9. Evaluación de condiciones fisicoquímicas: pH, temperatura y tipo de
9.2 Determinación de actividad de celulasas totales (FPasa) y de endoglucanasas (CMCasa)
RESULTADOS Y DISCUSIONES
86
Figura 53. Gráficas de interacción para población con Acinetobacter pittii (1) y Kluyveromyces marxianus (2)
9.2 Determinación de actividad de celulasas totales (FPasa) y de endoglucanasas (CMCasa)
RESULTADOS Y DISCUSIONES
87
Figura 54. Actividad de celulasas totales (FPasa) y de endoglucanasas (CMCasa) para Acinetobacter pittii
Los resultados fueron mayores a lo reportado para Acinetobacter anitratus crecido en medio de sales adicionado con CMC o glucosa como únicas fuentes de carbono. Los valores de actividad de celulasas totales (FPasa) de los extractos enzimáticos (sobrenadante) fueron de 0.48 y 0.24 U/ml para CMC y glucosa, respectivamente (Ekperegin y col., 2007).
Deka (2011) reportó un valor de 0.43 U/ml de actividad de endoglucanasas (CMCasa) para la bacteria Bacillus subtilis mientras que Irfan (2012) reportó que una cepa de Cellulomonas mostró un valor de actividad de endoglucanasas de 0.451 U/ml. Los resultados presentados en este trabajo muestran que la bacteria Acinetobacter pittii cuenta con una actividad de endoglucanasa menor, sin embargo es importante enfatizar que es muy difícil comparar las actividades de diversas bacterias y determinar si su valor es alto o bajo ya que se trata de especies y condiciones de cultivo diferentes. Poszytek (2016) determinó las condiciones óptimas para cepas aisladas de diversas fuentes y que contaron con actividad hidrolítica. Los análisis
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10
0 4 8 24 48 72
Actividad (U/ml)
Tiempo (h)
34 °C
FPasa, 4.5 CMCasa, 6.5 FPasa, 5.5 CMCasa, 5.5 FPasa, 6.5 CMCasa, 6.5
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70
0 4 8 24 48 72
Actividad (U/ml)
Tiempo (h)
37 °C
FPasa, 4.5 CMCasa, 4.5 FPasa, 5.5 CMCasa, 5.5 FPasa, 6.5 CMCasa, 6.5
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50
0 4 8 24 48 72
Actividad (U/ml)
Tiempo (h)
40 °C
FPasa, 4.5 CMCasa, 4.5 FPasa, 5.5
CMCasa, 5.5 FPasa, 6.5 CMCasa, 6.5
RESULTADOS Y DISCUSIONES
88 desarrollados en medios adicionados con CMC mostraron que todas las bacterias probadas fueron capaces de crecer en un amplio rango de temperaturas (22-45 °C) y pH (4-10) y que independientemente de las condiciones, se observó una hidrólisis de la celulosa.
La levadura K. marxianus también demostró tener actividad hidrolítica. En un trabajo previo, se determinó de manera cualitativa la actividad de la levadura y presentó halos de degradación en medio sólido adicionado con harina de cladodios. En el presente trabajo, se cuantificó la actividad y los valores son muy similares a los obtenidos para la bacteria, lo que la hace prometedora tanto para hidrólisis como para fermentación. En la Figura 55 se presentan las actividades de celulasas totales y de endoglucanasas para cada una de las condiciones probadas.
La máxima actividad de celulasas totales (0.61±0.03 U/ml) y de endoglucanasas (0.22±0.007 U/ml) se obtuvo a 37 °C a diferentes pH. Para el caso de la actividad total fue a pH 4.5 a las 48 h y para la actividad de endoglucanasa fue a pH 6.5 a las 24 h. Se ha reportado por Yanase (2010) la actividad de endoglucanasas de una levadura recombinante Kluyveromyces marxianus que exhibió sobre su superficie celular esta actividad. La actividad enzimática fue encontrada también en el sobrenadante, sin embargo usando la fracción del pellet celular se reportó 0.12 IU/OD600 cuando la temperatura empleada fue de 40 °C mientras que a 50 °C se obtuvo 7.02 IU/OD600. Es importante aclarar que se empleó una mezcla de células vivas (colectadas después de un crecimiento en YPD por 48 h a 30 °C) con una densidad óptica ajustada y una solución de CMC al 1% en buffer de ácido cítrico 0.1 M (pH 5) para cuantificar la actividad enzimática de la superficie celular. Si bien, las condiciones del ensayo no son las mismas, puede ser un referente para comparar los resultados obtenidos para la levadura silvestre de este trabajo, la cual no tiene ninguna modificación genética.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
89
Figura 55. Actividad de celulasas totales (FPasa) y de endoglucanasas (CMCasa) para Kluyveromyces marxianus
De acuerdo con el análisis estadístico, a excepción de las interacciones dobles pH-temperatura (para ambas actividades) y pH-microorganismo (para actividad de endoglucanasa), todos los factores y sus interacciones tuvieron efecto significativo sobre las actividades hidrolíticas. En la Figura 56 se presentan las gráficas de Pareto para ambas variables de respuesta. Se aprecia que para ambas actividades la interacción temperatura-microorganismos fue la que tuvo mayor efecto.
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10
0 4 8 24 48 72
Actividad (U/ml)
Tiempo (h)
34 °C
FPasa, 4.5 CMCasa, 4.5 FPasa, 5.5 CMCasa, 5.5 FPasa, 6.5 CMCasa, 6.5
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70
0 4 8 24 48 72
Actividad (U/ml)
Tiempo (h)
37 °C
FPasa, 4.5 CMCasa, 4.5 FPasa, 5.5 CMCasa, 5.5 FPasa, 6.5 CMCasa, 6.5
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50
0 4 8 24 48 72
Actividad (U/ml)
Tiempo (h)
40 °C
FPasa, 4.5 CMCasa, 4.5 FPasa, 5.5 CMCasa, 5.5 FPasa, 6.5 CMCasa, 6.5
RESULTADOS Y DISCUSIONES
90 A)
B)
Figura 56. Graficas de Pareto para actividad de A) celulasas totales (FPasa) y de B) endoglucanasas (CMCasa)
En la Figura 57 se presentan las interacciones, en donde se muestra que las mejores condiciones para obtener la mayor actividad de celulasas totales es empleando la bacteria Acinetobacter pittii, pH 6.5 y 37 °C, aunque no se observó diferencia significativa entre los tres pH, de acuerdo al ANOVA de una vía que se realizó para la bacteria Acinetobacter pittii (Figura 58).
Standardized Pareto Chart for Actividad Total (FPU)
0 4 8 12 16 20 24
Standardized effect AB
ABC A:pH AC B:Temperatura C:Microorganismo
BC +
-
Standardized Pareto Chart for Actividad Endo (CMCasas)
0 2 4 6 8
Standardized effect AC
AB ABC B:Temperatura C:Microorganismo A:pH
BC +
-
RESULTADOS Y DISCUSIONES
91
Figura 57. Gráficas de interacción para actividad de celulasas totales con Acinetobacter pittii (1) y Kluyveromyces marxianus (2)
Actividad de celulasas totales, FPasa (U/ml)
Interaction Plot
pH 0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
4.5 5.5 6.5
Temperatura 34 37 40
Actividad de celulasas totales, FPasa (U/ml)
Interaction Plot
pH 0
0.1 0.2 0.3 0.4
4.5 5.5 6.5
Microorganismo 1 2
Actividad de celulasas totales, FPasa (U/ml)
Interaction Plot
Temperatura 0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
34 37 40
Microorganismo 1 2
RESULTADOS Y DISCUSIONES
92
Figura 58. Gráfica de medias de pH para actividad total de celulasas de Acinetobcter pittii
Por otro lado, en la Figura 59 se presentan las gráficas de interacciones para actividad de endoglucanasas. Se observa que las mejores condiciones son empleando Acinetobacter pittii, pH 6.5 y 37 °C. No se presentó diferencia significativa en los diferentes pH probados (Figura 60).
Actividad de celulasas totales, FPasa (U/ml)
4.5 5.5 6.5
Means and 95.0 Percent LSD Intervals
pH -0.05
0.05 0.15 0.25 0.35 0.45
RESULTADOS Y DISCUSIONES
93
Figura 59. Gráficas de interacción para actividad de endoglucanasas con Acinetobacter pittii (1) y Kluyveromyces marxianus (2)
Actividad de endoglucanasas, CMCasa (U/ml)
Interaction Plot
pH 0
0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3
4.5 5.5 6.5
Temperatura 34 37 40
Actividad de endoglucanasas, CMCasa (U/ml)
Interaction Plot
pH 61
81 101 121 141 161 (X 0.001)
4.5 5.5 6.5
Microorganismo 1 2
Actividad de endoglucanasas, CMCasa (U/ml)
Interaction Plot
Temperatura 0
0.04 0.08 0.12 0.16 0.2 0.24
34 37 40
Microorganismo 1 2
RESULTADOS Y DISCUSIONES
94
Figura 60. Gráfica de medias de pH para actividad de endoglucanasas de Acinetobacter pittii