El principio de los métodos espectrofotométricos de alto rendimiento (HTS) implementados en este trabajo, se basan en el decremento de la coloración amarilla de un indicador de pH, causado por la liberación de un ácido durante la hidrólisis de un éster, la cual es monitoreada espectrofotométricamente durante el curso de la reacción. El grupo de Kazlauzkas [64] demostró que este principio es cuantitativo; ya que la adición de concentraciones crecientes de HCl disminuyen la absorbancia de manera lineal, por efecto de la protonación del indicador de pH.
Además, es preciso porque el error experimental entre las pendientes teóricas y experimentales es menor al 5 %.
Ramírez y col. [111] desarrollaron un HTS bajo este principio para determinar la actividad de hidrólisis de tanasas, clorogenato esterasas y feruloil esterasas a pH 7.2, dado que estas hidrolasas alcanzan su máxima actividad a un pH cercano al neutro [8,78,112]. La similitud del pKa del par indicador-tampón, garantiza que ligeras variaciones de pH generen cambios de absorción significativos y lineales. Por lo tanto, Ramírez y col. [111] emplearon como indicador el 4-nitrofenolato (pNP; pKa 7.15). En las condiciones experimentales establecidas para el método (MOPS 2.5 mM pKa 7.2; pNP 0.5 mM; sustrato 5 mM; 2-propanol 10 % v/v) se observa una gran diferencia entre los coeficientes de extinción de las formas protonadas (sin color) y desprotonadas (color amarillo) del pNP, ofreciendo la mayor sensibilidad durante la determinación de la actividad de hidrólisis (límite de detección≥1.7 mU ml-1) [111]. Además, en estas condiciones la velocidad de reacción es proporcional a la concentración total de enzima.
Por lo tanto, durante la implementación de este tipo de métodos, es muy importante la elección de los sustratos y las condiciones experimentales a las que se realiza el ensayo, en particular, la concentración del tampon, indicador, co-solvente, pH, entre otros.
Por otra parte, el reconocimiento de los diferentes sustituyentes alrededor del anillo aromático de los ácidos hidroxicinámicos por las feruloil esterasas (faes) determina la especificidad por sustrato (kcat/Km) [21]. De manera práctica el perfil hidrolítico sobre los metil hidroxicinamatos (metil p-cumarato: MpC; metil cafeato: MC; metil ferulato: MF y metil sinapinato: MS), puede dar una aproximación a la selectividad por sustrato de las faes. Además, el perfil de hidrólisis de las cinamoil esterasas de Aspergillus niger sobre los metil ésteres esta ampliamente reportado
en la literatura [8,78,112]. Por lo tanto, con el fin de seleccionar un co-solvente que permita obtener un perfil similar al reportado en la literatura para las enzimas modelo hacia los metil hidroxicinamatos y ácido clorogénico (ACl), se evaluó en las condiciones establecidas por Ramírez y col. [111], el efecto de manera independiente de dos alcoholes (2-propanol: IPA y 2- metil-2-propanol: 2M2P) y dos solventes orgánicos polares (acetonitrilo: ACN y dimetilsulfóxido: DMSO; Figura 5.1).
En la Figura 5.1-A se muestra el efecto del co-solvente en el perfil hidrolítico de la AnfaeA sobre dichos sustratos. Independientemente del co-solvente, la mayor actividad relativa de la AnfaeA se obtuvo sobre MS (100 %), seguido del MF (38-48 %), MpC (0.2-0.5 %) y MC (0.1- 0.2 %), no detectando actividad sobre ACl. Si bien, el perfil hidrolítico de la AnfaeA MS>MF>MpC>MC no se alteró, la actividad específica más alta sobre los sustratos empleados se detectó con 2M2P. Aunque la actividad específica de hidrólisis de la AnfaeA por MC (0.3 U mg-1) es significativamente menor a la detectada sobre MS (147 U mg-1). Cabe resaltar que, a la fecha, únicamente mutantes de AnfaeA habían presentado actividad sobre MC [38]. Lo anterior fue posible debido a que el método analiza muestras homogéneas concentradas en proteína (de 2 a 50 mg ml-1) permitiendo descartar con mayor certeza la actividad de una fae hacia un sustrato determinado, tal es el caso de la actividad de hidrólisis de la AnfaeA por ACl.
Por otra parte, en el perfil hidrolítico de la AnfaeB se observaron variaciones en función del co- solvente (Figura 5.1-B). La mayor actividad relativa de la AnfaeB se obtuvo sobre MC (100 %), seguido del MpC (60-92 %), MF (5-10 %) y ACl (40-95 %), no detectando actividad sobre MS.
El mayor efecto del co-solvente se observó al analizar la relación de la actividad de hidrólisis de AnfaeB por MpC y ACl (MpC/ACl). Cuando se emplea el 2M2P la relación MpC/ACl es 0.95, es decir, prácticamente no existe diferencia en la velocidad de hidrólisis de ambos sustratos. Mientras que en presencia de ACN, IPA o DMSO la relación MpC/ACl es 1.2, 1.9 y 2.3, respectivamente; evidenciando la preferencia de hidrólisis de la AnfaeB por MpC con respecto al ACl. El cambio de perfil observado en AnfaeB con 2M2P no es nuevo, Faulds y col.
[39] reportaron un resultado similar para la feruloil esterasa tipo C de Talaromyces stipitatus (TsfaeC). En ausencia de co-solvente, la actividad de hidrólisis de la TsfaeC sobre MF es mayor que sobre MpC, pero la preferencia se invierte en presencia del 5 % o más de DMSO [39]. Sin embargo, de acuerdo a Levasseur y col. [78] el perfil de hidrólisis obtenido con el resto de los co-solventes es el característico para la AnfaeB (MC>MpC>ACl).
Figura 5.1. Efecto del co-solvente en el perfil hidrolítico de las cinamoil esterasas de Aspergillus niger. A) Feruloil esterasa tipo A. B) Feruloil esterasa tipo B. C) Clorogenato esterasa. Actividades determinadas a 30 °C, pH 7.2 con 10 % de co-solvente. IPA: 2-propanol; 2M2P: 2-metil-2-propanol; ACN: acetonitrilo y DMSO:
dimetilsulfóxido. MpC: Metil p-cumarato; MC: Metil cafeato; MF: Metil ferulato; MS: Metil sinapinato y ACl:
Ácido clorogénico.
Contrario a la AnfaeA, donde el 2M2P permite alcanzar la mayor actividad específica para los metil hidroxicinamatos, la AnfaeB mostró la mayor actividad específica por MpC (44 U mg-1) con DMSO; y para MC (56 U mg-1), MF (5 U mg-1) y ACl (27 U mg-1) con ACN. Faulds y col.
[39] reportaron por primera vez el efecto de los solventes orgánicos sobre la actividad de hidrólisis de faes por MF, concluyendo que los solventes tienen un efecto sobre los parámetros cinéticos de la enzima. Por lo tanto, para mayor comprensión del efecto de los co-solventes sobre la actividad de hidrólisis de AnfaeB por los metil ésteres y ácido clorogénico se requiere evaluar los parámetros cinéticos en cada condición de estudio.
En las condiciones experimentales, se observó por primera vez la actividad de la Ancae por los metil hidroxicinamatos (Figura 5.1-C). La Ancae mostró el mismo perfil hidrolítico que la AnfaeB (MC>MpC>MF). Sin embargo, a diferencia de la AnfaeB (MC>MpC>ACl>MF), la preferencia de hidrólisis de la Ancae por ACl es 500 veces superior sobre el resto de los sustratos
(ACl>MC>MpC>MF). Similar a la AnfaeA, el co-solvente no tuvo efecto sobre el perfil de hidrólisis de la Ancae. Sin embargo, la actividad específica de Ancae por ACl (9 U mg-1) fue 1.3, 1.6 y 2.2 veces mayor con DMSO que con 2M2P, IPA y ACN, respectivamente. Esto sugiere que la detección de la actividad clorogenato esterasas se facilita en presencia del DMSO.
Aunado a que el perfil de hidrólisis de AnfaeA y AnfaeB concuerda con lo reportado en la literatura, el DMSO se seleccionó como co-solvente para el desarrollo de los métodos de HTS.
5.3. Efecto del detergente y la presencia de cationes sobre el perfil hidrolítico de las