaron 2 gr. de muestra
vegetal seca y molida en cada crisol, y llevamos a la mufla por el lapso de 3
horas a 750ºC, pasado este tiempo dejar en secador y pesar(40).
C=𝐌𝟐−𝐌𝐌𝟏−𝐌𝐗𝟏𝟎𝟎 (Ecuación 2)
Donde:
M2 = Masa de crisol con cenizas
M1 = Masa de crisol con muestra de ensayo
M = Masa de crisol vacío
Cenizas Totales en Agua
Se pesaron 2 gramos de muestra vegetal seca y molida en dos crisoles
respectivamente, llevar a la mufla por 3 horas a 750ºC, pasado este tiempo dejar
25
C=𝐌𝟐−𝐌𝐌𝟏−𝐌𝐗𝟏𝟎𝟎 (Ecuación 3)
M2 = Masa de crisol con cenizas
M1 = Masa de crisol con muestra de ensayo
M = Masa de crisol vacío
Cenizas Totales en Ácido Clorhídrico.
En el crisol con ceniza se colocaron 2 ml de HCl al 10 %, tapar el crisol con papel
aluminio, poner agua a hervir previamente en un vaso de precipitación,
posteriormente se filtró el contenido del crisol con papel filtro tarado, con la ayuda
del agua caliente se realizaron varios enjuagues al papel filtro con residuo
descartando el líquido del filtrado, en el último enjuague se tomó una muestra el
líquido y se añadió 1 gota de HNO3 y 1-2 gotas de AgNO3, si se obtuviese un
color blanco en el líquido se procederá a seguir los enjuagues del papel filtro con
agua caliente hasta que el líquido al adicionarle las gotas de reactivo no tomasen
ningún color es decir queden transparente. Luego de esto se puso el papel filtro
con residuo en el crisol correspondiente para llevarlo a la mufla por 2 horas a
750 ºC (40).
3.3. Obtención de extractos y aceite esencial de Ocimun basilicum.
Estos se obtienen mediante la separación de porciones biológicamente activas
presentes en los tejidos de las plantas, con el uso de un solvente (alcohol, agua,
mezcla de estos u otro solvente selectivo) y un proceso de extracción adecuado.
Una vez colectadas las hojas con criterio de inclusión se secaron a 40°C, luego
se trituraron manualmente, logrando una cantidad de 72g. Se prefiere etanol
como solvente porque los compuestos alcohólicos rompen la membrana celular
y así se logra extraer grandes cantidades de material endocelular, además de
26
3.4. Autenticación de la especie de planta vascular
Este procedimiento se llevó a cabo con un curador certificado del Herbario GUAY
de la Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad de Guayaquil (Anexo 1).
3.5. Extracto Etéreo.
Se pesó 25 g. de droga seca y molida y se extrajo con 200 ml de éter etílico por
maceración durante 48 horas. Se obtiene el extracto y el residuo sólido (secar y
pesar).
3.6. Extracto Etanólico
A la droga seca mediante el éter etílico se extrajo, por maceración con etanol al
75% (tres veces el peso del residuo en volumen) durante 48 horas se obtiene, el
extracto y el residuo sólido (secar y pesar).
3.7. Destilación por arrastre de vapor
Se toman 100g de hojas, de las cuales se trabajarán con las que cumplan el
criterio de inclusión y se trocean en pedazos pequeños. Se conservan en
refrigeración por un máximo de 2 horas, previo a la destilación. Se coloca en el balón, denominado como “A”, agua destilada; en un balón denominado como “B”
se coloca la muestra. Se ensambla el equipo de destilación para arrastre de
vapor y se procede a recoger el destilado. Una vez colectado el líquido que debe
tener un color blanco lechoso, se procede a sangrarlo con Cloruro de Sodio y
extraer con cloroformo. Se guardar el Aceite esencial obtenido en frascos ámbar
de tapa rosca. El procedimiento se repitió hasta agotar las hojas.
3.8. Estudio Etnofarmacológico de Plantas Medicinales
El Ecuador es un país de amplia trayectoria en medicina tradicional, por ello el
presente estudio se llevó a cabo en la ciudad de Guayaquil sector de Sauces
27
de 50 a 70 años, debido a que el uso de las plantas forma parte de saberes
ancestrales, se prefirió trabajar con adultos maduros y mayores, pues estos
conocimientos se transmiten de generación en generación. El uso de plantas
para tratar enfermedades es un hábito común, y las más mencionadas se
detallan en el gráfico.
GRÁFICO 1 PLANTAS CON USO MEDICINAL. - GUAYAQUIL. - SECTOR
SAUCES 2,3 Y 7
Fuente: Cuestionario Etnofarmacològico Elaborado por: la Autora
3.9. Estudio Microbiológico.
3.9.1. Selección de la cepa bacteriana
Las muestras que fueron parte del estudio corresponden a cepas de bacterias
de Streptococcus mutans (ATCC 25175). Esta cepa bacteriana no se encuentra
en contacto con ningún medicamento o solución antimicrobiana y son
manipuladas con las normas de Bioseguridad respectivas.
La cepa de Streptococcus mutans ATCC 25175 se cultivó en tubos de ensayo
con tapa rosca conteniendo el medio Soya Tripticasa a 37°C con el fin de obtener
colonias jóvenes. Luego de 24 horas de cultivadas se les agregó solución salina
28
estéril, hasta obtener una turbidez semejante al tubo número 1 de la escala de
Mac Farland.
3.9.2. Ensayos de actividad bactericida in vitro.
Una vez conocidas las concentraciones para cada extracto, se prepara inóculos
bacterianos de Streptococcus mutans con criterios de sensibilidad: difusión
12mm y se siembra en cajas Petri con agar Mueller Hinton-Sangre. Se rotuló las
placas indicando el número de ensayo y la posición de los discos, así como
también el control positivo.
El extracto hidroalcohólico de Ocimum Basilicum al 4%, 5% y 15% embebido en
discos de papel filtro se colocó en cada caja de cultivo, donde se conoce
experimentalmente que los halos se inhiben con una dispersión de 12 mm
aproximadamente.
Los tubos que contuvieron la bacteria estudiada fueron girados entre las manos
durante 30 segundos, antes de proceder al sembrado, para distribuir los
microorganismos adecuadamente. Se trabajó como control positivo con el
extracto etanólico al 75% en las diluciones propuestas y como control negativo
se utilizó agua bidestilada autoclavada.
En la difusión en disco, las cepas diluidas se sembraron masivamente sobre el
agar y se colocaron en la superficie de los medios cuatro discos de papel de filtro
(Whatman) de 6 mm de diámetro, impregnados con 0,2 mL de cada una de las
diluciones de los extractos puros y usando agua bidestilada autoclavada como
control negativo. Se incubaron las placas a 37 ° C, por 24 horas, efectuándose
esta prueba por sextuplicado.
Posteriormente, se midió el diámetro del halo de inhibición del crecimiento de los
microorganismos y se realizó el cálculo del porcentaje del efecto inhibitorio
relativo respecto al control positivo, que se procedió aplicando la siguiente
29
% 𝑬𝒇𝒆𝒄𝒕𝒐 𝑰𝒏𝒉𝒊𝒃𝒊𝒕𝒐𝒓𝒊𝒐 = 𝑴𝒆𝒅𝒊𝒂 𝒅𝒊á𝒎𝒆𝒕𝒓𝒐 𝒉𝒂𝒍𝒐 𝒅𝒆 𝒊𝒏𝒉𝒊𝒃𝒊𝒄𝒊ó𝒏
𝑫𝒊á𝒎𝒆𝒕𝒓𝒐 𝒉𝒂𝒍𝒐 𝒅𝒆 𝒊𝒏𝒉𝒊𝒃𝒊𝒄𝒊ó𝒏 𝒄𝒐𝒏𝒕𝒓𝒐𝒍 𝒑𝒐𝒔𝒊𝒕𝒊𝒗𝒐 × 𝟏𝟎𝟎 (Ecuación 4)
3.9.3. Diluciones del extracto etanólico al 75%
Para realizar el trabajo microbiológico se procedió a realizar las diluciones del
extracto etanólico al 75% a concentraciones de 4%, 5% y 15%, aplicando la
siguiente ecuación:
V1C1=V2C2 (Ecuación 5)
Tabla 1. Diluciones de Extracto etanólico de albahaca (Ocimum Basilicum).
EXTRACTO ETANOLICO
75%
(Volumen inicial mL)
DILUCION FINAL
(%)
VOLUMEN FINAL
Ml
25 ml 4 624,94 Ml
25 ml 5 499,95 Ml
25 ml 15 166,65 Ml
3.9.4. Propuesta de Análisis Estadístico
El diseño experimental de esta investigación conlleva observar el efecto del
extracto bruto etanólico de Albahaca sobre S. mutans. En diluciones
prestablecidas de 25%, 50%, 75% y 100%. Para realizar el análisis estadístico
de los datos, se aplicó ANOVA de una sola vía con ajuste de Bonferroni para
establecer la diferencia entre el tratamiento control y las distintas diluciones del
extracto. Un análisis de ANOVA de dos vías se aplicó para establecer las
diferencias entre tratamientos con un ajuste de prueba de Tukey. La
significancia, se reportó con un intervalo de confianza del 95% y significancia
estadística menor o igual a 0,05; para realizar estos cálculos, se empleó los
programas estadísticos SPSS 13.0 y Graphpad Prism 7 con software bajo
30
3.10. Análisis e interpretación de Resultados 3.10.1. Datos Obtenidos del estudio bactericida
A partir de los experimentos llevados a cabo sobre la cepa de S. mutans en la
que se probó los extractos se obtuvieron los siguientes resultados crudos
(Tabla 2).
Tabla 2.Row data de los halos de inhibición por plato y por tratamiento medidos en milímetros.
Codificación de Plato
Control Amoxicilina Halo de Inhibición
(Media en mm)
T1 (25%) Halo de Inhibición
(Media en mm)
T2 (50%) Halo de Inhibición
(Media en mm)
T3 (75%) Halo de Inhibición
(Media en mm)
T4 (100%) Halo de Inhibición
(Media en mm)
P1 15,5 15,9 16,9 16,9 6,7 6,8 6,7 6,7 7,0 7,0 6,9 7,3 10,3 10,3 10,4 11,2 12,7 13,0 13,4 13,4
P2 16,9 16,9 17,2 15,9 6,8 7,3 7,3 6,7 7,1 7,1 6,9 7,0 10,3 10,3 11,2 10,4 12,7 11,7 13,0 12,7
P3 15,9 17,5 15,5 16,9 6,7 6,8 6,8 6,8 6,9 6,9 7,3 7,0 11,2 10,2 10,3 10,4 12,7 12,7 13,4 11,7
P4 15,9 16,9 15,9 16,9 7,3 6,8 7,3 7,3 7,3 7,0 6,9 7,1 11,2 10,3 10,4 10,3 11,7 12,7 12,7 13,2
P5 17,2 15,9 16,9 15,5 6,8 7,3 6,8 6,7 7,1 7,1 7,3 7,0 10,3 11,2 11,2 10,4 13,2 13,4 12,7 12,7
P6 17,2 15,9 16,9 15,5 7,3 6,8 6,8 7,3 6,9 6,9 7,3 7,0 11,2 10,2 10,3 11,2 12,7 11,7 13,2 12,7
3.10.2. Análisis estadístico de los datos obtenidos
Se llevaron a cabo corridas estadísticas para establecer las diferencias entre
tratamientos y las diferencias de cada tratamiento versus el control positivo. Los
31
Tabla 3. Parámetros de análisis para corrida de análisis estadístico.
Table Analyzed Row Data
Repeated measures ANOVA summary
Assume sphericity? No
F 3147
P value <0,0001
P value summary ****
Statistically significant (P < 0.05)? Yes
Geisser-Greenhouse's épsilon 0,404
R square 0,9984
Was the matching effective?
F 0,3863
P value 0,8523
P value summary Ns
Is there significant matching (P < 0.05)? No
R square 0,0001532
Bajo los parámetros ajustados y establecidos en la Tabla 3 se llevaron a cabo
todos los análisis posteriores. Con el propósito de evaluar si existe diferencia
entre los resultados obtenidos a partir de cada plato sujeto de estudio se llevó a
cabo un análisis de comparación de filas. Los resultados se los puede visualizar
en la Tabla 4. Los resultados muestran que no existe diferencias
estadísticamente significativas entre filas, pero sí entre columnas por lo que se
infiere que el sesgo entre platos queda desestimado, otorgando robustez al
32
Tabla 4. Resultados del análisis de diferencia entre platos incluídos en el estudio.
ANOVA Table SS DF MS F (DFn, DFd) P value
Treatment (between columns) 387,6 4 96,9 F (1,616, 8,081) = 3147 P<0,0001a
Individual (between rows) 0,05948 5 0,0119 F (5, 20) = 0,3863 P=0,8523b Residual (random) 0,6159 20 0,0308
Total 388,3 29
a Diferencia estadísticamente significativa b Diferencia no estadísticamente significativa
Continuando con en análisis de datos se procede a correr un ANOVA de una
sola vía de múltiples comparaciones con un ajuste de Bonferroni (Bonferroni's
múltiple comparisons test) con un intervalo de confianza al 95% y una
significancia fijada en menor o igual a 0,05; con el objetivo de establecer
diferencias entre los tratamientos aplicados al cultivo in vitro de S. mutans. Los
resultados de las múltiples comparaciones se muestran en la Tabla 5 y la
Ilustración 1.
Tabla 5. Resultados del análisis de one-way ANOVA para comparación del tratamiento control versus diluciones de extracto etanólico.
Bonferroni's multiple comparisons test Mean Diff, 95,00% CI of diff, Significant? Summary Adjusted P Value
Control (Amoxicilina) vs. T1 (25%) 9,508 9,213 to 9,803 Yes **** <0,0001 a
Control (Amoxicilina) vs. T2 (50%) 9,39 9,118 to 9,663 Yes **** <0,0001 a
Control (Amoxicilina) vs. T3 (75%) 5,848 5,52 to 6,175 Yes **** <0,0001 a
Control (Amoxicilina) vs. T4 (100%) 3,708 3,121 to 4,295 Yes **** <0,0001 a
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Ilustración 1. Halos de inhibición de cada unos de los tratamientos (mm). Se muestra el promedio de inhibición y la barra de error de cada tratamiento. La
significancia se muestra entre las barras superiores (Control Vs T1, p0,001;
Control Vs T2, p0,001; Control Vs T3, p0,001; Control Vs T4, p0,001).
Finalmente, se evaluó las diferencias entre los tratamientos (Tukey's múltiple
comparisons test), así como el porcentaje del efecto inhibitorio del extracto
etanólico bruto de Ocimun basilicum. Los resultados se muestran en la Tabla 6
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diferencia entre cada uno de los tratamientos, a excepción de la comparación
entre el tratamiento T1 vs. T2. En base a los datos analizados se establece que
la concentración del extracto está directamente relacionada y es proporcional al
efecto encontrado en el estudio.
Tabla 6. Resultados de comparación entre tratamientos (two-way ANOVA). Existe diferencia significativa entre cada uno de ellos a excepción del T1 vs. T2
(p=0,6826).
Tukey's multiple comparisons test Mean Diff, 95,00% CI of diff, Significant? Summary Adjusted P Value
Control (Amoxicilina) vs. T1 (25%) 9,508 9,224 to 9,792 Yes **** <0,0001 a
Control (Amoxicilina) vs. T2 (50%) 9,39 9,107 to 9,674 Yes **** <0,0001 a
Control (Amoxicilina) vs. T3 (75%) 5,848 5,564 to 6,132 Yes **** <0,0001 a
Control (Amoxicilina) vs. T4 (100%) 3,708 3,424 to 3,992 Yes **** <0,0001 a
T1 (25%) vs. T2 (50%) -0,1179 -0,4018 to 0,166 No ns 0,6826
T1 (25%) vs. T3 (75%) -3,66 -3,944 to -3,377 Yes **** <0,0001 a
T1 (25%) vs. T4 (100%) -5,8 -6,084 to -5,517 Yes **** <0,0001 a
T2 (50%) vs. T3 (75%) -3,543 -3,826 to -3,259 Yes **** <0,0001 a
T2 (50%) vs. T4 (100%) -5,683 -5,966 to -5,399 Yes **** <0,0001 a
T3 (75%) vs. T4 (100%) -2,14 -2,424 to -1,856 Yes **** <0,0001 a
a Diferencia estadísticamente significativa
Mediante el uso de la Ecuación 5, se procede a obtener los datos del porcentaje
de inhibición a partir de los datos generados en la Tabla 7 obtenida del software
estadístico.
