Dr. Félix Bonilla Velasco
Hospital Universitario Puerta de Hierro de Majadahonda Madrid
A pesar de esto, los exosomas (organelas extracelulares) son relativamente “fáciles” de purificar. Los métodos para su riguroso aislamiento y caracterización son, en gran parte, empíricos.
De manera rutinaria, los protocolos de aislamiento que se utilizan implican una combinación de:
Centrifugación diferencial, Filtración, Gradiente de densidad, Unión a microesferas.
Una vez aislados los exosomas, se van a caracterizar por: Microscopía electrónica, Western Blot, Citometría de flujo, Cromatografía líquida-Espectrometría de Masas.
Proteómica de Exosomas
El contenido de proteínas que presentan los exosomas ha sido extensamente analizado a partir de distintos tipos celulares y de fluidos corporales por diversas técnicas (Espectrometría de Masas, WB, Citometría de flujo y Microscopía electrónica).
El contenido molecular, incluyendo las proteínas, de los exosomas es dependiente del tejido/tipo celular del cual deriven. Los exosomas contienen una huella proteíca, que refleja su origen celular, así como también su función fisiológica.
Diversos análisis proteómicos han realizado perfiles de exosomas procedentes de distintos orígenes, observando que estos contienen un grupo de proteínas conservado e idéntico en todos ellos, independientemente del tipo celular.
En el año 2005, se describió por primera vez exosomas en la sangre de individuos sanos. Este estudio y otros posteriores sugerían que los exosomas circulantes en un individuo jugaban un papel importante en la comunicación célula-célula u órgano-órgano.
Al observar que en el plasma de pacientes con cáncer los niveles de exosomas se incrementaban con respecto al individuo sano, concluyeron que los exosomas presentan una función muy importante en el diagnóstico del cáncer.
Los exosomas se han encontrado en otros fluidos biológicos: orina, líquido pleural, lavado broncoalveolar, semen, saliva, líquido amniótico, líquido sinovial, leche materna.
Exosoma: Potencial Diagnóstico
La función de los exosomas depende de la célula de origen y están involucrados tanto en procesos fisiológicos como patológicos al encontrarse en diferentes fluidos corporales (sangre-suero, orina, lavado broncoalveolar…).
Se ha planteado su uso como herramienta en el diagnóstico clínico debido a que estudios recientes han demostrado en su contenido formas inactivas de mRNAs y microRNAs que pueden ser transferidos a otra célula y ser funcionales en el nuevo ambiente.
Los pacientes con cáncer muestran niveles elevados en sangre de éste tipo de orgánulo ya que se cree que las células tumorales liberan exosomas de forma descontrolada (ej. elevada correlación entre los perfiles de expresión de miRNA de exosomas de pacientes con cáncer de ovario y sus equivalentes tumorales).
en sangre, y por tanto, podrían llegar a utilizarse como biomarcadores para el diagnóstico de la enfermedad, constituyendo un método no invasivo.
Análisis comparativos de datos proteómicos indican que los exosomas de distinto origen albergan un número conservado de moléculas proteicas.
Los exosomas son multifuncionales:
• Mecanismo no clásico de secreción de proteínas
• Regulación de la respuesta inmune
• Presentación de antígenos
• Transferencia RNA y proteínas
• Transferencia de carga infecciosa (virus y priones)
• Señalización-interacción célula-célula
Conclusiones
Es necesaria la creación de catálogos de información proteómica y transcriptómica de los exosomas derivados de distintos fluídos corporales, en condiciones normales y patológicas, ampliar el conocimiento acerca de la comunicación genética entre las células.
La capacidad de los exosomas de liberar ácidos nucléicos a células distales los convierte en candidatos idóneos para la terapia génica.
18q loss of heterozygosity (LOH) was long postulated as a prognostic biomarker but its prognostic value has never been independently validated in data from prospective clinical trials 1, 2. The prognostic value of MSI, initially also suggested by a metanalaysis of retrospective and heterogenous studies 3, has been validated in various analysis associated to 1,4-6 large prospective and independent phase III trials. Results from the PETACC–3 validates this effect in stage II but not in stage III (HR of 0.28 (0.1 – 0.72), P-value = 0.0089)1 and in the ancillary analysis in the QUASAR, MSI (evaluated as mismatch deficient tumors) was the strongest prognostic risk factor for recurrence (RR of 0.53; 95% CI, 0.40 to 0.70: P<.001)4. As a consequence, MSI is the only prognostic molecular biomarker that has been sufficiently validated in independent and prospective studies, in multivariate analysis including other relevant clinicopathological risk factors. However its potential role as a negative predictive marker of benefit from adjuvant chemotherapy remains elusive and recent data has suggested the idea of a differential effect of MSI relation with mutational status of another strong prognostic candidate (BRAF), 6,7, or side of tumor location 8,9.
Genetics changes detected in CRC lead to global changes in the transcriptome that have been extensively confirmed by high-throughput techniques. Therefore data has been used to improve diagnosis and to discover new prognostic and predictive biomarkers. Several studies have examined the prognostic value of expression profiles rendering promising results but two commercial platforms are far advanced. Oncotype Dx™ colon cancer assay is already commercially available in US. It was initially developed as a rt-PCR platform with an exploratory analysis of 761 chosen genes in formalin fixed paraffin embedded samples fom NSABP C-01/02 and C-04/06 studies 10. Two sets of 7 and 6 genes were selected for independent validation as prognostic and predictive signatures respectively. Paraffin blocks from the QUASAR clinical trial were analyzed and correlated with outcome. The prognostic signature was validated with a statistically significant risk classification in three categories. The high, intermediate and low risk groups had 22%, 18%
and 12% of relapses at 3 years (p = 0.046), respectively. The predictive signature could not be validated, but the difference in relapse rates between the nigh and low risk categories has been confirmed in two