La selectividad enzimática describe la capacidad de una enzima para discriminar entre dos o más sustratos y se cuantifica con el coeficiente de selectividad (α*). El α*relaciona las constantes de especificidad (kcat1/Km1/kcat2/Km2) de la enzima y dos sustratos en condiciones de competición; es decir, cuando los sustratos compiten por un mismo sitio catalítico [47]. Es importante hacer hincapié en que los términos “selectividad” y “competición” no son excluyentes mientras que “selectividad” y “especificidad” si lo son. A manera de ejemplo, imagine que una enzima presenta la misma kcatpor dos sustratos, pero su afinidad por uno de ellos es mayor (Km1>Km2). En un experimento en competición, la enzima reaccionará de manera más selectiva por el sustrato por el que presente la mayor afinidad (Km2), pero si las velocidades se determinan de manera independiente (sin competición), la enzima reaccionará, en apariencia, a la misma velocidad (asumiendo que la concentración de los sustratos está por encima de Km).
De acuerdo a esto, vale la pena recordar que la estrategia del HTSkcat/Km para determinar la actividad sobre un sustrato problema (e.g., MF), es monitorear a 410 nm la pérdida de coloración amarilla del pNP ocasionada por su protonación durante la hidrólisis del sustrato. Este hecho limita al método para realizar experimentos de competición empleando simultáneamente dos sustratos problema (e.g., MF y MC). Sin embargo, el empleo de un compuesto de referencia (éster de resorufina) cuyamaxsea diferente a la del pNP y el ácido liberado durante la reacción de hidrólisis (e.g., ácido ferúlico) permite sobrellevar esta limitante, al seguir simultáneamente la hidrólisis de dos sustratos presentes en el mismo pozo de microplaca a dos longitudes de onda.
Este principio se ha empleado exitosamente para evaluar la toposelectividad y enantioselectividad de esterasas y lipasas sobre sustratos de carácter lipídico empleando como compuesto de referencia al acetato (AR) o butirato (BR) de resorufina (monitoreado a 570 nm) [92,122]. Sin embargo, la cadena acilo de los ésteres de resorufina mencionados son ácidos carboxílicos lineales (ácido acético y ácido butírico), lo que los convierte en un buen sustrato para lipasas y cierto tipo de esterasas, pero como las cinamoil esterasas evolutivamente se han especializado para reconocer otra clase de sustituyentes acilo (i.e., ácidos hidroxicinámicos), podrían no ser la mejor opción para realizar experimentos de competición. Por lo anterior, se sintetizó el ferulato de resorufina (FR), bajo la premisa de que los cuatro tipos de faes son capaces aceptar como sustrato al metil éster del ácido ferúlico (cadena acilo) [21]. Con el fin de elegir un competidor adecuado que permita evaluar la selectividad por metil hidroxicinamatos se evaluó la actividad específica sobre el AR, BR y FR de cuatro diferentes carboxil éster hidrolasas (Figura 5.5), la lipasa de Thermomyces lanuginosus (TLL), dos feruloil esterasas (AnfaeA y AnfaeB) y una clorogenato esterasa (Ancae).
Como era de esperarse, la TLL fue la que hidrolizó mejor el AR (1.2 U mg-1) y BR (5 U mg-1), confirmando que este tipo de ésteres son relativamente buenos sustratos para las lipasas. Las faes presentaron la misma velocidad en la hidrólisis de dichos ésteres, pero con respecto a TLL fueron 30 (AR) y 10 (BR) veces más lentas. La clorogenato esterasa, que es una esterasa muy específica por el ACl (ver sección 5.4), no presentó actividad sobre AR, mientras que su velocidad en la hidrólisis del BR (0.03 U mg-1) fue muy baja, 167 veces inferior respecto a la de TLL. Las cuatro carboxil éster hidrolasas presentaron una mayor actividad sobre el BR (cadena acilo C4) que sobre el AR. La preferencia de TLL [23] por las cadenas acilo C4 sobre C2 es ampliamente conocida, mientras que la preferencia de las esterasas puede ser variable. En particular, la preferencia por la cadena acilo de AnfaeA, AnfaeB y Ancae es la misma a la reportada para la esterasa 2 de Alicyclobacillus acidocaldarius [23].
Por el contrario, el FR fue el mejor sustrato para la AnfaeA, mostrando una actividad de 1.4 U mg-1, seguido de la AnfaeB cuya actividad fue 0.05 U mg-1. Con respecto a las faes, la Ancae y la TLL tuvieron una actividad específica 13 y 350 veces menor por FR (>0.004 U mg-1). En consecuencia, para los ensayos de competición se seleccionaron el FR y BR como competidores para la AnfaeA y AnfaeB, respectivamente. Dado que la Ancae es una enzima específica por
ACl no se encontró una referencia adecuada, por lo tanto, se descartó para los ensayos en competición.
Figura 5.5. Hidrólisis de diferentes ésteres de resorufina por diferentes carboxil éster hidrolasas. AR: Acetato de resorufina; BR: Butirato de resorufina; FR: Ferulato de resorufina. Actividades determinadas sobre 0.2 mM de sustrato, pH 7.2 y 30 °C.
5.6. Análisis comparativo de la especificidad y selectividad por sustrato de las feruloil esterasas de Aspergillus niger.
En la Figura 5.6 se muestra la especificidad (kcat1/Km1) y selectividad (kcat1/Km1/kcat2/Km2) por los metil hidroxicinamatos de las feruloil esterasas de Aspergillus niger. En general, se encontraron diferencias en ambos perfiles. El análisis indica que la selectividad de la AnfaeA por MS es 5.4 veces superior que por MF. Sin embargo, el coeficiente de especificidad relativo de AnfaeA da una muy buena aproximación a dicha selectividad, ya que indica que la especificidad por MS es 1.7 veces superior que por MF. Cabe resaltar que con los métodos HTSkcat/Km y Quick S se pudo evidenciar que la AnfaeA es una enzima especializada para hidrolizar tanto específica como selectivamente los sustratos metoxilados como el MS y MF respecto a los sustratos hidroxilados como el MpC y MC (Figura 5.6-A). De la misma manera, se demostró que la AnfaeB presenta una clara selectividad hacia los sustratos hidroxilados MpC y MC (Figura 5.6-B). En particular, la selectividad de la AnfaeB por MpC es 4.6 veces superior que por MC y el coeficiente de especificidad relativo da una muy buena aproximación a dicha selectividad, ya que indica que la especificidad por MpC es 1.8 veces superior que por MC.
Figura 5.6. Perfil de especificidad y selectividad de las feruloil esterasas de Aspergillus niger sobre los metil hidroxicinamatos. La especificidad se representa con las constantes de especificidad (kcat/Km)relativizadas y la selectividad con el coeficiente de selectividad α*= (kcat1/Km1/kcat-ref/Km-ref)/(kcat2/Km2/kcat-ref/Km-ref) determinado en presencia de FR 0.05 mM para la A) feruloil esterasa tipo A, y BR 0.2 mM para la B) feruloil esterasa tipo B.
MpC: Metil p-cumarato; MC: Metil cafeato; MF: Metil ferulato y MS: Metil sinapinato.
Con los resultados anteriores se confirma que los coeficientes de especificidad relativizados, determinados con el método HTSkcat/Km, son una alternativa rápida y confiable para estimar la selectividad de feruloil esterasas por ésteres de metil hidroxicinamatos.
5.7. Uso de un método cromatográfico para determinar el perfil de selectividad de la