9. Evaluación de condiciones fisicoquímicas: pH, temperatura y tipo de
9.3 Determinación de azúcares reductores libres (ARL) y alcohol
RESULTADOS Y DISCUSIONES
94
Figura 60. Gráfica de medias de pH para actividad de endoglucanasas de Acinetobacter pittii
RESULTADOS Y DISCUSIONES
95
Figura 61. Azúcares reductores libres (líneas sólidas) y alcohol (líneas punteadas) en cada una de las condiciones propuestas, pH 4.5 (rojo), pH 5.5 (azul) y pH 6.5 (verde) para la bacteria Acinetobacter pittii
Con respecto a las concentraciones de glucosa y sacarosa (Figura 62) se observó un comportamiento similar de estos dos azúcares en las tres temperaturas y pH. Durante las primeras 8 h de cinética se observaron unos picos de aumento de concentración que posteriormente disminuyeron a pH 5.5 y 6.5.
A pH 4.5 tanto glucosa como sacarosa aumentaron a lo largo del tiempo hasta las 48 o 72 h donde se obtuvieron las máximas concentraciones: 3.97±0.17 y 5.79±0.48 g/L para glucosa y sacarosa a 34 °C; 5.52±0.13 y 5.11±0.30 g/L para glucosa y sacarosa a 37 °C; 6.60±0.42 y 5.12±0.52 g/L para glucosa y sacarosa a 40 °C.
A 37 º C y pH 5.5 se observó un aumento de hasta 4 g/L de azúcar (glucosa+sacarosa) ya que de una concentración inicial de 5.8 g/L incrementó a 9.8 g/L.
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70
0 2 4 6 8 10 12 14 16
0 12 24 36 48 60 72
Alcohol (g/L)
ARL (g/L)
Tiempo (h)
34 °C
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60
0 2 4 6 8 10 12 14 16
0 12 24 36 48 60 72
Alcohol (g/L)
ARL (g/L)
Tiempo (h)
37 °C
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60
0 5 10 15
0 12 24 36 48 60 72
Alcohol (g/L)
ARL (g/L)
Tiempo (h)
40 °C
RESULTADOS Y DISCUSIONES
96
Figura 62. Glucosa (línea sólida) y sacarosa (línea punteada) cuantificada en cada una de las condiciones propuestas, pH 4.5 (rojo), pH 5.5 (azul) y pH 6.5 (verde) para la bacteria Acinetobacter pittii
La levadura K. marxianus, presentó un comportamiento muy diferente a lo mostrado por la bacteria. En la Figura 63 se presentan los azúcares reductores libres y la concentración de alcohol producido en cada una de las condiciones probadas. Los ARL disminuyeron en las primeras 4 h de cinética en todas las temperaturas y pH, lo que permitió a la levadura emplearlos para la producción de alcohol, obteniéndose la máxima concentración a pH 6.5 y 40 °C (12.98±0.06 g/L), aunque no existió diferencia significativa entre los 3 pH e inclusive con el valor obtenido a pH 4.5 y 34 °C. El valor obtenido en este trabajo corresponde a la mitad de lo reportado por Kuloyo (2014) quien realizó una fermentación de cladodios de Opuntia ficus- indica empleando también una K. marxianus. Obtuvo un valor de 25 g/L de alcohol a 40 °C después de 48 h de reacción. Es importante señalar que la materia prima fue hidrolizada previamente con ácido diluido y enzimas comerciales lo que permitió la liberación de mayores concentraciones de azúcares fermentables. Ribeiro (2018) también obtuvo un valor muy similar de alcohol, 26.4 g/L empleando O. ficus-indica y K. marxianus (hidrólisis ácida y enzimática
0 1 2 3 4 5 6 7
0 12 24 36 48 60 72
Glucosa/Sacarosa (g/L)
Tiempo (h)
34 °C
0 1 2 3 4 5 6 7
0 12 24 36 48 60 72
Glucosa/Scarosa (g/L)
Tiempo (h)
37 °C
0 1 2 3 4 5 6 7
0 12 24 36 48 60 72
Glucosa/Sacarosa (g/L)
Tiempo (h)
40 °C
RESULTADOS Y DISCUSIONES
97 previa). El proceso de hidrólisis en este trabajo fue exclusivamente biológico ya que se llevó cabo por la propia levadura (con un pretratamiento térmico previo), la cual demostró tener actividad hidrolítica sobre la materia prima.
Figura 63. Azúcares reductores libres (líneas sólidas) y alcohol (líneas punteadas) en cada una de las condiciones propuestas, pH 4.5 (rojo), pH 5.5 (azul) y pH 6.5 (verde) para la levadura Kluyveromyces marxianus
En la Figura 64 se corrobora que la levadura consume toda la glucosa disponible en el tiempo inicial para llevar a cabo la conversión a alcohol, mientras que la sacarosa se mantiene igual a lo largo de las primeras 48 h a 34 y 37 °C tanto para pH 5.5 como 6.5, posteriormente la concentración disminuye considerablemente. Por el contrario, a pH 4.5 la concentración aumenta hasta un máximo de 12 g/L después de 48 h.
0 2 4 6 8 10 12 14
0 2 4 6 8 10 12 14 16
0 12 24 36 48 60 72
Alcohol (g/L)
ARL (g/L)
Tiempo (h)
34 °C
0 2 4 6 8 10
0 1 2 3 4 5 6
0 12 24 36 48 60 72
Alcohol (g/L)
ARL (g/L)
Tiempo (h)
37 °C
0 2 4 6 8 10 12 14
0 2 4 6 8 10
0 12 24 36 48 60 72
Alcohol (g/L)
ARL (g/L)
Tiempo (h)
40 °C
RESULTADOS Y DISCUSIONES
98
Figura 64. Glucosa (línea sólida) y sacarosa (línea punteada) cuantificada en cada una de las condiciones propuestas, pH 4.5 (rojo), pH 5.5 (azul) y pH 6.5 (verde) para la bacteria Kluyveromyces marxianus
Observando los resultados de ARL y glucosa, se puede concluir que la levadura prefirió emplear los azúcares para la producción de alcohol que para crecimiento, fue 40 °C donde se reportó el menor crecimiento pero donde se obtuvo la máxima producción de alcohol.
En la Figura 65 se presentan las gráficas de Pareto para ARL y alcohol, donde se observa que el microorganismo fue el factor que tuvo mayor efecto sobre ambas variables de respuesta. Para obtener mayor concentración de azúcares libres es necesario emplear la bacteria Acinetobacter pittii (mayor actividad hidrolítica) y para obtener mayor concentración de alcohol, la levadura K. marxianus.
0 5 10 15
0 1 2 3 4 5
0 12 24 36 48 60 72
Sacarosa (g/L)
Glucosa (g/L)
Tiempo (h)
34 °C
0 2 4 6 8 10 12 14
0 1 2 3
0 12 24 36 48 60 72
Sacarosa (g/L)
Glucosa (g/L)
Tiempo (h)
37 °C
0 2 4 6 8 10
0 1 2 3
0 12 24 36 48 60 72
Sacarosa (g/L)
Glucosa (g/L)
Tiempo (h)
40 °C
RESULTADOS Y DISCUSIONES
99 A)
B)
Figura 65. Gráficas de Pareto para A) azúcares reductores libres y B) alcohol
En las gráficas de interacción (Figura 66 y 67) se presentan las mejores condiciones para la obtención de mayor concentración de ARL y alcohol. Para el primer caso, las mejores condiciones son con la bacteria Acinetobacter pittii, pH 4.5, 37 °C, obteniéndose una concentración de 14.71±0.00 g/L. En la Figura 66 se presenta la gráfica de medias para ARL que indica que no existió diferencia significativa entre las tres temperaturas.
Standardized Pareto Chart for ARL
0 5 10 15 20 25 30
Standardized effect AB
AC ABC B:Temperatura BC A:pH
C:Microorganismo +
-
Standardized Pareto Chart for Alcohol
0 200 400 600 800 1000 1200
Standardized effect AC
A:pH B:Temperatura BC ABC AB
C:Microorganismo +
-
RESULTADOS Y DISCUSIONES
100
Figura 66. Gráficas de interacción para azúcares reductores libre para Acinetobacter pittii (1) y Kluyveromyces marxianus (2)
ARL (g/L)
Interaction Plot
pH 5.3
7.3 9.3 11.3 13.3 15.3
4.5 5.5 6.5
Microorganismo 1 2
ARL (g/L)
Interaction Plot
Temperatura 4.3
6.3 8.3 10.3 12.3 14.3
34 37 40
Microorganismo 1 2
ARL (g/L)
Interaction Plot
pH 7.4
8.4 9.4 10.4 11.4 12.4 13.4
4.5 5.5 6.5
Temperatura 34 37 40
RESULTADOS Y DISCUSIONES
101
Figura 67. Gráfica de medias de temperatura para azúcares reductores libres para Acinetobacter pittii
Para el caso de alcohol, las mejores condiciones para obtener la mayor concentración fueron empleando la levadura Kluyveromyces marxianus, pH 6.5, 40 °C, obteniéndose una concentración de 12.98±0.06 g/L (Figura 68). De acuerdo a la gráfica de medias (Figura 69) para alcohol, no existió diferencia significativa entre los 3 pH.
ARL (g/L)
34 37 40
Means and 95.0 Percent LSD Intervals
Temperatura 10
11 12 13 14 15
RESULTADOS Y DISCUSIONES
102
Figura 68. Gráficas de interacción para producción de alcohol para Acinetobacter pittii (1) y Kluyveromyces marxianus (2)
Alcohol (g/L)
Interaction Plot
pH 0
2 4 6 8 10
4.5 5.5 6.5
Microorganismo 1 2
Alcohol (g/L)
Interaction Plot
Temperatura 0
3 6 9 12 15
34 37 40
Microorganismo 1 2
Alcohol (g/L)
Interaction Plot
pH 2.5
3.5 4.5 5.5 6.5 7.5
4.5 5.5 6.5
Temperatura 34 37 40
RESULTADOS Y DISCUSIONES
103
Figura 69. Gráfica de medias de pH para alcohol para Kluyveromyces marxianus
En la Tabla 27 se presenta de manera resumida el análisis estadístico realizado para cada una de las variables de respuesta, donde se observa que existió diferencia significativa debido a la interacción de los factores microorganismo-temperatura-pH para la mayoría de las variables de respuesta.
Tabla 27. Probabilidad de los efectos individuales e interacción de los factores estudiados sobre las variables de respuesta Probabilidad
Términos Población
(cel/mlx106)
Actividad total (U/ml)
Actividad endoglucanasa (U/ml)
ARL (g/l)
Glucosa (g/l)
Sacarosa (g/l)
Alcohol (g/l) Contribución individual
A: pH 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.1380 0.0000
B: Temperatura 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.1762 0.0000 0.0000
C: Microorganismo 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
Interacciones
AB 0.0000 0.2725 0.1135 0.2348 0.0000 0.0538 0.0000
AC 0.0000 0.0000 0.5945 0.0000 0.0000 0.2383 0.0000
BC 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
ABC 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.8651 0.0000
Los resultados obtenidos durante el desarrollo del diseño experimental se presentan en la Tabla 28. Se presentan los valores máximos de población, actividad total de celulasas, actividad de
Alcohol (g/L)
4.5 5.5 6.5
Means and 95.0 Percent LSD Intervals
pH 6.9
7.9 8.9 9.9 10.9 11.9
RESULTADOS Y DISCUSIONES
104 endoglucanasas, azúcares reductores libres, alcohol, glucosa y sacarosa así como su correspondiente desviación estándar.
Tabla 28. Variables de respuesta analizadas para diseño factorial 32x2
Condiciones Población
(cel/mlx106)
Actividad total (U/ml)
Actividad endoglucanasa
(U/ml) ARL (g/l) Glucosa (g/l)
Sacarosa
(g/l) Alcohol (g/l) Microorganismo Temp (°C) pH
Acinetobacter pittii
34
4.5 881±27 0.097±0.00 0.061±0.00 14.33±0.00 3.97±0.16 5.79±0.48 0.55±0.07 5.5 10150±89 0.096±0.00 0.052±0.00 7.82±0.04 2.14±0.07 3.86±0.82 0.676±0.00 6.5 7594±529 0.096±0.00 0.063±0.00 12.71±0.04 1.80±0.55 4.75±0.58 0.296±0.00
37
4.5 1209±95 0.098±0.00 0.061±0.00 14.71±0.00 5.52±0.12 5.43±0.13 0.463±0.06 5.5 6138±36 0.424±0.03 0.188±0.01 12.55±0.00 3.33±0.37 6.45±0.81 0.173±0.01 6.5 3325±65 0.670±0.02 0.235±0.02 13.03±0.04 2.21±0.19 4.97±0.49 0.107±0.01
40
4.5 701±76 0.067±0.00 0.061±0.00 14.03±0.04 6.60±0.42 5.11±0.51 0.551±0.01 5.5 722±23 0.043±0.00 0.047±0.00 12.39±0.04 3.14±0.47 5.07±0.03 0.318±0.02 6.5 1518±26 0.035±0.00 0.029±0.00 10.05±0.04 2.63±0.02 4.99±0.07 0.500±0.01
Kluyveromyces marxianus
34
4.5 270±18 0.043±0.00 0.030±0.00 12.73±2.31 4.60±0.26 12.86±0.91 12.67±0.03 5.5 237±10 0.075±0.00 0.037±0.00 11.59±0.08 2.57±0.08 9.38±0.33 8.16±0.03 6.5 257±33 0.036±0.00 0.025±0.00 7.13±0.08 3.25±0.06 13.54±0.46 4.91±0.03
37
4.5 279±14 0.610±0.02 0.139±0.00 5.33±0.15 2.88±0.02 11.95±0.28 5.33±0.03
5.5 272±19 0.500±0.01 0.185±0.00 3.64±0.08 1.96±0.07 8.62±0.53 7.88±0.04
6.5 343±8 0.474±0.03 0.225±0.00 3.81±0.46 2.35±0.07 9.32±0.38 9.37±0.03
40
4.5 176±3 0.319±0.00 0.103±0.00 9.03±0.15 2.90±0.56 6.02±0.01 11.40±0.00
5.5 142±31 0.261±0.03 0.078±0.00 6.31±0.01 2.36±0.33 6.75±0.04 12.95±0.03
6.5 119±11 0.384±0.00 0.188±0.00 4.67±0.15 1.66±0.02 7.76±0.08 12.98±0.06
10. Establecimiento de diferentes esquemas de sacarificación y fermentación para