Expresión de FaCel1 y actividad endo-1,4-β-D-glucanasa

Cuando se analizó la expresión de FaCel1, gen que codifica para una endo-1,4-β-D- glucanasa putativa de frutilla, se detectó muy baja señal en los estadios blanco y 25% rojo de la variedad Aroma (Figura 19A). Sin embargo, el mensajero se acumuló gradualmente hasta el estadio 100% rojo donde la expresión alcanzó el nivel máximo, decreciendo levemente en el sobremaduro (Figura 19A). Este patrón de expresión encontrado para FaCel1 en la variedad Aroma es similar a los obtenidos en trabajos previos, en los que se utilizaron las variedades Selva y Chandler (Harpster y col. 1998; Trainotti y col. 1999; Llop- Tous y col. 1999).

En la figura 19B se muestran los perfiles de expresión de FaCel1 en frutos controles e irradiados. En la misma, se puede observar que la irradiación con UV-C redujo levemente la expresión de este gen desde las 4 hasta las 24 h después del tratamiento.

Por el contrario, se observó una expresión de FaCel1 similar o mayor en los frutos tratados después de 48 ó 72 h a 20 °C con respecto a los no irradiados.

Figura 18: Expresión de genes de expansinas en frutos controles y tratados con UV-C. (A) FaEXP2; (B) FaEXP4; (C) FaEXP5. Diferentes condiciones (control (C) y tratados con UV-C (T)) y tiempos de almacenaje a 20 °C (0, 4, 18, 24 y 48 h) se muestran en la parte superior y las sondas utilizadas (FaEXP2, FaEXP4, FaEXP5 o ARNr 18S) en la parte izquierda de la figura

FaEXP 2 ARNr 18S

FaEXP 4 ARNr 18S

FaEXP 5 ARNr 18S

C T

0 h

C T

4 h

C T

18 h

C T

24 h

C T

48 h

(A)

(B)

(C)

51 Para completar los estudios de expresión de FaCel1, decidimos analizar cómo se comportaba la actividad de la enzima frente al tratamiento con UV-C. Se pudo detectar actividad endo-β-1,4-glucanasa en ambas condiciones, frutos controles y tratados con UV- C, en los 3 tiempos de almacenamiento analizados (0, 24 y 48 h; Figura 20). Se detectó una actividad enzimática significativamente (P<0,05) reducida en los frutos irradiados después de 24 h de almacenamiento a 20 °C. Luego, la misma decreció en ambos grupos de frutos controles y tratados, sin observarse diferencias significativas entre ellos.

Figura 19: Expresión de FaCel1 durante la maduración de frutillas del cultivar Aroma (A) y después del tratamiento con UV-C (B). En la parte superior de la figura se indican los estadios analizados (verde pequeño (VP), verde grande (VG), blanco (BL), 25% rojo (25), 50% rojo (50), 75% rojo (75), 100% rojo (100) y sobremaduro (SM)), y las diferentes condiciones (control (C) y tratado con UV-C (T)) a distintos tiempos de almacenamiento a 20 °C (0, 4, 8, 24, 48, 72 y 96 h). Las sondas utilizadas (FaCel1 o ARNr 18S) se indican a la izquierda de la figura.

A

B

FaCel 1 ARNr 18S

VP VG BL 25 50 75 100 SM

FaCel 1 ARNr 18S

C T

0 h

C T

4 h

C T

8 h

C T

24 h

C T

48 h

C T

72 h

C T

96 h

52 2.2.3. Expresión de FaPE1 y actividad pectin-metilesterasa (PME)

En el caso de pectin-metilesterasa, no se pudo detectar ARN mensajero de FaPE1 utilizando la técnica de Northern blot, por lo cual se analizó la expresión de este gen mediante RT-PCR semicuantitativa. El análisis de la expresión de FaPE1 durante la maduración de la variedad Aroma indicó la presencia de transcriptos a partir del estadio blanco (Figura 21A). La expresión del gen decreció en el 25% rojo y alcanzó su nivel más bajo en el estadio 50%. Luego, la señal detectada aumentó hasta alcanzar niveles elevados en el estadio 75% que se mantuvieron similares hasta el final de la maduración (Figura 21A). Estos resultados son similares a los reportados por Castillejo y col. (2004) en la variedad Chandler, donde también se encontró un doble pico en la expresión de FaPE1 a lo largo de la maduración.

Por otro lado, el perfil de expresión de este gen no mostró importantes diferencias entre los frutos controles y los tratados durante el almacenamiento. La única diferencia observada fue una leve disminución en la expresión después de 4 h de finalizada la

Figura 20: Efecto del tratamiento con UV-C sobre la actividad endo-β-1,4- glucanasa. Se irradiaron frutillas (50% R) con UV-C (4,1 KJ m^-2), y luego se almacenaron a 20 °C durante 0, 24 y 48 h. La actividad de la enzima se expresó en micromoles de glucosa por segundo y por kilogramo de fruto. El doble asterisco indica que los valores son estadísticamente diferentes de su correspondiente control a P<0,01.

Tiempo (h)

0 24 48

Actividad endo--1,4-glucanasa mol s-1 kg-1 )

0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025

Control UV-C

**

53 irradiación. En los restantes tiempo analizados, la expresión del gen permaneció sin variaciones tanto en controles como en tratados (Figura 21B).

En lo que respecta a la actividad de la enzima, inmediatamente después del tratamiento (0 h), la actividad PME fue significativamente (P<0,05) más baja en los frutos irradiados con UV-C con respecto a sus correspondientes controles (Figura 22). No obstante, después de 24 y 48 h no se encontraron diferencias entre controles y tratados.

Figura 21: Expresión de FaPE1 durante la maduración de frutillas Aroma (A) y después del tratamiento con UV-C (B). En la parte superior de la figura se indican los estadios analizados (verde grande (VG), blanco (BL), 25% rojo (25), 50% rojo (50), 75% rojo (75), 100% rojo (100) y sobremaduro (SM)), diferentes condiciones (control (C) y tratado con UV-C (T)) y tiempos de almacenamiento a 20 °C (0, 4, 18, 24 y 48 h). Las sondas utilizadas (FaPE1 o ARNr 18S) se indican en la parte izquierda de la figura.

A

B

FaPE 1 ARNr 18S

C T

0 h

C T

4 h

C T

18 h

C T

24 h

C T

48 h ARNr 18S

FaPE 1

VG BL 25 50 75 100 SM

54 2.2.4. Expresión de FaPG1 y actividad poligalacturonasa

La expresión de FaPG1 fue muy baja en todos los estadios de maduración analizados del cultivar Aroma. Cabe destacar, que se debieron utilizar membranas conteniendo el doble de ARN (20 μg, ver Materiales y Métodos 6) de lo utilizado en el resto de los ensayos de expresión. A pesar de esto, sólo se encontraron transcriptos de FaPG1 principalmente en los frutos de estadio 100% rojos, aunque también se detectó una leve señal en el estadio 50% y 75% rojo (Figura 23A).

Figura 22: Efecto del tratamiento con UV-C sobre la actividad pectin- metilesterasa (PME). Se irradiaron frutillas (50% R) con UV-C (4,1 KJ m^-2), y luego se almacenaron a 20 °C durante 0, 24 y 48 h. La actividad de la enzima se expresó en micromoles de ácido galacturónico por segundo y por kilogramo de fruto. El doble asterisco indica que los valores son estadísticamente diferentes de su correspondiente control a P<0,05.

Tiempo (h)

0 h 24 h 48 h

Actividad PME (mol s-1 kg-1 )

0 1 2 3 4 5

Control UV-C

**

55 De modo similar a lo realizado para los otros genes de pared, frutos en el estadio 50% rojo se irradiaron con UV-C, y se analizó posteriormente el efecto sobre la expresión de FaPG1 (Figura 23B). En este caso, los frutos controles mostraron baja expresión durante las primeras 24 h a 20 °C, excepto por un leve incremento después de las 8 h.

Posteriomente, el nivel de transcriptos FaPG1 permaneció aproximadamente constante durante las restantes 96 h de almacenamiento (Figura 23B). De manera contraria a lo observado para los controles, la expresión del gen en los frutos tratados fue baja durante las primeras 8 h después de la irradiación, pero se incrementó a un nivel más elevado que los controles después de 48 h de almacenamiento. Finalmente, a las 72 y 96 h, la expresión en frutos controles y tratados permaneció en niveles similares.

En cuanto a la actividad de la enzima, en el caso de PG, el tratamiento no afectó significativamente su actividad en las primeras 24 h después de la irradiación. Sin embargo, después de 48 h de almacenamiento a 20 °C, la actividad PG se redujo a la mitad en los frutos tratados con respecto a los valores obtenidos en el control (Figura 24).

Figura 23: Expresión de FaPG1 durante la maduración de Aroma (A) y después del tratamiento con UV-C (B). Los estadios analizados (verde pequeño (VP), verde grande (VG), blanco (BL), 25% rojo (25), 50% rojo (50), 75% rojo (75), 100% rojo (100) y sobremaduro (SM)), diferentes condiciones (control (C) y tratado con UV-C (T)) y tiempos de almacenamiento a 20 °C (0, 4, 8, 24, 48, 72 y 96 h) se muestran en la parte superior de la figura. Las sondas utilizadas (FaPG1 o ARNr 18S) se muestran en la parte izquierda de la figura.

FaPG 1 ARNr 18S

C T

0 h

C T

4 h

C T

8 h

C T

24 h

C T

48 h

C T

72 h

C T

96 h FaPG 1

ARNr 18S

VP VG BL 25 50 75 100 SM

A

B

56 Figura 24: Efecto del tratamiento con UV-C sobre la actividad poligalacturonasa total (PG). Se irradiaron frutillas (50% R) con UV-C (4,1 KJ m^-2), y luego se almacenaron a 20 °C durante 0, 24 y 48 h. La actividad de la enzima se expresó en micromoles de ácido galacturónico por segundo y por kilogramo de fruto. El asterisco indica que los valores son estadísticamente diferentes de su correspondiente control a P<0,01.

Tiempo (h)

0 24 48

Actividad PG total (mol s-1 kg-1 )

0,000 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005

Control UV-C

*

57 3. Discusión

La degradación de la pared celular ha sido considerada el principal factor involucrado en el ablandamiento de los frutos carnosos. Esta degradación de los componentes de la pared celular está relacionada con la acción de diversas enzimas y proteínas que actúan sobre la misma (Brummell y Harpster 2001). En frutilla, estudios realizados en los que se compararon diferentes variedades que poseen firmeza contrastante, revelaron que existen diferencias en el metabolismo de la pared celular, principalmente en la depolimerización y solubilización de pectinas (Rosli y col. 2004), y en la expresión de genes que modifican la pared celular en las distintas variedades (Salentijn y col. 2003). En particular, se reportaron datos que indican que existe una correlación entre una expresión más alta y temprana de tres genes de expansinas que se expresan en frutos, FaEXP1, FaEXP2 y FaEXP5, con un mayor ablandamiento de los mismos (Dotto y col. 2006).

En este trabajo se utilizaron frutillas de la variedad Aroma, cuya firmeza varía desde 3,4 N en el estadio 50% rojo hasta 2,9 N en el estadio 100% rojo (Figura 16), lo cual indica que la variedad produce frutos bastante firmes, con valores de firmeza intermedios entre los correspondientes a las variedades Selva y Camarosa, estudiadas previamente en nuestro laboratorio (Dotto y col. 2006). Dado que los perfiles de expresión de este tipo de genes durante la maduración dependen de la variedad analizada, y que no existían datos bibliográficos, primero se analizó la expresión de los genes de interés durante la maduración de frutos de la variedad Aroma. La expresión de FaEXP2 y FaEXP5 es específica del fruto y se incrementa en los estadios tardíos de maduración (Civello y col.

1999; Harrison y col. 2001), mientras que FaEXP4 se expresa no sólo en el fruto sino también en otros tejidos de la planta (Harrison y col. 2001). En la figura 17, se puede observar que la expresión de FaEXP2 y FaEXP5 en la variedad Aroma se incrementó durante la maduración, mientras que el mensajero de FaEXP4 pudo ser detectado en todos los estadios desde el verde pequeño (VP) hasta el sobremaduro (SM) con leves diferencias de intensidad entre ellos. De esta manera, se podría decir que los perfiles de expresión de los genes de expansinas analizados en este trabajo, son similares a aquellos reportados para Selva, otro cultivar firme con baja tasa de ablandamiento (Dotto y col.

2006). Además de las expansinas, se analizaron los patrones de expresión de otras tres enzimas de degradación de la pared celular. En el caso de FaCel1, sus transcriptos son

58 detectables tempranamente en el desarrollo del fruto en el estadio blanco (BL) y se acumulan hasta su nivel máximo en el 100% rojo (figura 19A). Este patrón de expresión coincide con los obtenidos para otras variedades de frutilla (Harpster y col. 1998; Trainotti y col. 1999; Llop-Tous y col. 1999). El análisis de la expresión de FaPE1, en este caso por RT-PCR semicuantitativa, indicó la presencia de dos picos de acumulación de transcriptos, uno en el estadio blanco y otro en el 100% rojo (Figura 21A). Este resultado concuerda con los obtenidos para una variedad más blanda, denominada Chandler (Castillejo y col.

2004). Por último, los transcriptos de FaPG1 fueron casi indetectables en los estadios 50%

y 75% rojo y sólo se observó una señal clara en el 100% (Figura 23A). El gen de FaPG1 fue aislado a partir de una biblioteca de ADN complementario construida a partir de frutos de la variedad Chandler (Villarreal y col. 2007), y su secuencia es homóloga a la del clon genómico spG (Redondo-Nevado y col. 2001) y a la del ADNc denominado D15 (Salentijn y col. 2003). Estas tres secuencias son casi idénticas, lo que sugiere que pertenecen al mismo gen, pero los patrones de expresión reportados difieren sustancialmente.

Mientras Redondo-Nevado y col. (2001) detectaron expresión de spG solamente en el estadio blanco y sugieren que el gen podría estar involucrado en la producción de oligosacarinas en vez de en la degradación de pectinas, tanto la expresión de D15 como la de FaPG1 se incrementan durante la maduración en cuatro cultivares diferentes de frutilla (Salentijn y col. 2003; Villarreal y col. 2007). Además, los niveles más altos de transcriptos se encontraron en las variedades más blandas (Salentijn y col. 2003; Villarreal y col. 2007). De esta manera, la baja expresión de FaPG1 que encontramos en la variedad Aroma correlaciona con la firmeza alta encontrada en este cultivar, y está de acuerdo con la idea de que la actividad de PG tiene un rol determinante en la firmeza de frutilla, a diferencia de lo que se creía anteriormente.

Por otro lado, en diversos trabajos se ha detectado que el tratamiento con UV-C retrasa la maduración y mantiene la firmeza durante la postcosecha de frutos de distintas especies. En durazno, por ejemplo, la irradiación con UV-C redujo el ablandamiento de los frutos durante el almacenamiento a 5 °C seguido de 7 días a 20 °C (Gonzalez-Aguilar y col.

2004). Similares resultados se obtuvieron en pimiento (Vicente y col. 2005b), tomate (Maharaj y col. 1999; Barka y col. 2000) y boysenberry (hibrido de Rubus) (Vicente y col.

2004). En el caso de frutilla, diferentes dosis de UV-C (1 y 4,1 KJ/m²) redujeron el ablandamiento de los frutos en las variedades Kent y Seascape, respectivamente (Baka y

59 col. 1999; Pan y col. 2004). Los experimentos realizados en el presente trabajo se llevaron a cabo irradiando frutos (50% rojo) con una dosis de UV-C de 4,1 KJ m^-2, y evaluando posteriormente los efectos del tratamiento durante 4 días de almacenamiento a 20 °C.

Cuando se compararon estos frutos con sus respectivos controles, se encontró que las frutillas tratadas permanecían más firmes. Para poder estudiar cuál era el efecto del UV-C sobre el ablandamiento de los frutos a nivel molecular, analizamos qué ocurría con las enzimas involucradas en la degradación de la pared celular durante la maduración. En tomate, Barka y col. (2000) reportaron que el incremento de actividad de un grupo de enzimas que degradan pared celular (poligalacturonasa, pectin-metilesterasa, celulasa, xilanasa y β-D-galactosidasa) durante el almacenamiento, se redujo significativamente en los frutos tratados con UV-C. Los mismos autores sugirieron que el retraso en el ablandamiento en los frutos irradiados podría ser debido a una menor degradación de la pared celular, y que estas enzimas eran los posibles blancos de la irradiación con UV-C.

Hasta el momento, muy pocos estudios han analizado el problema a nivel de expresión de proteínas en frutos, y ninguno a nivel de acumulación de transcriptos.

Tal como se describió previamente, el tratamiento con UV-C afectó la expresión de tres genes de expansinas (FaEXP2, FaEXP4 y FaEXP5). Además, algunas de las diferencias encontradas entre los controles y los frutos irradiados se observaron al comienzo del experimento. Los frutos controles mostraron un incremento de los tres transcriptos de expansinas durante las primeras horas después de la cosecha. En cambio, el tratamiento con UV-C previno dicho incremento de la expresión de las tres expansinas.

Particularmente, el efecto fue visible para la expresión de FaEXP2 y FaEXP5, 4 h después de la exposición a la luz UV-C (Figura 18). Estos dos genes de expansinas (FaEXP2 y FaEXP5) se expresan específicamente durante la maduración de frutos, de manera que existe una correlación positiva entre sus niveles de expresión y el ablandamiento de los frutos (Dotto y col. 2006). Hasta el momento se ha postulado que las expansinas contribuyen a la relajación de la pared celular mediante la ruptura de los puentes de hidrógeno que existen entre las microfibrillas de celulosa y los xiloglucanos (Brummell y Harpster 2001). Esta acción también facilitaría el acceso de enzimas que degradan la pared celular a sus sustratos naturales, incrementando el ablandamiento del fruto (Rose y col. 1997). De esta manera, la reducción en la expresión de genes de expansinas provocada por el tratamiento con UV-C podría disminuir el efecto de estas proteínas

60 sobre la pared celular y, por otro lado, retrasar el acceso de otras enzimas a sus respectivos sustratos presentes en la pared celular.

A diferencia de lo observado para las expansinas, el efecto de la irradiación sobre la expresión de FaCel1 fue más duradero, ya que se redujeron los niveles de transcriptos aun después de 24 horas de almacenamiento (Figura 19B). Después de transcurrido este tiempo, el nivel de expresión del gen se incrementó con respecto a sus respectivos controles. En cambio, la medición de la actividad enzimática reveló que la irradiación redujo la actividad endoglucanasa después de 24 h de almacenamiento, aunque la actividad fue similar en frutos controles y tratados después de 48 h a 20 °C (Figura 20). En tomate, el tratamiento con UV-C disminuyó la actividad endoglucanasa durante el almacenamiento (Barka y col. 2000), lo que podría llevar a una menor modificación de los xiloglucanos, ya que ha sido propuesto que la enzima endo-β-1,4-glucanasa actúa in vivo, degradando xiloglucanos y celulosa no cristalina (Llop-Tous y col. 1999).

La de-esterificación de poliurónidos por las pectinesterasas puede incrementar la rigidez de la pared celular debido a que provee de nuevos sitios de interacción para el ión Ca⁺², favoreciendo la agregación de poliurónidos formando una estructura de tipo gel. Sin embargo, esta misma de-esterificación hace que los poliurónidos sean más suceptibles a la degradación por enzimas pectinolíticas, tales como poligalacturonasa y pectato liasa (Brummell y Harpster 2001), ya que estas enzimas actúan preferentemente sobre sustratos demetilados. En nuestro trabajo analizamos la expresión del gen fruto específico FaPE1 utilizando la técnica de RT-PCR semicuantitativa. La expresión fue levemente afectada por la irradiación, decreciendo los niveles de transcriptos sólo después de 4 h de irradiados los frutos (Figura 21B). Los frutos tratados también mostraron una menor actividad PME inmediatamente después del tratamiento (Figura 22). De esta manera, la leve reducción de la expresión de FaPE1 en los frutos tratados después de la irradiación, junto con la reducción en la actividad PME, podría disminuir la afinidad por sus sustratos de otras enzimas que modifican la pared celular, contribuyendo a reducir el ablandamiento del fruto.

En cuanto a FaPG1, la expresión observada de este gen es muy baja en la variedad Aroma, en concordancia con lo hallado en otras variedades firmes como Selva y Camarosa (Villarreal y col. 2007). La irradiación con UV-C modificó la expresión de FaPG1 de forma variada, en algunos tiempos de almacenamiento la expresión se incrementó en los frutos

61 tratados (24 y 48 h) y en otros decreció (8 h) (Figura 23B). Este patrón encontrado para la expresión del gen, no correlaciona con el efecto del tratamiento sobre la actividad de la enzima (Figura 24). La irradiación no modificó la actividad PG incluso hasta 24 h después del tratamiento, pero después de 48 h los frutos tratados exhibieron una menor actividad. Con respecto a la sonda utilizada para el análisis de FaPG1, la misma reconoce, en otros cultivares, no solo a FaPG1 sino también a T-PG. Este último codifica para un mensajero más corto (idéntica a FaPG1 excepto por 85 pb) que resultaría en una proteína truncada carente de actividad PG y que se acumula en las variedades más firmes (Villarreal y col. 2007). Además, recientes reportes mostraron la existencia de otro gen correspondiente a una poligalacturonasa de frutilla (FaPG2) cuyo mensajero también se acumula durante la maduración del fruto (Quesada y col. 2009). La existencia de varios mensajeros diferentes podría explicar, al menos parcialmente, la falta de correlación entre la actividad enzimática y los datos de transcripción. Cabe destacar, que cuando medimos actividad PG total estamos detectando tanto las exo- como las endo-PGs. En concordancia con nuestros resultados, Barka y col. (2000) reportaron una reducción en la actividad PG cuando frutos de tomate fueron irradiados con UV-C. Particularmente en frutilla, se detectó una importante solubilización y depolimerización de pectinas al final de la maduración de los frutos, principalmente en los frutos más blandos (Rosli y col.

2004). De esta manera, una reducción en la actividad PG podría disminuir la depolimerización de pectinas durante la maduración, lo que contribuiría a la mayor firmeza encontrada en los frutos irradiados.

En resumen, en esta parte del trabajo encontramos que la irradiación con UV-C retrasa el ablandamiento durante la maduración de las frutillas almacenadas. El tratamiento también cambió los perfiles de expresión de diferentes genes que codifican enzimas y proteínas que modifican la pared celular. Los frutos tratados mostraron una menor expresión de FaEXP2, FaEXP4, FaEXP5 y FaPE1 después de las 4 h, de FaCel1 durante las primeras 24 h, y de FaPG1 después de 8 h post-irradiación con UV-C. Además, el nivel de transcriptos de las tres expansinas se incrementó por encima del nivel encontrado en sus respectivos controles después de 24 h, y en el caso de FaCel1 y FaPG1 el incremento ocurrió también más tarde (48 h). La medida de actividad de las distintas enzimas indicó que el tratamiento disminuyó la actividad de PG, endoglucanasa y PME a diferentes tiempos de almacenamiento. La irradiación no provocó, en ninguno de los