Discusión

57

58 detectables tempranamente en el desarrollo del fruto en el estadio blanco (BL) y se acumulan hasta su nivel máximo en el 100% rojo (figura 19A). Este patrón de expresión coincide con los obtenidos para otras variedades de frutilla (Harpster y col. 1998; Trainotti y col. 1999; Llop-Tous y col. 1999). El análisis de la expresión de FaPE1, en este caso por RT-PCR semicuantitativa, indicó la presencia de dos picos de acumulación de transcriptos, uno en el estadio blanco y otro en el 100% rojo (Figura 21A). Este resultado concuerda con los obtenidos para una variedad más blanda, denominada Chandler (Castillejo y col.

2004). Por último, los transcriptos de FaPG1 fueron casi indetectables en los estadios 50%

y 75% rojo y sólo se observó una señal clara en el 100% (Figura 23A). El gen de FaPG1 fue aislado a partir de una biblioteca de ADN complementario construida a partir de frutos de la variedad Chandler (Villarreal y col. 2007), y su secuencia es homóloga a la del clon genómico spG (Redondo-Nevado y col. 2001) y a la del ADNc denominado D15 (Salentijn y col. 2003). Estas tres secuencias son casi idénticas, lo que sugiere que pertenecen al mismo gen, pero los patrones de expresión reportados difieren sustancialmente.

Mientras Redondo-Nevado y col. (2001) detectaron expresión de spG solamente en el estadio blanco y sugieren que el gen podría estar involucrado en la producción de oligosacarinas en vez de en la degradación de pectinas, tanto la expresión de D15 como la de FaPG1 se incrementan durante la maduración en cuatro cultivares diferentes de frutilla (Salentijn y col. 2003; Villarreal y col. 2007). Además, los niveles más altos de transcriptos se encontraron en las variedades más blandas (Salentijn y col. 2003; Villarreal y col. 2007). De esta manera, la baja expresión de FaPG1 que encontramos en la variedad Aroma correlaciona con la firmeza alta encontrada en este cultivar, y está de acuerdo con la idea de que la actividad de PG tiene un rol determinante en la firmeza de frutilla, a diferencia de lo que se creía anteriormente.

Por otro lado, en diversos trabajos se ha detectado que el tratamiento con UV-C retrasa la maduración y mantiene la firmeza durante la postcosecha de frutos de distintas especies. En durazno, por ejemplo, la irradiación con UV-C redujo el ablandamiento de los frutos durante el almacenamiento a 5 °C seguido de 7 días a 20 °C (Gonzalez-Aguilar y col.

2004). Similares resultados se obtuvieron en pimiento (Vicente y col. 2005b), tomate (Maharaj y col. 1999; Barka y col. 2000) y boysenberry (hibrido de Rubus) (Vicente y col.

2004). En el caso de frutilla, diferentes dosis de UV-C (1 y 4,1 KJ/m²) redujeron el ablandamiento de los frutos en las variedades Kent y Seascape, respectivamente (Baka y

59 col. 1999; Pan y col. 2004). Los experimentos realizados en el presente trabajo se llevaron a cabo irradiando frutos (50% rojo) con una dosis de UV-C de 4,1 KJ m^-2, y evaluando posteriormente los efectos del tratamiento durante 4 días de almacenamiento a 20 °C.

Cuando se compararon estos frutos con sus respectivos controles, se encontró que las frutillas tratadas permanecían más firmes. Para poder estudiar cuál era el efecto del UV-C sobre el ablandamiento de los frutos a nivel molecular, analizamos qué ocurría con las enzimas involucradas en la degradación de la pared celular durante la maduración. En tomate, Barka y col. (2000) reportaron que el incremento de actividad de un grupo de enzimas que degradan pared celular (poligalacturonasa, pectin-metilesterasa, celulasa, xilanasa y β-D-galactosidasa) durante el almacenamiento, se redujo significativamente en los frutos tratados con UV-C. Los mismos autores sugirieron que el retraso en el ablandamiento en los frutos irradiados podría ser debido a una menor degradación de la pared celular, y que estas enzimas eran los posibles blancos de la irradiación con UV-C.

Hasta el momento, muy pocos estudios han analizado el problema a nivel de expresión de proteínas en frutos, y ninguno a nivel de acumulación de transcriptos.

Tal como se describió previamente, el tratamiento con UV-C afectó la expresión de tres genes de expansinas (FaEXP2, FaEXP4 y FaEXP5). Además, algunas de las diferencias encontradas entre los controles y los frutos irradiados se observaron al comienzo del experimento. Los frutos controles mostraron un incremento de los tres transcriptos de expansinas durante las primeras horas después de la cosecha. En cambio, el tratamiento con UV-C previno dicho incremento de la expresión de las tres expansinas.

Particularmente, el efecto fue visible para la expresión de FaEXP2 y FaEXP5, 4 h después de la exposición a la luz UV-C (Figura 18). Estos dos genes de expansinas (FaEXP2 y FaEXP5) se expresan específicamente durante la maduración de frutos, de manera que existe una correlación positiva entre sus niveles de expresión y el ablandamiento de los frutos (Dotto y col. 2006). Hasta el momento se ha postulado que las expansinas contribuyen a la relajación de la pared celular mediante la ruptura de los puentes de hidrógeno que existen entre las microfibrillas de celulosa y los xiloglucanos (Brummell y Harpster 2001). Esta acción también facilitaría el acceso de enzimas que degradan la pared celular a sus sustratos naturales, incrementando el ablandamiento del fruto (Rose y col. 1997). De esta manera, la reducción en la expresión de genes de expansinas provocada por el tratamiento con UV-C podría disminuir el efecto de estas proteínas

60 sobre la pared celular y, por otro lado, retrasar el acceso de otras enzimas a sus respectivos sustratos presentes en la pared celular.

A diferencia de lo observado para las expansinas, el efecto de la irradiación sobre la expresión de FaCel1 fue más duradero, ya que se redujeron los niveles de transcriptos aun después de 24 horas de almacenamiento (Figura 19B). Después de transcurrido este tiempo, el nivel de expresión del gen se incrementó con respecto a sus respectivos controles. En cambio, la medición de la actividad enzimática reveló que la irradiación redujo la actividad endoglucanasa después de 24 h de almacenamiento, aunque la actividad fue similar en frutos controles y tratados después de 48 h a 20 °C (Figura 20). En tomate, el tratamiento con UV-C disminuyó la actividad endoglucanasa durante el almacenamiento (Barka y col. 2000), lo que podría llevar a una menor modificación de los xiloglucanos, ya que ha sido propuesto que la enzima endo-β-1,4-glucanasa actúa in vivo, degradando xiloglucanos y celulosa no cristalina (Llop-Tous y col. 1999).

La de-esterificación de poliurónidos por las pectinesterasas puede incrementar la rigidez de la pared celular debido a que provee de nuevos sitios de interacción para el ión Ca⁺², favoreciendo la agregación de poliurónidos formando una estructura de tipo gel. Sin embargo, esta misma de-esterificación hace que los poliurónidos sean más suceptibles a la degradación por enzimas pectinolíticas, tales como poligalacturonasa y pectato liasa (Brummell y Harpster 2001), ya que estas enzimas actúan preferentemente sobre sustratos demetilados. En nuestro trabajo analizamos la expresión del gen fruto específico FaPE1 utilizando la técnica de RT-PCR semicuantitativa. La expresión fue levemente afectada por la irradiación, decreciendo los niveles de transcriptos sólo después de 4 h de irradiados los frutos (Figura 21B). Los frutos tratados también mostraron una menor actividad PME inmediatamente después del tratamiento (Figura 22). De esta manera, la leve reducción de la expresión de FaPE1 en los frutos tratados después de la irradiación, junto con la reducción en la actividad PME, podría disminuir la afinidad por sus sustratos de otras enzimas que modifican la pared celular, contribuyendo a reducir el ablandamiento del fruto.

En cuanto a FaPG1, la expresión observada de este gen es muy baja en la variedad Aroma, en concordancia con lo hallado en otras variedades firmes como Selva y Camarosa (Villarreal y col. 2007). La irradiación con UV-C modificó la expresión de FaPG1 de forma variada, en algunos tiempos de almacenamiento la expresión se incrementó en los frutos

61 tratados (24 y 48 h) y en otros decreció (8 h) (Figura 23B). Este patrón encontrado para la expresión del gen, no correlaciona con el efecto del tratamiento sobre la actividad de la enzima (Figura 24). La irradiación no modificó la actividad PG incluso hasta 24 h después del tratamiento, pero después de 48 h los frutos tratados exhibieron una menor actividad. Con respecto a la sonda utilizada para el análisis de FaPG1, la misma reconoce, en otros cultivares, no solo a FaPG1 sino también a T-PG. Este último codifica para un mensajero más corto (idéntica a FaPG1 excepto por 85 pb) que resultaría en una proteína truncada carente de actividad PG y que se acumula en las variedades más firmes (Villarreal y col. 2007). Además, recientes reportes mostraron la existencia de otro gen correspondiente a una poligalacturonasa de frutilla (FaPG2) cuyo mensajero también se acumula durante la maduración del fruto (Quesada y col. 2009). La existencia de varios mensajeros diferentes podría explicar, al menos parcialmente, la falta de correlación entre la actividad enzimática y los datos de transcripción. Cabe destacar, que cuando medimos actividad PG total estamos detectando tanto las exo- como las endo-PGs. En concordancia con nuestros resultados, Barka y col. (2000) reportaron una reducción en la actividad PG cuando frutos de tomate fueron irradiados con UV-C. Particularmente en frutilla, se detectó una importante solubilización y depolimerización de pectinas al final de la maduración de los frutos, principalmente en los frutos más blandos (Rosli y col.

2004). De esta manera, una reducción en la actividad PG podría disminuir la depolimerización de pectinas durante la maduración, lo que contribuiría a la mayor firmeza encontrada en los frutos irradiados.

En resumen, en esta parte del trabajo encontramos que la irradiación con UV-C retrasa el ablandamiento durante la maduración de las frutillas almacenadas. El tratamiento también cambió los perfiles de expresión de diferentes genes que codifican enzimas y proteínas que modifican la pared celular. Los frutos tratados mostraron una menor expresión de FaEXP2, FaEXP4, FaEXP5 y FaPE1 después de las 4 h, de FaCel1 durante las primeras 24 h, y de FaPG1 después de 8 h post-irradiación con UV-C. Además, el nivel de transcriptos de las tres expansinas se incrementó por encima del nivel encontrado en sus respectivos controles después de 24 h, y en el caso de FaCel1 y FaPG1 el incremento ocurrió también más tarde (48 h). La medida de actividad de las distintas enzimas indicó que el tratamiento disminuyó la actividad de PG, endoglucanasa y PME a diferentes tiempos de almacenamiento. La irradiación no provocó, en ninguno de los

62 casos, un incremento en las actividades de estas enzimas. De esta manera, de acuerdo con los resultados obtenidos, la irradiación con UV-C retrasa el ablandamiento en frutilla probablemente reduciendo la expresión de un grupo de genes, los cuales están involucrados en el desensamblaje de la pared celular. La reducción de la expresión de estos genes al nivel de la transcripción se observó durante las primeras horas posteriores al tratamiento, mientras que la reducción de la actividad enzimática de las proteínas correspondientes se produjo al inicio del tratamiento en el caso de PME, o luego de uno y dos días de almacenamiento para endoglucanas y PG, respectivamente.

CAPITULO II

“EFECTO DEL TRATAMIENTO CON UV-C SOBRE LA DEFENSA

CONTRA PATÓGENOS”

64 Capítulo II: “Efecto del tratamiento con UV-C sobre la defensa contra patógenos”

1. Introducción

Como se mencionó en el capítulo I, la degradación de la pared celular de los frutos es uno de los principales factores que provocan el ablandamiento de los mismos. A su vez, esta degradación y ablandamiento generan una mayor susceptibilidad de los frutos a la infección por organismos patógenos. Esta interacción entre desensamblaje de la pared y susceptibilidad a patógenos quedó evidenciada cuando al suprimirse simultáneamente dos genes que codifican para enzimas que degradan la pared celular en tomate (LePG y LeExp1) se obtuvo una reducida susceptibilidad a Botrytis cinerea (Cantu y col. 2008).

Los principales patógenos que pueden atacar los frutos son Botrytis cinerea, Rhizopus stolonifer, Mucor mucedo y Colletotrichum dematium. En el caso de frutilla, Botrytis cinerea es uno de los hongos que produce mayores pérdidas durante los períodos de producción y postcosecha del fruto.

1.1. La podredumbre negra causada por Botrytis cinerea

Botrytis cinerea (telomorfo: Botryotinia fuckeliana) es un patógeno de plantas con un estilo de vida necrotrófico, que causa serias pérdidas en más de 200 cultivos alrededor del mundo. Este hongo es principalmente destructivo sobre tejidos senescentes o maduros de las dicotiledóneas, pero generalmente entra en los mismos, en estadios tempranos de desarrollo y permanece quiescente por un considerable período de tiempo.

Posteriormente, cuando el ambiente es propicio y la fisiología del hospedador cambia se desarrolla la enfermedad (Williamson y col. 2007).

Los cultivos más afectados por este hongo incluyen vegetales como repollo, lechuga, brócoli y pequeños frutos como uva, frutilla, arándano y frambuesa. También puede afectar a kiwi, manzanas y peras. Es importante destacar que esta enfermedad es difícil de controlar ya que posee una amplia variedad de modos de ataque, diversos hospedadores como fuente de inóculo y la posibilidad de sobrevivir como micelio y/o conidio y por largos períodos de tiempo en forma de esclerocio sobre desechos vegetales (Williamson y col. 2007). Entre los síntomas más comunes se encuentra el desarrollo de una podredumbre blanda, acompañada por colapso y pérdida de agua de los tejidos del parénquima, seguido de una rápida aparición de masas grises de conidios (Figura 25A y

65 B). En el caso de frutos con pieles gruesas, como por ejemplo kiwi, estos síntomas son recién evidentes cuando se los corta y se observa su interior. Al afectar los pétalos de las flores, el daño producido por el hongo varía desde pequeñas manchas hasta una gran podredumbre de los tejidos, dependiendo de las condiciones ambientales (Figura 25C).

El ciclo de vida de Botrytis cinerea incluye dos estadios (Figura 26): uno vegetativo y uno reproductivo. El estadio vegetativo, comprende al micelio capaz de producir conidios asexuales (estrictamente macroconidios del estadio anamorfo de Botrytis), esclerocios y microconidios (espermatidas) (Elad y col. 2007). Los esclerocios se desarrollan dentro de los tejidos muertos del hospedador y representan un importante mecanismo de supervivencia del hongo. Estas estructuras comienzan a crecer en primavera en las regiones templadas para producir conidióforos (Figura 27C) y conidios multinucleados (Figura 27D), los que sirven como fuente primaria de inóculo dentro de los cultivos.

A B

C

Figura 25: Síntomas producidos por Botrytis cinerea en (A) frutilla (B) frambuesas y (C) pétalos de rosa.

66 El micelio también sobrevive dentro de los restos del hospedador muerto y dentro de algunas semillas. En los cultivos perennes, las hojas muertas, flores y frutos momificados contienen masas de micelios que en las condiciones adecuadas pueden producir conidios e iniciar la infección. Además, el patógeno puede formar microconidios en los cultivos vegetales viejos, que funcionan como espermátidas. De esta manera, el ciclo sexual involucra la espermatización de los esclerocios, llevando a la producción de apotecios (Figura 27A) y ascos con ocho ascosporas (Figura 27B) producidas luego de la meiosis (Williamson y col. 2007). Los conocimientos sobre el ciclo sexual de este hongo son escasos debido a que es muy raro encontrar estructuras sexuales en la naturaleza, aunque se puede lograr bajo ciertas condiciones en el laboratorio (Elad y col. 2007).

Conidióforo Conidios

Esporas sobre la superficie del fruto

Comienzo de la podredumbre Ciclo de

verano

Ciclo de invierno

Esclerocio Micelio

Germinación

Figura 26: Ciclo de vida a través del cual se propaga Botrytis cinerea.

67 Como se mencionó anteriormente, Botrytis es un hongo necrotrófico. Esto significa que durante el proceso de invasión provoca la muerte de las células hospedadoras. El ciclo de la enfermedad, comienza con la ubicación de un conidio sobre la superficie hospedadora, el cual germina y desarrolla un apresorio que facilita su penetración en los tejidos. Esta invasión puede ser llevada a cabo por penetración activa o ingreso pasivo. Por un lado, Botrytis es un hongo oportunista que puede iniciar la infección a través de heridas o sitios previamente infectados por otros patógenos, pero también es perfectamente capaz de penetrar superficies intactas. La penetración de la cutícula y epidermis desencadena una explosión oxidativa en la interfase planta-hongo que promueve el progreso de la enfermedad (Williamson y col. 2007). Una vez que ha penetrado la pared celular de la epidermis, el hongo produce varias enzimas que degradan la pared celular del hospedador provocando su ruptura con la consiguiente liberación de carbohidratos que sirven de fuente de carbono para el patógeno (Elad y col.

2007).

A B

D C

Figura 27: Estructuras reproductivas sexuales (A y B) y asexuales (C y D) que forman parte del ciclo de vida de Botrytis cinerea. (A) Apotecios; (B) Ascos con ascosporas; (C) Conidióforo; (D) Conidio germinando.

68 1.2. Mecanismos de defensa de las plantas

Las plantas disponen de un amplio espectro de mecanismos de defensa en respuesta al ataque de agentes patógenos. Esta respuesta coincide frecuentemente con una gran producción de especies reactivas de oxigeno (ROS), proceso conocido como explosión oxidativa, que está asociada a una necrosis en el sitio de invasión. Esta respuesta defensiva se denomina respuesta hipersensible, o HR, y confiere resistencia a un amplio rango de patógenos biotróficos (Elad y col. 2007). Sin embargo, este mecanismo no es completamente efectivo contra patógenos necrotróficos y actualmente existen evidencias que sugieren que los mismos se verían beneficiados, ya que la necrosis producida en el tejido vegetal favorece la colonización y dispersión del patógeno (Govrin y Levine 2000; Mayer y col. 2001; Glazebrook 2005). No obstante, las plantas poseen otras herramientas para combatir estas infecciones, tales como la producción de metabolitos secundarios, el reforzamiento de las paredes celulares para incrementar las barreras estructurales y la síntesis de proteínas relacionadas a la patogénesis (PRs) (Van Loon y col. 2006).

1.2.1. La vía fenilpropanoide y fenilalanina amonio liasa (PAL)

Un grupo abundante de metabolitos secundarios presentes en las plantas se produce a partir de la vía fenilpropanoide (Figura 28), la cual deriva del aminoácido L- fenilalanina. La primera etapa de esta vía involucra la eliminación del grupo amino para formar ácido cinámico, reacción catalizada por la fenilalanina amonio liasa (PAL). De esta manera, PAL se sitúa en un punto de ramificación entre el metabolismo primario y el secundario, lo que implica que esta enzima forma parte de un importante paso regulatorio en la síntesis de muchos compuestos fenólicos (Taiz y Zeiger 1998).

Existe una amplia variedad de compuestos fenilpropanoides que cumplen diversas funciones en las plantas, como por ejemplo la de defensa contra patógenos, atracción de polinizadores y dispersión de semillas, formación de paredes celulares secundarias, protección contra el daño producidos por los rayos UV, etc. (Taiz y Zeiger 1998). En el caso de los productos que actúan en la defensa de las plantas, pueden ser clasificados dentro de tres amplios grupos según su comportamiento: fitoalexinas, fitoancipientes y moléculas de señalización (Dixon y col. 2002). Las fitoalexinas son aquellos compuestos inducibles por la presencia del patógeno y los fitoancipientes se

69 encuentran preformados en las plantas. En cuanto a las moléculas de señalización, una de las más conocidas es el ácido salicílico, el cual está involucrado en mecanismos de respuestas de defensa locales y sistémicas (Dixon y col. 2002). Una variedad de compuestos fenólicos simples, que incluye a antocianinas, estilbenos, flavonoides, isoflavonas, precursores de ligninas (monolignoles), y otros compuestos, son fundamentales en muchas especies para combatir a los patógenos tanto de forma directa, inhibiendo su crecimiento, germinación e invasión, como también a través de la formación de barreras estructurales que limitan su penetración (Dixon 2001). Se ha comprobado que el incremento en la producción de estos compuestos mejora la resistencia a enfermedades (He y Dixon 2000).

Como se mencionó anteriormente, PAL es una enzima clave en esta vía y por lo tanto importante en la generación de compuestos de defensa. En este sentido, una reducción de PAL en plantas transgénicas provocó la disminución de la resistencia local de las plantas frente a los patógenos (Maher y col. 1994). Dado que esta enzima está involucrada en la ruta de biosíntesis de antocianinas, y que estos compuestos son los principales responsables del característico color de las frutillas, la medida de la actividad PAL ha sido utilizada ampliamente para caracterizar la maduración de este fruto (Given y col. 1988b; Cheng y Breen 1991). Sin embargo, no existen datos hasta el momento de genes que codifiquen para esta enzima en frutilla, ni se ha analizado la expresión de los mismos durante la maduración (ver capítulo III).

1.2.2. Polifenol oxidasa (PPO)

Las polifenol oxidasas (PPO) son enzimas que se encuentran presentes en la mayoría de los tejidos vegetales y catalizan la oxidación de compuestos fenólicos a quinonas (Yoruk y Marshall 2003). Las quinonas formadas son muy inestables y rápidamente polimerizan en pigmentos marrones que causan una coloración pardusca no deseada en muchos frutos y vegetales durante su postcosecha. Por otro lado, estos compuestos poseen propiedades antimicrobianas y son uno de los primeros signos de respuesta a daño o ataque fúngico (Yoruk y Marshall 2003). Esto fue corroborado en plantas de tomate a las que se les incrementó la expresión de PPO, las cuales mostraron un elevado aumento en la resistencia a enfermedades (Li y Steffens 2002). En comparación con los controles, estas líneas transgénicas presentaron una menor