Gráfico de interacción para la producción máxima de alcohol de levaduras en medio con harina de cladodios. Evaluar la capacidad hidrolítica y/o fermentativa de microorganismos silvestres para la producción de bioetanol a partir de cladodios del género Opuntia ficus-indica variedad Atlixco.
Producción de alcohol a partir de biomasa lignocelulósica
Características de biomasa lignocelulósica
Estructura química de la celulosa
La evidencia experimental muestra que el peso molecular de la celulosa es mucho mayor que los 162 g/mol calculados por la fórmula anterior, que suele cambiarse a (C6H10O5)n. Muchas determinaciones individuales de peso molecular y muchos otros datos experimentales indican que el valor de "n" es muy grande, a menudo entre 1000 y 5000 g/mol, dependiendo de la forma de aislamiento, tratamiento y purificación de la celulosa.
Estructura química de la hemicelulosa
9 En el análisis de la celulosa del algodón cuidadosamente purificada, se observó que contenía 44,44% de carbono, 6,22% de hidrógeno y 49,34% de oxígeno.
Estructura química de la lignina
Descripción de la especie Opuntia ficus-indica
Las cladodia tienen forma de maza ovoide o alargada y miden aproximadamente de 30 a 60 cm de largo, de 20 a 40 cm de ancho y de 1 a 3 cm de espesor, dependiendo del agua y los nutrientes disponibles. Además, presentan abundancia de parénquima y mucílago, lo que permite a la planta resistir largos periodos de sequía (Nobel et al., 1992) (De la Rosa y Santana, 1998).
Distribución y producción de cladodios de la especie Opuntia ficus-indica
Puede alcanzar los 5 m de altura gracias a las ramas de los tallos que generan hojas o tallos planos y botánicamente llamados cladodios, que son muy carnosos o leñosos según la edad. En el Cuadro 2 se muestran los datos estadísticos correspondientes a hectáreas plantadas y cosechadas así como producción y rendimiento en los estados productores de nopal vegetal más importantes (SIAP, 2018).
Composición química de los cladodios de Opuntia ficus-indica
Actualmente, el uso extensivo de cladodios ha surgido como una necesidad para aprovechar residuos o excedentes estacionales (Contreras et al., 2011). Se ha cuantificado un bajo contenido de proteínas y lípidos, pero un alto contenido de fibra en comparación con otras verduras (Inglese et al., 2002).
Conversión de material lignocelulósico a bioetanol
Pre tratamiento de biomasa lignocelulósica
Además, se utiliza en la construcción como modificador natural de la viscosidad de los morteros y como adhesivo para la cal ((Ca(OH)2). La conversión de celulosa en glucosa en más del 90% (peso/peso) de la El rendimiento teóricamente sigue siendo un desafío y superarlo dependerá de la selección de uno o más de los pretratamientos estudiados a lo largo de los años (Wyman et al., 2005).
Hidrólisis y Sacarificación de biomasa lignocelulósica
En la Tabla 8 se muestra el mecanismo de acción de cada una de las enzimas y la evaluación de la actividad enzimática (Volynets et al., 2011) (Dashtban et al., 2010). La celulosa microcristalina (Avicel) es un sustrato adecuado para medir la actividad porque tiene.
Fermentación de biomasa lignocelulósica
Tipos de esquemas para obtención de bioetanol
- Hidrólisis y fermentación por separado (HFS)
- Sacarificación y fermentación simultánea (SFS)
- Sacarificación y fermentación semi-simultánea (SFSS)
- Sacarificación y co-fermentación simultánea (SCFS)
- Bioproceso consolidado (BPC)
El uso de este esquema es reducir la inhibición de la celulasa porque los azúcares son consumidos inmediatamente por el microorganismo fermentador (Hahn-Hägerdal et al., 2006). El proceso SFS también tiene algunas limitaciones, ya que las celulasas y el microorganismo fermentador suelen tener diferentes pH y temperaturas de trabajo, por lo que es importante considerar estas condiciones.
Análisis reológicos
Microorganismos silvestres
Aislamiento de microorganismos
Caracterización morfológica de microorganismos en medios sintéticos sólidos
Pre tratamiento y caracterización proximal de harina de cladodios de Opuntia f-i
27 Capacidad de retención de agua: 1 g de harina de cladodio se hidrató en un tubo de centrífuga durante 18 horas. Capacidad de hinchamiento: Se hidrataron 100 mg de harina de cladodio en una probeta graduada y se agregaron 10 ml de agua destilada con agitación para dispersar la muestra.
Preparación de medios de cultivo
Se dejó reposar por 18 horas para lograr hidratación, se midió el volumen final ocupado por la muestra. Medio de cultivo utilizado para el crecimiento de microorganismos Medio de cultivo Composición en 1L Propósito del medio.
Crecimiento de microorganismos en medios sintéticos líquidos
Crecimiento de bacterias silvestres en medio con carboximetilcelulosa (CMC)
Luego se realizó un segundo crecimiento inoculando el matraz Erlenmeyer con 50 ml de medio previamente ajustado a pH 6, utilizando como preinóculo el tubo de cultivo de 8 horas. Se tomaron muestras a lo largo de la cinética y la determinación de la población se realizó por densidad óptica a 600 nm, luego se centrifugaron a 13,500 rpm, 4 °C, 3 min para separar el extracto enzimático crudo y determinar la actividad hidrolítica por turbidimetría a 660 nm.
Crecimiento de levaduras en medio con extracto de levadura, peptona y glucosa
Crecimiento de microorganismos en medio sólido adicionado con harina de cladodios al
Identificación molecular de microorganismos
Purificación de ADNg: El ADN genómico se purificó utilizando el protocolo de limpieza de PCR Gen EluteTM. Ligación de amplicones de ADNg: Para el proceso de ligación y construcción de plásmidos recombinantes se utilizó el protocolo de vector del sistema de vector pGEM-T I.
Determinación cualitativa de actividad hidrolítica
Los cebadores utilizados para la secuenciación fueron el promotor SP6 y T7, que flanquean el inserto en dirección opuesta. Análisis bioinformático: Para identificar las cepas aisladas se utilizó el programa BLAST con la base de datos NCBI.
Determinación cuantitativa de actividad hidrolítica
Turbidimetría
32 a 37 ºC por 24 h hasta observar crecimiento, luego se agregaron 2 ml de rojo Congo al 1% por 5 min y finalmente se enjuagó con agua destilada para observar halos de degradación.
Actividad hidrolítica específica
Actividad hidrolítica de celulasas totales y endoglucanasas
Comportamiento al flujo del medio de cultivo con crecimiento de bacterias silvestres 34
Evaluación de condiciones fisicoquímicas: pH, temperatura y tipo de
- Establecimiento del diseño experimental
- Cinética de crecimiento
- Sacarificación y fermentación simultánea (SFS)
- Sacarificación y fermentación semi-simultánea (SFSS)
Finalmente se realizó un tercer pase en un volumen de 250 ml de medio, iniciando con un recuento celular de 20 x 106 células/ml de cada microorganismo. Finalmente se realizó un tercer pase en un volumen de 250 ml de medio, comenzando con un recuento celular de 20 x 106 células/ml.
Determinaciones analíticas
- Medida de población y biomasa celular
- Cuantificación de glucosa y sacarosa
- Cuantificación de alcohol
- Cuantificación azúcares reductores libres y azúcares totales
- Determinación de proteína soluble
- Determinación de perfil de azúcares
- Cálculo de parámetros cinéticos de crecimiento
- Cálculo de parámetros cinéticos de producción de alcohol
Para la evaluación en muestras se preparó una curva de calibración con un estándar de glucosa en el rango de concentración de 0,1 a 1 g/L. Para la evaluación en muestras, preparamos una curva de calibración con un estándar de sacarosa en el rango de concentración de 0,01 a 0,1 g/L.
Análisis estadístico
La Figura 9 muestra la morfología macroscópica y microscópica de los microorganismos aislados de cladodios en descomposición, rumen y estómago de termitas, que correspondieron a bacterias y levaduras. Composición proximal de harina de cladodios de Opuntia ficus-indica variedad Atlixco de 12 meses (f. seco).
Crecimiento de microorganismos silvestres en medios sintéticos líquidos
Crecimiento de cuatro bacterias en carboximetilcelulosa (CMC)
La Figura 14 muestra las curvas de crecimiento obtenidas durante la cinética del balón. La fase exponencial de las bacterias B400 y B402 se extendió a 8 horas de crecimiento, mientras que para las bacterias B401 y B403 fue de 2 y 6 horas, respectivamente.
Crecimiento de cuatro levaduras en extracto de levadura, peptona y glucosa
Se analizó estadísticamente (ANOVA unidireccional) para observar si existía diferencia significativa entre las concentraciones máximas de alcohol debido al tipo de levadura. La variable respuesta se definió como la biomasa y concentración de alcohol producido utilizando un medio rico en extracto de levadura, peptona y glucosa como fuente de carbono.
Crecimiento de microorganismos silvestres en medio sólido adicionado con harina de
La Figura 27 muestra las curvas de crecimiento bacteriano y las actividades obtenidas. El gráfico de interacción (Figura 44) muestra que no hay diferencias significativas entre la levadura Candida glabrata (LR2) en medio de cultivo al 10%. Las curvas de crecimiento y las actividades hidrolíticas específicas de las bacterias silvestres se presentan en la Figura 45.
La Figura 50 muestra las curvas de crecimiento de la bacteria Acinetobacter pittii en cada una de las temperaturas y pH sugeridos.
Identificación molecular de microorganismos silvestres
Determinación cualitativa de actividad hidrolítica
Se observaron los halos de degradación tanto de bacterias como de levaduras, lo que indica que tienen la capacidad de generar enzimas celulolíticas que participan en la degradación de este sustrato específico (Figura 22). Se observó que a pesar de un tamaño de partícula de 1500 micras, las partículas de harina se depositaban en el fondo de las cajas petri, por lo que se decidió agregar primero un 2% de agar-agar base y luego agregar un 1% de agar harina de cladodios, de esta manera , tras lo cual los microorganismos tuvieron mayor contacto y disponibilidad de la fuente de carbono.
Determinación cuantitativa de actividad hidrolítica
Determinación por turbidimetría
Se observó una disminución de la turbidez después de 36 horas de reacción en el caso del extracto enzimático de la bacteria Acinetobacter pittii, que en comparación con el control (sustrato sin extracto enzimático) indicó actividad hidrolítica. En el caso del extracto enzimático de la bacteria Bacillus subtilis se obtuvo una disminución en la absorción hasta las 60 horas.
Determinación de actividad hidrolítica específica (UI)
- Determinación de actividad hidrolítica específica de bacterias
- Determinación de actividad hidrolítica específica de levaduras
Curvas de crecimiento de las bacterias Acinetobacter pittii (línea roja), Bacillus subtilis (línea azul) y levaduras Candida glabrata-LR2 (línea rosa), Candida glabrata-LR5 (línea azul oscuro), Kluyveromyces marxianus-T4 (línea verde) y Kluyveromyces marxianus - T6 (línea morada) en el medio con harina de cladodio. Gráfico de interacción para la producción máxima de proteína soluble en medios con harina de cladodios.
Comportamiento al flujo del medio de cultivo con crecimiento de bacterias
Curvas de crecimiento (líneas) y actividad hidrolítica específica (barras) para Acinetobacter pittii (rojo) y Bacillus subtilis (azul) en medio al 20% (matraz de 150 ml). Efecto del tiempo sobre la viscosidad de un medio de cultivo a base de harina de cladodios con Acinetobacter pittii como bacteria hidrolítica.
Evaluación de condiciones fisicoquímicas: pH, temperatura y tipo de
Crecimiento
Curvas de crecimiento de la bacteria Kluyveromyces marxianus a tres temperaturas y pH 4,5 (línea roja), pH 5,5 (línea azul) y pH 6,5 (línea gris). En las gráficas de interacción (Figura 53) se confirma que las mejores condiciones para lograr un mayor crecimiento son utilizar la bacteria Acinetobacter pittii, pH 5,5 y 34 °C.
Determinación de actividad de celulasas totales (FPasa) y de endoglucanasas (CMCasa)
Los valores de actividad celulasa total (FPasa) de los extractos enzimáticos (sobrenadante) fueron 0,48 y 0,24 U/ml para CMC y glucosa, respectivamente (Ekperegin et al., 2007). Por otro lado, la Figura 59 muestra gráficos de interacción para la actividad de endoglucanasa.
Determinación de azúcares reductores libres (ARL) y alcohol
Azúcares reductores libres (líneas continuas) y alcohol (líneas discontinuas) en cada una de las condiciones propuestas, pH 4,5 (rojo), pH 5,5 (azul) y pH 6,5 (verde) para la bacteria Acinetobacter pittii. Azúcares reductores libres (líneas continuas) y alcohol (líneas discontinuas) en cada una de las condiciones propuestas, pH 4,5 (rojo), pH 5,5 (azul) y pH 6,5 (verde) para la levadura Kluyveromyces marxianus.
Establecimiento de diferentes esquemas de sacarificación y fermentación para producción
Hidrólisis y fermentación por separado (HFS)
105 De esta manera, se propusieron los esquemas de sacarificación y fermentación simultánea (SFS) y semi-simultánea de sacarificación y fermentación (SFSS) con el objetivo de utilizar las mejores condiciones obtenidas para cada microorganismo y obtener una mayor concentración de alcohol.
Sacarificación y fermentación simultánea (SFS)
Según el análisis estadístico (ANOVA unidireccional), hubo un efecto significativo de la agitación en la producción de alcohol. El gráfico de promedio (Figura 73) muestra que la mayor concentración de alcohol se obtiene a 0 rpm.
Sacarificación y fermentación semi-simultánea (SFSS)
El aumento gradual del pH en el medio sin agitación permitió la producción de alcohol. La actividad máxima fue U/ml y se observó a 0 rpm y 10 horas. Esto corresponde a la fase estacionaria inicial, 2 h después de la inoculación, donde se utilizaron azúcares totales para la producción de alcohol.
Establecimiento del mejor proceso para la producción de alcohol
Opuntia ficus-indica cladodes as raw material for ethanol production by Kluyveromyces marxianus and Saccharomyces cerevisiae. Ethanol production by fermentation of fruit and cladodes of ficus cactus (Opuntia ficus-indica (L.) Miller), Journal of the Science of Food and Agriculture.
