Capítulo 6: Estudio de la selectividad de esterasas y lipasas por ésteres de ácidos hidroxicinámicos
estructurales para una mejor comprensión del efecto de la cadena alquilo de los ésteres sobre la selectividad por sustrato y quimioselectividad de ambas hidrolasas.
6.3 Efecto de la longitud de la cadena alquilo en la selectividad por sustrato y
tan sólo 3.6 veces menor para butil sinapinato. Recientemente Schär y col. reportaron que el coeficiente de especificidad de la AnfaeA en la hidrólisis del decil ferulato (547 mM-1s-1) es 19 veces mayor que sobre metil ferulato (29 mM-1s-1). Contrario a nuestros resultados, este incremento se atribuye a un aumentó de 140 veces en la afinidad por sustrato de la AnfaeA, siendo de 1123 M para metil ferulato y 8 M para decil ferulato; ya que la kcat por el decil ferulato es 7 veces menor (4.6 s-1) [119]. Los resultados reportados en la literatura en conjunto con la evidencia generada durante el presente trabajo de investigación sugieren que la modificación de la longitud de la cadena alquilo del éster puede modular la selectividad por sustrato de la AnfaeA y que dicha modulación se puede deber a un cambio significativo en cualquiera de los dos parámetros cinéticos, kcato Km.
Tabla 6.2. Efecto de la longitud de cadena alquilo sobre los parámetros cinéticos de la feruloil esterasa tipo A de Aspergillus niger.
Sustrato kcat
(s-1)
Km
(mM)
MpC 0.29 9.3
MC 0.09 5.1
MF 37.4 3.4
MS 68.4 3.6
BpC 0.38 1.5
BC 0.32 1.5
BF 252 1.4
BS 3100 1.0
Por otra parte, el incremento de la cadena alquilo del sustrato incrementó el coeficiente de especificidad de la CalB de una manera más discreta que lo observado con AnfaeA (Figura 6.4- CalB). Al comparar los coeficientes de especificidad de CalB se reveló que la hidrólisis del propil p-cumarato (2.1×104M-1s-1), butil cafeato (5.2×103M-1s-1) y butil ferulato (1.3×104M-1s-
1) es 16, 13 y 20 veces más eficiente que la del respectivo metil éster. Además, es interesante resaltar que pese al incremento de la longitud de la cadena alquilo del sustrato, la CalB no presentó la capacidad de hidrolizar ésteres de sinapínico (Figura 6.4-CalB), contrario a lo
observado con la AtfaeB (ver sección 6.2). Esto último indica que, para la CalB, tanto la cadena alquilo como el sustituyente acilo juegan un papel determinante durante la interacción enzima- sustrato.
De los alquil ésteres evaluados, la CalB mostró ser más eficiente para hidrolizar el propil p- cumarato. Por lo tanto, los metil y propil ésteres se tomaron como modelo para realizar el análisis de los parámetros cinéticos de CalB (Tabla 6.3). Éste, reveló que tras el incremento de dos átomos de carbono en la cadena alquilo, ocurre un aumento de 2.2, 2.6 y 7.4 veces de la kcat
para el propil p-cumarato (2.1 s-1), cafeato (1.9 s-1) y ferulato (2.2 s-1), respectivamente.
Únicamente para el propil p-cumarato (0.1 mM) y cafeato (0.7 mM) se observó una disminución de 7 y 2.6 veces en la Kmcon respecto a los metil ésteres. Y es precisamente por el incremento en la afinidad de CalB por el propil p-cumarato que este sustrato se hidroliza con una mejor eficiencia.
Tabla 6.3. Efecto de la longitud de cadena alquilo sobre los parámetros cinéticos de la lipasa B de Candida antarctica.
Sustrato kcat
(s-1)
Km
(mM)
MpC 0.95 0.7
MC 0.72 1.8
MF 0.70 1.1
MS n.d. n.d.
PpC 2.1 0.1
PC 1.9 0.7
PF 5.2 1.2
PS n.d. n.d.
Tomando como modelo a la RML, Schär y col. reportaron que el coeficiente de especificidad de las lipasas en la hidrólisis del propil ferulato (0.012 mM-1s-1) es 2.4 veces mayor que sobre metil ferulato (0.005 mM-1s-1), atribuyéndolo al aumento de la kcaten 11 veces por el propil éster (0.022 s-1) [119]. Es importante mencionar que la RML empleada durante la investigación de
Schär y col. corresponde a la preparación comercial L4277 de SIGMA, y dado que la actividad de hidrólisis sobre los ésteres de AH de dicha preparación no corresponde a RML sino a otra proteína contenida en la preparación (ver capítulo 4), los resultados no pueden ser concluyentes.
En consecuencia, se puede considerar que los resultados obtenidos con el HTSkcat/Km para la CalB son la única evidencia científica, generada hasta el momento, que permite evaluar el efecto de la longitud de la cadena alquilo sobre la selectividad por sustrato de una lipasa. Siendo así, éstos indican que la selectividad por sustrato de CalB puede ser modulada significativamente al incrementar la afinidad de la enzima por el sustrato, lo cual puede lograrse con un aumento en la hidrofobicidad del éster.
Con el objetivo de ver si la modulación de la selectividad por sustrato descrita anteriormente, tiene una correlación con el acoplamiento del sustrato, se realizaron acoplamientos moleculares in silico con el metil y butil sinapinato para la AnfaeA (Figura 6.5) y con el metil y propil p- cumarato para la CalB (Figura 6.6).
Figura 6.5. Acoplamiento molecular de la feruloil esterasa tipo A de Aspergillus niger (PDB: 1USW) con metil y butil sinapinato. Cada recuadro muestra el acoplamiento de la proteína y un ligando específico (sustrato), así como la interacción de algunos residuos de aminoacidos situados dentro del sitio catalítico con partes específicas del sustrato. En una representación de superficie se muestra el acomodo del sustrato dentro del sitio activo (Esquina inferior izquierda de cada ligando). En color amarillo se indica el sustrato y la serina catalítica (S133), en azul la histidina (H247), en rosa el áspartato (D194), en rojo la tirosina 80 (Y80), en verde la treonina (T68) y la leucina (L134).
Se observó que el acoplamiento de los sustratos en la AnfaeA y CalB se da de manera diferente.
Mientras el metil y butil sinapinato se acoplan horizontalmente abarcando toda la cavidad en la misma dirección dentro del sitio catalítico de la AnfaeA; en la CalB, solamente el metil p- cumarato se acopla horizontalmente. Dado que el sítio catalítico de la CalB es muy estrecho,
conforme crece la cadena alquilo del éster el sustituyente fenólico se situa por fuera de la cavidad. Por lo tanto, el propil p-cumarato se acopla a través de la cadena acilo de manera perpendicular a la cavidad del sitio catalítico. Esta forma de acoplamiento sugiere que existe una estrecha relación entre el sustituyente fenólico del AH, la longitud de la cadena alifática y la distancia entre el enlace éster del sustrato y el grupo hidroxilo de la serina 105 con el incremento de la constante de especificidad de CalB. Lo anterior se sustenta al ver que la constante de especificidad para los ésteres de cafeico y ferúlico es mayor cuando la cadena alquilo tiene una longitud de cuatro átomos de carbono, mientras que para los ésteres de p- cumárico es mayor cuando la cadena alquilo presenta una longitud de tres y no de cuatro carbonos, fenómeno que no se observó con la AnfaeA (Figura 6.4).
Figura 6.6. Acoplamiento molecular de la lipasa B de Candida antarctica (PDB: 1TCA) con metil y propil p- cumarato. Cada recuadro muestra el acoplamiento de la proteína y un ligando específico (sustrato), así como la interacción de algunos residuos de aminoacidos situados dentro del sitio catalítico con partes específicas del sustrato. En una representación de superficie se muestra el acomodo del sustrato dentro del sitio activo (Esquina inferior izquierda de cada ligando). En color amarillo se indica el sustrato y la serina catalítica (S105), en azul la histidina (H224), en rosa el áspartato (D187) y la glutamina (Q157), en verde la treonina (T40).
Por otra parte, el acoplamiento molecular sugiere que la catálisis del metil y butil sinapinato llevada a cabo por la AnfaeA, requieren energías de acoplamiento similares (-6.65 kcal mol-1), a pesar de que la distancia entre la serina catalítica (S133) y el enlace éster del metil sinapinato está 0.9 Å más cerca comparada con el enlace éster del butil sinapinato. Además, no se observó diferencia en la distancia de los aminoácidos involucrados en la estabilización del anillo aromático del sustrato y del carbonilo [38], como tirosina (Y80: 3.0 Å), treonina (T68: 3.3 Å) y leucina (L134:5.15 Å; Tabla 6.4). Con el número de aminoácidos analizados, no se observó una correlación entre el acoplamiento del sustrato y la modulación de la selectividad por sustrato de la AnfaeA. Por lo anterior, es posible que otros aminoácidos esten involucrados en la
estabilización de la cadena alquilo del éster, ya que como se observa en la figura 6.5, ésta se acopla a una región diferente a la que ocupa el sustituyente acilo.
Tabla 6.4. Energias de acoplamiento y distancias determinadas durante el acoplamiento molecular de la AnfaeA con diferentes ligandos.
Distancia de los aminoacidos que interactuan con el ligando (Å)
Sustrato
Energía de acoplamiento
(kcal mol-1)
S133 Y80 T68 L134
MS -6.6 2.1 3.0 3.0 5.1
BS -6.7 3.0 3.0 3.0 5.2
De la misma forma, el acoplamiento molecular sugiere que la hidrólisis del metil y propil p- cumarato (Tabla 6.5) asistida por la CalB requiere energías de acoplamiento similares (-5.9 kcal mol-1). Sin embargo, los sustratos se acoplan completamente diferente en el sitio catalítico, observando que el hidroxilo de la serina catalítica (S105) está 1.4 Å más cercano al enlace éster del propil p-cumarato, asimismo la treonina (T40) que forma parte del agujero oxianión está 0.6 Å más cerca del oxígeno del cabonilo del propil p-cumarato, lo que posiblemente estabiliza más al sustrato. Por lo tanto, en este caso se observa una clara correlación entre el acoplamiento del sustrato y la modulación de la selectividad por sustrato. Sustentando la hipótesis de que al aumentar la hidrofobicidad del éster se modula, hasta cierto punto, la selectividad por sustrato de CalB.
Finalmente se evaluó el efecto de la longitud de la cadena alquilo sobre la quimioselectividad de la AnfaeA y la CalB. Para ello, se compararon las constantes de especificidad obtenidas sobre los metil y butil ésteres de AH para AnfaeA y los metil y propil ésteres de AH para CalB (Figura 6.7). La constante de especificidad de la AnfaeA por el metil sinapinato (1.9×104 M-1 s-1) fue 1.7 veces mayor que por el metil ferulato (1.1×104M-1s-1), mientras que la del butil sinapinato (3.1×106 M-1 s-1) fue 17 veces mayor que por el butil ferulato (1.8×105 M-1 s-1; Figura 6.7- AnfaeA). Como el incremento de la constante de especificidad es significativo se demuestra que la longitud de la cadena alquilo también permite modular la quimioselectividad de la AnfaeA.
Lo anterior sucede porque el incremento de la tasa de recambio (kcat) no tiene un incremento proporcional para los ésteres de sinapínico (metil: 68 s-1a butil: 3100 s-1) y ferúlico (metil: 37
s-1a butil: 252 s-1). Es decir, mientras la kcatdel butil sinapinato es 45 veces mayor a la del metil éster, la del butil ferulato es tan solo 7 veces mayor a la del respectivo metil éster.
Tabla 6.5. Energías de acoplamiento y distancias determinadas durante el acoplamiento molecular de la CalB con diferentes ligandos.
Distancia de los aminoacidos que interactuan con el ligando (Å)
Sustrato
Energía de acoplamiento
(kcal mol-1)
S105 T40 Q157
MpC -6.0 4.5 5.1 4.1
PpC -5.8 3.1 4.5 14.8
Por el contrario, la constante de especificidad de la CalB por el metil p-cumarato (1.3×103M-1 s-1) fue 2 veces mayor que por el metil ferulato (6.4×102M-1s-1), mientras que la del propil p- cumarato (2.1×104M-1s-1) fue 5 veces mayor por el propil ferulato (4.3×103M-1s-1; Figura 6.7- CalB). Lo anterior ocurre debido a que al incrementar la longitud de la cadena alquilo del sustrato la CalB aumenta 7.3 veces su afinidad por el propil p-cumarato (0.1 mM) respecto al metil éster, mientras que la afinidad por el metil y propil ferulato es la misma (1 mM; ver anexo D). Lo anterior demuestra, que similar a la modulación de la selectividad por sustrato, la elongación de la cadena alquilo también tiene un efecto modulador sobre la quimioselectividad de la CalB.
Figura 6.7. Efecto del sustituyente acilo de los ésteres de ácidos hidroxicinámicos sobre la selectividad. Se muestra la constante de especificidad (kcat/Km)sobre los metil y butil ésteres de ácidos hidroxicinámicos para la feruloil
esterasa tipo A de Aspergillus niger (AnfaeA) y sobre los metil y propil ésteres de ácidos hidroxicinámicos para la lipasa B de Candida antarctica (CalB).
6.4 Efecto del pH en la actividad de hidrólisis de esterasas y lipasas sobre los metil