La purificación de las proteínas se realizó por Fast Protein Liquid Chromatography, FPLC (por sus siglas en inglés). Durante este proceso, la concentración de proteína y la actividad enzimática se determinó como se explica más adelante en las secciones 3.8 y 3.12, respectivamente.
A continuación, se describe la estrategia de purificación desarrollada para cada proteína.
Feruloil esterasa tipo A de Aspergillus niger (AnfaeA)
10 l del sobrenadante de la fermentación de A. niger filtrados con papel filtro de 1 m se centrifugaron a 13 000 rpm. Posteriormente, la muestra se concentró 154 veces en un sistema Cogent M1TFF marca Millipore de nanofiltración tangencial con una membrana de celulosa regenerada de 10 kDa (corte nominal) marca Millipore a 4 °C. La muestra se diafiltró con 10 l de agua y se acondicionó con 2 l de tampón fosfatos 50 mM con EDTA 1 mM y sulfato de amonio 0.6 M a pH 7.0 (tampón de carga). Una tercera parte del concentrado (21.6 ml) se inyectó a un flujo de 1 ml min-1en una columna de interacción hidrofóbica pre-empacada con la resina fenil sefarosa 6 fast flow (FF) high sub con un volumen de columna (VC) de 20 ml, previamente equilibrada con 5 VC del tampón de carga. Posteriormente se hizo un lavado de 5 VC con el tampón de carga y las proteínas unidas se eluyeron en un gradiente de 6 VC decreciente en sulfato de amonio (0.6 a 0 M) a 5 ml min-1. Al término del gradiente, la composición del eluyente se mantuvo constante por 3 VC. La salida de la columna se colectó en fracciones de 10 ml.
Feruloil esterasa tipo B (AnfaeB) y clorogenato esterasa (Ancae) de Aspergillus niger
Ambas esterasas se expresaron con una etiqueta de 6 histidinas, esto permitió emplear la cromatografía de afinidad como único paso de purificación. Un volumen de 10 l del sobrenadante de cada fermentación de A. niger se filtró con papel filtro de 1m y se centrifugó a 13 000 rpm. Posteriormente, las muestras se concentraron 250 veces en un sistema Cogent M1TFF marca Millipore de nanofiltración tangencial con una membrana de celulosa regenerada de 30 kDa a 4 °C. Cada muestra se diafiltró dos veces con 10 l de agua y se acondicionó con 2 l del tampón de carga correspondiente. El tampón de carga empleado para la purificación de la AnfaeB y Ancae fue Tris-HCl 20 mM a pH 7 y Tris-HCl 30 mM con NaCl 150 mM a pH 7.5, respectivamente. Para la purificación de ambas proteínas, un volumen de 40 ml de muestra se inyectó a 1 ml min-1a una columna empacada manualmente con la resina niquel sefarosa 6 FF (VC: 26 ml) previamente equilibrada con 5 VC del tampón de carga. Para la purificación de la AnfaeB después de la inyección, la columna se lavó con 5 VC del tampón de carga y las proteínas unidas se eluyeron en un gradiente de 2 VC creciente en imidazol (0 a 130 mM), al término del gradiente la composición final se mantuvo por 5 VC a 1 ml min-1. Por otra parte, después de la inyección de la muestra de Ancae la columna se lavó con 5 VC del tampón de carga y se eluyó en un gradiente escalonado de imidazol de 18 VC (12 VC: 250 mM; 6 VC: 500 mM) a 5 ml min-1. En cada purificación, la salida de la columna se colectó en fracciones de 10 ml.
Feruloil esterasa tipo B (AtfaeB) y tipo C (AtfaeC) de Aspergillus terreus
Se realizó una producción de 1 l de cada proteína, cada una se precipitó con etanol 96 % en una relación 1:10 (v:v) a 4 °C. La muestra se centrifugó a 13 000 rpm por 20 min a 4 °C. Las pastillas se resuspendieron en 100 ml de tampón MOPS 2.5 mM a pH 7.2. La purificación de ambas enzimas se realizó empleando el siguiente protocolo. Un volumen de 100 ml se inyectó a 2 ml min-1en una columna de intercambio aniónico débil HiPrep dietil amino etil (DEAE) FF (VC:
20 ml) previamente equilibrada con 5 VC del tampón MOPS. La fracción no retenida se recuperó con 1 VC de tampón MOPS y se acondicionó con sulfato de amonio 0.5 M.
Posteriormente se inyectó a una columna preempacada con la resina fenil sefarosa 6 FF high sub (VC: 20 ml), previamente equilibrada con 5 VC de tampón MOPS 2.5 mM con 0.5 M de sulfato de amonio a pH 7.2 (tampón de carga). Posteriormente se hizo un lavado de 7 VC con el tampón de carga y las proteínas unidas se eluyeron en un gradiente de 10 VC decreciente en
sulfato de amonio (0.5 a 0 M) a 5 ml min-1. Al término del gradiente la composición del eluyente se mantuvo constante por 3 VC. La salida de la columna se colectó en fracciones de 10 ml.
Lipasa de Thermomyces lanuginosus (TLL)
Una producción de 100 ml se filtró en un equipo de ultrafiltración con una membrana de celulosa regenerada de 100 kDa (corte nominal) marca Millipore a 4 °C. Posteriormente el permeado se concentró 10 veces con una membrana de celulosa regenerada de 10 kDa (corte nominal) y se diafiltró dos veces con 500 ml de agua a 4 °C. Un volumen de 10 ml de la muestra se inyectó a 2 ml min-1en una columna de intercambio aniónico débil DEAE FF (VC: 20 ml) previamente equilibrada con 5 VC del tampón MOPS 2.5 mM pH 7.2 (tampón de carga). Posteriormente se hizo un lavado de 5 VC con el tampón de carga y las proteínas unidas se eluyeron en un gradiente de 10 VC creciente en NaCl (0 a 0.3 M) a 5 ml min-1. Al término del gradiente la concentración de NaCl se incrementó a 1 M y se mantuvo constante por 3 VC. La salida se colectó en fracciones de 10 ml.
Lipasa tipo B de Candida antarctica (CalB)
Una producción de 1 l se precipitó en frío con 331 g de sulfato de amonio y se centrifugó a 13 000 rpm por 10 min a 4 °C. La pastilla se resuspendió en 50 ml de tampón MOPS 2.5 mM con sulfato de amonio 1 M a pH 7.2 (tampón de carga). La muestra se inyectó a 1 ml min-1en una columna de interacción hidrofóbica empacada manualmente con la resina butil sefarosa 4 FF (VC: 200 ml) previamente equilibrada con 5 VC del tampón de carga. Posteriormente se hizo un lavado de 5 VC con el tampón de carga y las proteínas unidas se eluyeron con agua en un gradiente de 4 VC decreciente en sulfato de amonio (1 a 0 M) a 10 ml min-1. Al término del gradiente el flujo de agua se mantuvo por 4 VC. Finalmente se realizó un lavado de 3 VC con IPA 30 % (v/v) para recuperar la proteína unida fuertemente a la columna. Durante el proceso la salida de la columna se colectó en fracciones de 10 ml.
Lipasa de Rhizomucor miehei (RML)
Un volumen de 5 ml de la preparación comercial de la lipasa de Rhizomucor miehei se precipitó con etanol 96 % en una relación 1:10 (v:v) a 4 °C. La muestra se centrifugó a 13 000 rpm por 20 min a 4 °C. La pastilla se resuspendió en 5 ml de tampón fosfatos 20 mM a pH 7 (tampón de
carga) y se inyectó a 0.2 ml min-1en una columna HiPrep DEAE FF marca GE (VC: 20 ml) previamente equilibrada con 5 VC del tampón de carga. Posteriormente se hizo un lavado de 5 VC con el tampón de carga y las proteínas unidas se eluyeron en un gradiente de 5 VC creciente en NaCl (0 a 0.25 M) a 5 ml min-1. Al término del gradiente el eluyente se mantuvo 5 VC y posteriormente la concentración de NaCl se incrementó a 1 M por 5 VC más. Las fracciones con actividad lipasa se mezclaron, la muestra se acondicionó con sulfato de amonio 0.6 M y se centrifugó a 13 000 rpm durante 10 min a 4 °C. Un volumen de 30 ml de muestra se inyectó a una columna hidrofóbica fenil sefarosa 6 FF high sub (VC: 20 ml) previamente equilibrada con 5 VC de tampón fosfatos 20 mM con 0.6 M de sulfato de amonio a pH 7 (tampón de carga).
Posteriormente se hizo un lavado de 5 VC con el tampón de carga y las proteínas unidas se eluyeron en un gradiente de 5 VC decreciente en sulfato de amonio (0.6 a 0 M) a 5 ml min-1. Al término del gradiente la composición del eluyente se mantuvo constante por 5 VC, la salida se colectó en fracciones de 10 ml.
En todos los casos el grado de pureza de las fracciones que presentaron la mayor actividad específica se estimó por electroforesis en gel de poliacrilamida. Las fracciones que solamente contenían la proteína de interés se concentraron y diafiltraron con tampón MES 2.5 mM pH 6 con un filtro de celulosa regenerada de 10 kDa (corte nominal) para centrifuga a 2 500 g y 4 °C.
Una solución de proteína pura a 2 mg ml-1, como concentración mínima, se almacenó en microtubos de centrifuga de 200 µl en alícuotas de 20 µl a -40 °C hasta su posterior análisis.