Northern blot

7.1. Prehibridización de las membranas

Todas las membranas fueron incubadas durante 4 h a 42 °C con una solución de formamida 50% v/v; SSPE 5X (ver apéndice); Denhart 1X (ver apéndice) y SDS 0,2% p/v, con el agregado de 0,2 g l^-1 de ADN de esperma de salmón como agente bloqueante.

7.2. Preparación de sondas

Todas las sondas fueron obtenidas a partir de reacciones de PCR, utilizando cebadores específicos (Tabla II).

120

Gen Cebador Secuencia 5’-3’ Uso

FaPE1 FaPME1 FaPME2

GTT AAC TCT AGC ACA CCT AC TTA GGC ATA GAA TGC AAC AC

Sonda para Northern blot

FaPAL fFaPAL rFaPAL

GAT GTC AAC TCC TTG GGA CTG TCC ACG ACT GAG AGC AGG TG

Sonda para Northern blot. Búsqueda en biblioteca de ADNc.

5’WPAL ATC AAC TCT GTC AAC GAC AAT CC Secuenciación clones 3’WPAL TGT ACA ATG GAT AAG ACC TGC Secuenciación clones 5’WPAL2 GGT ATG GCT TCT GTG GTG CTG Secuenciación clones FaPALrace5a TGC AGC TTC AAT CTG GCC CAG

GGT GGT GC

Reacción de 5’RACE fPAL3utr

rPAL3utr

TCT AAT GGT GTC TAT ACA AGG C ACT GGG TAA AGA CAC ATT TG

Sonda para Northern blot

FaPALrace5c TCT CCG GTG GGA GGT AGC ACC GAA CCC G

Reacción de 5’RACE FaPALrace5d CTC CGG TGG GAG GTA GCA CCG

AAC CCG G

Reacción de 5’RACE rPAL5utr AGC TGC TGC CAA AGA TTC CGG C PCR

FaOLP2 fFaOLP2 rFaOLP2

AGC ACG ATT CGA TAT CCG A TGT TGA ACT GGT TAA GCC CG

Sonda para Northern blot

FaChi2-1 fFaChi2-1rt rFaChi2-1rt

TGC AGC CTT CTA ATG ATC AAC ACC

GAT GGC AGC GAG AGT ACT GC

RT-PCR

Semicuantitativa FaChi2-2 fFaChi2-2rt

rfaChi2-2rt

CGA GAC TTT GGT CTT CTA GGC GG AGG GAA ACG ATG ATA AGG GTG AG

RT-PCR

Semicuantitativa FaChi3 fFaChi3real

rFaChi3rt

GCA CAA AAC TTG TAG CAA CAA GGC C

GCA CGA CTT GAT CTG CGA GCT G

RT-PCR

Semicuntitativa FaBG2-1 fFaBG2-1rt

rFaBG2-1rt

TCA ATC ATG TGA AGA CCG GGA C ACC TGC TGT TGC ATA CTT GC

RT-PCR

Semicuantitativa FaBG2-3 fFaBG2-3rt

rFaBG2-3rt

TCT GAA GGT AGT GAT GCT GC AGA CGA CAA AAA CAT AGG AAC C

RT-PCR

Semicuantitativa ARNr 18s Rib5

Rib3

ACC GTA GTA ATT CTA GAG CT CCA CTA TCC TAC CAT CGA AA

Sonda para Northern RT-PCR

Semicuantitativa Tabla II: Descripción de cebadores utilizados en diferentes experimentos. Se muestra el gen que amplifican, la nomenclatura y secuencia de los cebadores y el uso de los mismos.

121 7.2.1. Genes que codifican proteínas de degradación de la pared celular

Los fragmentos pertenecientes a FaEXP2 (AF159563), FaEXP4 (AF226701) y FaEXP5 (AF226702) se obtuvieron de acuerdo a Dotto y col. (2006). En el caso de FaCel1, la sonda fue preparada por amplificación de un fragmento que abarca desde la base 4 a la 322 del gen FaCel1 (Harpster y col. 1998). La sonda utilizada para analizar la expresión de FaPG1 fue preparada a partir de un fragmento de 1.008 pb (bases 286 a 1.294) del gen FaPG1 (Villarreal y col. 2007). El fragmento de FaPE1 fue amplificado desde la base 1.276 hasta la 1.767 con cebadores específicos (Tabla II), diseñados en el laboratorio a partir de la secuencia descripta por Castillejo y col. (2004).

7.2.2. Genes relacionados a mecanismos de defensa

Las sondas específicas para FaPAL (AJ871757) y FaOLP2 (DQ325524) fueron obtenidas por PCR utilizando cebadores específicos diseñados a partir de secuencias presentes en el GenBank. Los fragmentos sintetizados poseen un tamaño de 248 pb en el caso de FaPAL y 272 pb para FaOLP2. Además, se diseñaron cebadores en la región 3’ no traducible de FaPAL1 con los que se obtuvo un fragmento de 188 pb. En todos los casos, se utilizó como molde una biblioteca de ADNc de frutilla madura (Civello y col. 1999), construida en un vector Uni-ZAP XR (Stratagene, La Jolla, CA, USA).

7.3. Marcado radiactivo de las sondas

Las sondas se marcaron radiactivamente por el método de cebado al azar (random priming) usando 100 ng de ADN molde (previamente calentado a 100 °C durante 5 min y enfriado en hielo 5 min), 5 μl de buffer ADN polimerasa 10X, 2 μl de mezcla de dCTP, dGTP y dTTP 500 μM, 0,5 μl de hexámeros al azar (500 μg ml^-1), 2 μl de BSA acetilada (10 mg ml^-1), 1 μl de la enzima Klenow (5 U μl^-1) y 4 μl de α-³²P-dATP (10 mCi ml^-1) en un volumen final de 50 μl. La reacción se llevó a cabo durante 2 h a 37 °C. Luego la mezcla de reacción se pasó por una columna de Sephadex G-50 equilibrada en solución reguladora TE y se centrifugó a 3.000 rpm durante 1 min para separar la sonda marcada del exceso de nucleótido radiactivo. Las sondas marcadas se desnaturalizaron a 100 °C durante 5 min y enfriaron inmediatamente en hielo durante 5 min. Finalmente, se agregaron a los correspondientes tubos de hibridación.

122 7.4. Hibridación de las membranas

Luego de fabricada la sonda como se indicó en el punto 7.3, la misma se dejó en contacto con la membrana durante toda la noche a 42 °C, manteniendo una suave rotación del tubo de hibridación. Posteriormente, se realizaron los lavados usando una solución de SSC 1X y SDS 0,1% p/v. El primero de los lavados se hizo a 42 °C durante 30 min y los 3 siguientes a 50 °C también durante 30 min cada uno. Las membranas se expusieron a placas radiográficas (X-OMAT, Kodak) a -80 °C y se revelaron luego de 10 días de exposición, aproximadamente, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

7.5. Hibridación de las membranas con sonda para ARNr 18S

Para obtener el correspondiente control de carga de las membranas, se les retiró la sonda específica utilizada previamente y se las hibridizó con una sonda que reconoce ARN ribosomal 18S de frutilla. Para esto, la sonda específica original fue eliminada cubriendo las membranas con una solución caliente de SDS 0,5% p/v y dejándolas en contacto, con agitación, hasta que la solución alcanzó la temperatura ambiente. Las membranas se secaron con papel de filtro y se hibridizaron con la sonda para ARNr 18S como se indica en 7.4. En este caso, los últimos 3 lavados se realizaron a una temperatura de 55 °C y las membranas se expusieron de 4 h a 3 d, dependiendo de la mayor o menor cantidad de marca incorporada en la sonda.