TEMA 10: A REPLICACIÓN DO ADN
Hipóteses sobre a replicación do ADN: propuxéronse 3 hipóteses:
• Semiconservativa: según esta hipótese, formulada por Watson e Crick, a partir dunha molécula de ADN se obteñen 2, pero posúen cada unha 1 hebra da molécula orixinal (que serve como molde) + 1 hebra nova complementaria.
• Conservativa: a partir dunha molécula de ADN se van a producir 2, unha das cales é a orixinal e a outra é completamente nova.
• Dispersiva: según esta hipótese, as 2 moléculas que se obteñen presentan segmentos antigos e segmentos novos.
EXPERIMENTO DE MESELSON E STAHL
Este experimento permitiu en 1957 demostrar que o mecanismo real de replicación do ADN se axusta á hipótese de que a replicación do ADN é semiconservativa.
Descripción do experimento de Meselson e Stahl 1º experimento:
• Cultivaron bacterias (Escherichia coli) nun medio con nitróxeno pesado (N15) (un isótopo do nitróxeno máis pesado do habitual) de modo que o isótopo se incorporou ás cadeas de ADN que se iban sintetizando en sucesivas xeneracións bacterianas, facéndoas máis pesadas.
• Pasaron as bacterias cultivadas con N15 a un medio con N normal (N14) e deixaron que se duplicara o ADN (30 min aprox)
• Extraeron o ADN e centrifugárono. Como o ADN con N15 pesa máis ca o sintetizado con N14, se poden separar por centrifugación, de modo que o “lixeiro” queda máis arriba que o
“pesado” no tubo da centrífuga) Æ observaron que o ADN acabado de sintetizar era de densidade intermedia, polo que ocupaba una posición intermedia entre o ADN con N15 e o de N14.
• Deste modo deduciuse que se trataba dun ADN “híbrido” e, polo tanto, descartouse a hipótese conservativa (que predecía que aparecería una banda de ADN pesado e outra de ADN lixeiro)
Pero este resultado confirmaría tanto a hipótese semiconservativa (que predí que todas as moléculas de ADN presentarán unha cadea N15 e unha cadea N14) como a hipótese dispersiva (que tamén predí que todo o ADN será de densidade intermedia N14-15, presentando segmentos intercalados de doble cadea N15 e N14).
Por este motivo fixeron un 2º experimento:
• Deixaron crecer as bacterias no medio con N14 durante 2 divisións máis (1 hora=2 replicac).
• A continuación extraeron o ADN e o centrifugaron, obtendo agora 2 marcas (1 no híbrido + 1 no lixeiro).
Este resultado é exactamente o que o modelo semiconservativo predí: a mitade debería ser densidade intermedia N15-N14 e a metade de densidade liviana N14-N14.
Descartase xa o modelo dispersivo, que predí que despois do ciclo 1 de replicación, a densidade de todas as moléculas de ADN, gradualmente chegarían a ser máis baixas. Polo tanto, ningún ADN de densidade intermedia debería permanecer despois do ciclo 2.
Conclusión: O modelo semiconservativo é o correcto.
RESULTADOS EXPERIMENTO MESSELSON E STAHL
PREDICCIÓNS E DESCARTES DO EXPERIMENTO SEGUNDO OS DIFERENTES MODELOS
MECANISMO XERAL DA REPLICACIÓN:
Introdución:
O ADN ten a capacidade de realizar copias idénticas de sí mesmo mediante un mecanismo, a replicación, que se basea na complementariedade entre as bases nitroxenadas das dúas cadeas do ADN. Grazas a esta complementariedade entre as bases, o ADN pode reproducirse
idénticamente, o que permite que a información xenética sexa exactamente igual na célula nai que nas células fillas.
Esta duplicación do material xenético prodúcese seguindo un mecanismo semiconservativo (de modo que as dúas cadeas do ADN orixinal, ao separarse, serven de molde cada unha para a síntese dunha nova cadea complementaria). Así, cada nova doble hélice contén unha das cadeas do ADN orixinal e una cadea nova complementaria.
Neste proceso, a molécula de ADN ábrese como unha cremalleira por ruptura das pontes de hidróxeno entre as bases complementarias separándose dúas hebras. Entón, a enzima ADN polimerasa sintetiza a cadea complementaria engadindo nucleótidos que se atopan dispersos no núcleo. Deste xeito, cada nova molécula é idéntica á molécula de ADN inicial.
Mecanismo de replicación e enzimas que actúan:
A replicación comeza en puntos determinados denominados orixes de replicación (zonas do ADN que presentan unha secuencia de nucleótidos determinada que actúan como sinal de inicio).
HELICASAS: rompen as pontes de hidróxeno que manteñen unidas as 2 hebras do ADN e as separan. O proceso é bidireccional. Desta forma se orixinan o que se chama “burbullas de replicación ou “ollos de replicación”.
TOPOISOMERASAS: liberan tensións orixinadas no ADN ao romper a dobre hélice.
ARN-POLIMERASA: como as ADN-polimerasas (enzimas que xeran as novas cadeas) non poden sintetizar partindo de cero, intervén primeiro unha ARN-polimerasa, que sí é capaz de facelo. Se denomina PRIMASA e sintetiza un fragmento curto de ARN (formado por uns 10 nucleótidos) que actúa como cebador.
Replicación ADN
ADN-POLIMERASA:
• Principal enzima do proceso de replicación.
• Atópase no núcleo, nas mitocondrias, nos cloroplastos… (onde hai ADN)
• É incapaz de sintetizar a partir de “cero”: o seu papel limítase a engadir nucleótidos a cadeas preexistentes. Esto quere dicir que necesita un fragmento que actúe como
“cebador” ou molde.
• Esta enzima sintetiza solamente en sentido 5´Æ3´, o que quere dicir que une nucleótidos solamente ao extremo 3´do ADN.
ADN-polimerasa III: esta enzima a partir do cebador comenza a sintetizar, en sentido 5´Æ3´ unha hebra de ADN a partir de nucleótidos trifosfato. Esta nova hebra é de crecemento continuo e denomínase hebra conductora (sintetízase en sentido 5´Æ3´e require un cebador!)
Sobre a outra hebra sintetízase a denominada hebra retardada (a súa síntese se retrasa lixeiramente en relación á condutora), que é antiparalela á anterior e se caracteriza por:
• A ARN-polimerasa sintetiza uns 40 nucleótidos (de ARN) nun punto que dista uns 1000 nucleótidos do sinal de inicio.
• A partir destes, a ADN-polimerasa III sintetiza uns 1000 nucleótidos de ADN, formándose o que se denomina un FRAGMENTO DE OKAZAKI
• Despois é necesario outro cebador de ARN (cada certos intervalos é necesario 1 cebador ARN)
• Este proceso vaise repetindo sucesivamente a medida que se van separando as 2 hebras patrón e así se orixinan os denominados fragmentos de okazaki.
ADN-polimerasa I: corta e retira determinados fragmentos de ADN (elimina nucleótidos cuxas bases nitroxenadas están mal apareadas ou fragmentos de ARN cebador) e engade nucleótidos de ADN no seu lugar.
ADN-LIGASA: esta enzima une os diferentes fragmentos de ADN sintetizados.
O proceso continúa ata a duplicación do ADN. Como o crecemento é bidireccional, cada unha das hebras está sintetizada en parte de forma continua e en parte de forma discontinua.
A ADN polimerasa só sintetiza en sentido 5´-->3´
DIFERENCIAS DE REPLICACIÓN EN EUCARIOTAS E PROCARIOTAS
O proceso de replicación é similar en ambos pero existen 2 diferencias fundamentais:
• Reparto de histonas: a hebra que sirve de patrón á hebra conductora e a hebra conductora se quedan coas histonas “antigas” (as que tiña o ADN), mentras que a hebra que sirve de patrón á hebra retardada e a hebra retardada se asocian a novas histonas.
Este proceso non existe en procariotas (bacterias), xa que o ADN procariótico non está asociado a histonas.
• Tendo en conta que a lonxitude do ADN eucariótico é moito maior que o bacteriano e ademáis está asociado a histonas (o que pode retrasar o proceso de replicación), no ADN eucariótico se forman non 1 senón 100 “burbullas de replicación”. A estas burbullas ou ollos de replicación se lles chama tamén “unidades de replicación” ou “replicones”.
TECNICA DA PCR
A reacción en cadena da polimerasa, coñecida como PCR polas suas siglas en inglés
(Polymerase Chain Reaction), é unha técnica de bioloxía molecular desenrolada en 1986 que ten por obxetivo obter un gran número de copias dun fragmento de ADN particular (partindo dun mínimo, basta partir dunha única copia de ese fragmento orixinal ou molde)
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN. A súa utilidade é que, tras a
amplificación, resulta moito máis fácil identificar cunha moi alta probabilidade virus ou bacterias causantes dunha enfermidade, identificar persoas (cadáveres) ou facer investigación científica sobre o ADN amplificado. Estos usos derivados da amplificación fixeron que se convertera nunha técnica moi extendida, co conseguinte abaratamento do equipo necesario para levala a cabo.
MECANISMO DE REPLICACIÓN E ENZIMAS IMPLICADAS
