Introducción general
Generalidades de los frutos
- Origen e importancia biológica
- Desarrollo
- Maduración
5 Existen dos grupos principales en la clasificación de la maduración de frutos carnosos: climatéricos y no climatéricos. Por otro lado, las frutas no climatéricas, como las fresas, las uvas y los cítricos, no muestran un aumento notable de la respiración ni de la producción de etileno al inicio de la maduración.
La Frutilla
- Clasificación biológica e historia
- Morfología de la planta
- El fruto y su maduración
- Cultivo y productividad
En experimentos donde se quitaron los dolores de una de las mitades de un fruto en fase verde, se observó una aceleración de la maduración (que se manifiesta por un aumento en la cantidad de. Según estos registros, entre el 0,5 y el 48% de la producción de fresa en el periodo post-cosecha.
Tratamientos postcosecha de los frutos
- Tratamientos físicos
- Refrigeración
- Atmósferas modificadas y controladas
- Aplicaciones de ozono
- Tratamientos térmicos de alta temperatura
Entre los llamados "tratamientos físicos" utilizados para alargar la vida poscosecha de frutas y hortalizas se encuentran la refrigeración, las aplicaciones de ozono, las atmósferas modificadas y controladas, los tratamientos térmicos a alta temperatura y la radiación UV-C. 15 con pequeñas fluctuaciones de temperatura son fundamentales para su buen almacenamiento.
Irradiación con UV-C
- Propiedades de la radiación UV
- Efecto sobre el mantenimiento y la mejora de la calidad en los frutos
- Influencia sobre procesos asociados a la maduración y senescencia de frutos
- Control del decaimiento postcosecha
- Aspectos moleculares y celulares de los tratamientos con UV-C
De manera similar, la irradiación UV-C no provocó cambios en el contenido de azúcares y ácido málico en rodajas de calabacín (Erkan et al. 2001). 25 La radiación UV-C puede provocar un aumento de la capacidad antioxidante de las frutas y de la actividad de las enzimas que participan en la respuesta antioxidante (Erkan et al. 2008).
Objetivos
Por otro lado, el tratamiento UV-C evitó este aumento en la expresión de las tres expansinas. En el caso de la fresa, encontramos un aumento en la expresión y actividad de PAL en los momentos temprano y tardío después de la irradiación (Figuras 30A y 31).
Capítulo I Efecto del tratamiento con UV-C sobre la degradación de la pared celular
Introducción
- Composición de la pared celular
- Celulosa
- Hemicelulosas
- Pectinas
- Proteínas estructurales
- Estructura de la pared celular
- Proteínas que modifican la pared celular
- Poligalacturonasas (PGs)
- Pectato liasas (PLs, EC 4.2.2.2)
- Pectinmetilesterasas (PMEs, EC 3.1.1.11)
- Xiloglucano endotransglicosilasas (XETs, EC 2.4.1.207)
- Expansinas (EXPs)
- Endo-1,4-β-D glucanasas (EGasas, EC 3.2.1.4)
- β-D-galactosidasas (β-gals, EC 3.2.1.23)
- α-L-arabinofuranosidasas (α-L-aras, EC 3.2.1.55)
- β-D-xilosidasas (β-xils, EC 3.2.1.37)
- Endo-β-1,4-D-xilanasas (Xasas, EC 3.2.1.8)
1993) descubrieron la actividad de PG en el cultivar Toyonoka y lograron purificar tres isoformas de la enzima (una endo-PG y dos exo-PG). De esta forma, la actividad de la PME provoca un aumento en la cantidad de pectinas ácidas presentes en la pared celular (Draye y Van Cutsem 2008).
Resultados
- Comparación de la firmeza en frutos controles y tratados con UV-C
- Expresión de genes de degradación de la pared celular y efecto del tratamiento con
- Expansinas
- Expresión de FaCel1 y actividad endo-1,4-β-D-glucanasa
- Expresión de FaPE1 y actividad pectinmetilesterasa (PME)
- Expresión de FaPG1 y actividad poligalacturonasa
Expresión de genes de degradación de la pared celular y efecto del tratamiento con UV-C Tratamiento con UV-C. Para estudiar el efecto de la UV-C sobre la expresión de genes de degradación de la pared celular utilizamos la variedad Aroma. 49 A continuación, se analizó el efecto del tratamiento con UV-C sobre la expresión de estos tres genes (FaEXP2, FaEXP4 y FaEXP5) (Figura 18).
El análisis de la expresión de FaPE1 durante la maduración de la variedad Aroma mostró la presencia de transcritos de la etapa blanca (Figura 21A).
Discusión
Las sondas utilizadas (FaPAL, FaOLP2 o 18S rRNA) se muestran en el lado izquierdo de la figura. El análisis del efecto de la irradiación UV-C sobre la expresión de FaPAL mostró pequeñas diferencias entre las frutas de control y las tratadas (Figura 30A). Inmediatamente después de la irradiación UV-C, la actividad enzimática fue similar en las frutas de control y tratadas.
Además, se recolectaron raíces (R), hojas (H), sépalos (S), pétalos (P) y aquenios de frutos grandes verdes (AqVG) y 75% rojos (Aq75) de la variedad Toyonoka.
Capítulo II Efecto del tratamiento con UV-C sobre la defensa contra
La podredumbre negra causada por Botrytis cinerea
Los esclerocios se desarrollan en el tejido muerto del huésped y representan un importante mecanismo de supervivencia para el hongo. De esta manera, el ciclo sexual implica la espermatización de los esclerocios, lo que lleva a la producción de apotecios (Figura 27A) y ascas con ocho ascosporas (Figura 27B) producidas después de la meiosis (Williamson et al. 2007). El ciclo de la enfermedad comienza con la colocación de un conidio en la superficie del huésped, el cual germina y desarrolla un apresorio que facilita su penetración en los tejidos.
La penetración de la cutícula y la epidermis desencadena una explosión oxidativa en la interfaz planta-hongo que promueve la progresión de la enfermedad (Williamson et al. 2007).
Mecanismos de defensa de las plantas
- La vía fenilpropanoide y fenilalanina amonio liasa (PAL)
- Polifenol oxidasa (PPO)
- Peroxidasas
- Proteínas relacionadas a la patogénesis (PRs)
- Quitinasas (EC 3.2.1.14)
- β-1,3 glucanasas (EC 3.2.1.39)
- Proteínas semejantes a osmotinas (Osmotin-like proteins)
En este sentido, una reducción de PAL en plantas transgénicas provocó una disminución en la resistencia local de las plantas a patógenos (Maher et al. 1994). De manera similar, estas enzimas están relacionadas con el catabolismo de las auxinas, el entrecruzamiento de las proteínas de la pared celular y el alargamiento celular (Hiraga et al. 2001). Otras proteínas relacionadas con la patogénesis (PR) reportadas en la fresa son proteínas similares a la osmotina (FaOLP1 y FaOLP2) (Wu et al. 2001; Zhang y Shih 2007).
Las osmotinas fueron identificadas originalmente como una de las proteínas que más se acumulan durante el estrés osmótico (Singh et al. 1985).
Inoculación de frutos con Botrytis cinerea
El día 9 de almacenamiento a 20 °C, aproximadamente el 60% de los frutos control mostraron signos de ataque fúngico mientras que sólo el 30% de los frutos irradiados presentaron este tipo de síntomas.
Efecto del tratamiento con UV-C sobre la expresión de genes relacionados a la
- Fenilalanina amonio liasa (PAL) y proteína semejante a osmotina (OLP)
- Quitinasas
- β-1,3 glucanasa
- Polifenoloxidasa (PPO)
- Peroxidasas
En el estudio de la influencia de los UV-C sobre la actividad de las enzimas de defensa resulta interesante analizar la polifenol oxidasa (PPO). La actividad de la enzima se midió en los tejidos externos e internos de ambas variedades, y los resultados se ilustran en la Figura 53. Aunque existen varios estudios previos en los que se analiza la actividad PAL mediante la maduración de la fresa (Given et al.
De esta forma, en el Capítulo I de la tesis intentamos analizar el efecto de la UV-C sobre la expresión y actividad de estas proteínas.
Capítulo III Caracterización de fenilalanina amonio liasa (PAL) en variedades con
Las antocianinas
Son los encargados de dar color rojo, rosa, morado o azul a diversos órganos de las plantas, incluidas flores y frutos. De esta manera, son de crucial importancia como atrayentes de polinizadores y para la dispersión de semillas (Taiz y Zeiger 1998). Además de las funciones mencionadas anteriormente, las antocianinas también pueden actuar en las plantas como antioxidantes, fitoalexinas o como agentes antibacterianos (Kong et al. 2003).
Cabe señalar que en los últimos años ha aumentado el número de estudios sobre los diversos efectos beneficiosos y protectores de las antocianinas presentes en frutas y verduras sobre la salud humana.
Síntesis de antocianinas a través de la vía fenilpropanoide
Las actividades enzimáticas en varias ramas de la vía están altamente reguladas. Para estudiar las relaciones evolutivas entre PAL se han utilizado diferentes secuencias de proteínas pertenecientes a PAL de plantas y hongos, pero se han utilizado HAL (histidina amonio liasas). 95 Se formaron 3 grandes grupos: el de HAL bacterianos, el correspondiente a PAL fúngicos y el que comprende PAL vegetales (Figura 42).
Los aminoácidos se numeraron según la estructura primaria de las proteínas, con residuos idénticos y similares representados en cuadros negros y grises, respectivamente.
Expresión de FaPAL1 en diferentes tejidos de frutilla
Fenilalanina amonio liasa (PAL) en variedades con diferentes acumulación de
- Acumulación de pigmentos (antocianinas) en Camarosa y Toyonoka
- Expresión de FaPAL1 durante la maduración de Camarosa y Toyonoka
- Actividad PAL durante la maduración de ambas variedades
El contenido de antocianinas en los frutos de la variedad Camarosa en las etapas de madurez de 75% R y 100% R fue aproximadamente dos y cinco veces mayor, respectivamente, que en Toyonoka (Figura 45). Una vez obtenida la secuencia completa de PAL de fresa (FaPAL1), se preparó una nueva sonda para determinar nuevamente la expresión de este gen durante la maduración de ambas variedades. Las dos variedades (Camarosa y Toyonoka) y las diferentes sondas (FaPAL y 18S rRNA) utilizadas se muestran a la derecha e izquierda de la figura, respectivamente.
Las dos variedades (Camarosa y Toyonoka) y las diferentes sondas (FaPAL1 y 18S rRNA) utilizadas se muestran a la derecha e izquierda de la figura, respectivamente.
Fenilalanina amonio liasa en variedades de frutilla con acumulación diferencial de
- Acumulación de antocianinas en los tejidos externos e internos de frutos de las
- Expresión de FaPAL1 en tejidos externos e internos de las variedades Toyonoka y
- Actividad PAL en tejidos externos e internos de las variedades Camarosa y
104 Como ya hemos mencionado en el caso de los frutos enteros, la cantidad de antocianinas aumentó con el transcurso de la maduración en ambas variedades. La actividad enzimática se expresó como variación de OD por segundo y por kilogramo de fruta. Probablemente esto se deba a que PAL no es una enzima en el punto de regulación de la vía de las antocianinas.
Después de la desinfección externa, la mitad de los frutos se trataron con UV-C como se indica en 2, y la otra mitad se mantuvo como control. Se midió la absorbancia de todas las alícuotas a 575 nm y la actividad enzimática se expresó como un cambio en la DO por segundo y por kilogramos de fruta. Los resultados se expresaron como variación en OD por segundo y por kg de fruta.
Consideraciones finales
Materiales y Métodos
Material Vegetal
Para estudiar el efecto del tratamiento UV-C sobre la expresión de genes relacionados con la degradación de la pared celular se utilizó la variedad Aroma. En el caso del análisis del gen de defensa del fruto se utilizó la variedad Toyonoka.
Tratamiento con UV-C
Determinación de la firmeza
Inoculación de frutos con Botrytis cinerea
Extracción de ARN total
Electroforesis de ARN en geles de agarosa-formaldehído y transferencia a
Antes de sembrar, las muestras se desnaturalizaron durante 10 minutos, en una mezcla que contenía 1X MOPS, 50% v/v de formamida, 20% v/v de formaldehído y 0,3 μg μl-1 de bromuro de etidio. En el caso de los geles utilizados para realizar la transferencia, la concentración de agarosa fue del 1,2%. Los geles se lavaron dos veces en agua destilada durante 10 minutos para eliminar el exceso de formaldehído y se transfirieron por capilaridad a una membrana de nailon Hybond-N+ (Amersham-GE Healthcare) usando una solución de SSC 20X (ver apéndice).
Northern blot
- Prehibridización de las membranas
- Preparación de sondas
- Genes que codifican proteínas de degradación de la pared celular
- Genes relacionados a mecanismos de defensa
- Marcado radiactivo de las sondas
- Hibridación de las membranas
- Hibridación de las membranas con sonda para ARNr 18S
En el caso de FaCel1, la sonda se preparó mediante amplificación de un fragmento que se extiende desde la base 4 hasta la 322 del gen FaCel1 (Harpster et al. 1998). Para ello, se eliminó la sonda específica original cubriendo las membranas con una solución caliente de SDS al 0,5% p/v y dejándolas en contacto con agitación hasta que la solución alcanzó la temperatura ambiente. Las membranas se secaron con papel de filtro y se hibridaron con la sonda de ARNr 18S como se indica en 7.4.
En este caso, los últimos 3 lavados se realizaron a una temperatura de 55 °C y las membranas estuvieron expuestas de 4 h a 3 días, dependiendo de la mayor o menor cantidad de marcador incorporado a la sonda.
Transcripción reversa (RT)
Después de producir la sonda como se muestra en el paso 7.3, se dejó en contacto con la membrana durante la noche a 42 ° C, manteniendo una suave rotación del tubo de hibridación. Las membranas se expusieron a placas radiográficas (X-OMAT, Kodak) a -80 °C y se revelaron después de aproximadamente 10 días de exposición, según las recomendaciones del fabricante. Para obtener el respectivo control de carga de membrana, se retiró la sonda específica utilizada previamente y se hibridaron con una sonda que reconoce ARN ribosómico 18S de fresa.
Análisis de expresión por RT-PCR semicuantitativa
- Expresión de FaPE1
Visualización de ADN en geles de agarosa
Purificación de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa
Ligación de productos de PCR
Preparación de células competentes
Transformación de células competentes
Extracción de ADN plasmídico
Análisis de plásmidos por restricción
Obtención de ADNc completo de PAL
- Búsqueda en una biblioteca de ADNc
- Reacciónes de 5’RACE
El punto de partida fue el ARN total de dos variedades diferentes de fresa, Camarosa y Toyonoka, a partir del cual se obtuvieron las mezclas de ADNc 5'RACE Ready de ambas variedades. El 5'RACE Ready se utilizó como plantilla para realizar las reacciones de PCR utilizando reactivos pertenecientes al kit Advantage 2 Polymerase Mix (Clontech). La mezcla de PCR utilizada contenía: tampón Advantage SA 1X, dNTP 0,2 mM, 10 μM del cebador específico, UPM 1X, mezcla de polimerasa Advantage 2 1X y 1 μl de ADNc 5'RACE Ready.
Para la amplificación se utilizó el programa de temperatura decreciente del catálogo del kit (Tabla III).
Actividades enzimáticas
- Enzimas de degradación de la pared celular
- Endo-β-1,4-glucanasa
- Poligalacturonasa
- Pectinmetilesterasa
- Enzimas relacionadas a mecanismos de defensa
- Fenilalanina amonio liasa (PAL)
- Quitinasa
- β-1,3 glucanasa
- Polifenoloxidasa (PPO)
- Peroxidasa
Barnes MF, Patchett BJ (1976) Cell wall degrading enzymes and softening of senescent strawberry fruit. Civello PM, Martínez GA, Chaves AR, Añon MC (1997) Heat treatments delay ripening and postharvest of strawberry fruits. Vicente AR, Costa ML, Martínez GA, Chaves AR, Civello PM (2005a) Effect of heat treatments on cell wall degradation and softening in strawberry fruit.
Villarreal NM, Martínez GA, Civello PM (2009) Influence of plant growth regulators on polygalacturonase expression in strawberry fruit.
Bibliografía
