Sesión Temática: Acuicultura Continental. Paneles
Genes de Lactococcus garvieae esenciales para el desarrollo
XI Congreso Nacional de Acuicultura
modelo infectivo de interacción bacteria-hospedador, mutantes en genes que son esenciales durante el desarrollo del proceso infeccioso. Estos mutantes presentan por ello, un crecimiento limitado en el hospedador y una virulencia atenuada en relación a la cepa parental.
La técnica de STM se desarrolla en dos etapas: una primera, a lo largo de la cual se construye una genoteca de mutantes portadores cada uno de una secuencia única de ADN denominada marca, que permite identificarlos de manera individual y diferenciarlos entre si; y una segunda, en la que se seleccionan aquellos mutantes de la genoteca que presentan un crecimiento limitado en el hospedador. La selección de estos mutantes se fundamenta en la disminución o ausencia de su crecimiento en el hospedador, como consecuencia de que tienen interrumpido algún gen necesario para el desarrollo del proceso infeccioso. Una vez seleccionados los mutantes de interés pueden ser identificados por su marca específica y los genes interrumpidos analizados.
El objetivo del presente trabajo fue la aplicación de la técnica de STM a L. garvieae, utilizando como hospedador la trucha arco iris, para la selección e identificación de genes esenciales durante el desarrollo del proceso infeccioso. De este modo, se analizó la interacción patógeno-hospedador utilizando un modelo semejante al que L. garvieae encuentra en la naturaleza.
Material y Métodos
Para el presente trabajo se utilizó la cepa de L. garvieae UNIUD074 (Dr. L. Gusmani, Universidad de Udine, Italia), y el plásmido pTV408 portador del transposón Tn917 (Slater et al., 2003). Las técnicas utilizadas para la manipulación genética de L. garvieae se realizaron siguiendo los protocolos descritos por Menéndez et al. (2006).
La construcción de la genoteca de mutantes marcados se realizó como fue descrito por Mei et al.
(1997). En total, se dispuso de 1.250 mutantes organizados en 25 conjuntos de entrada de 50 mutantes cada uno. Para la selección in vivo de los mutantes con un crecimiento limitado en el hospedador, cada conjunto de entrada se inyectó vía intraperitoneal en 2 truchas arco iris con un peso entre 10 y 15 g. Tras 72 horas del inicio de la infección, los animales se sacrificaron y se diseccionaron, las células bacterianas recuperadas a partir de sus órganos internos constituyeron los conjuntos de salida. Los mutantes con crecimiento limitado en el hospedador, se seleccionaron comparando las marcas presentes en los conjuntos de salida con respecto a las del conjunto de entrada, tal y como describieron Hensel et al. (1995). La identificación de la región del cromosoma donde había tenido lugar la integración del transposón Tn917, se determinó mediante secuenciación tal y como fue descrito por Menéndez et al. (2006). Finalmente, la atenuación en la virulencia de algunos de los mutantes seleccionados se confirmó con los ensayos in vivo. Para ello, se realizaron infecciones mixtas cepa parental-cepa mutante y se calculó el índice de competencia in vivo.
Resultados
Entre los 1.250 mutantes analizados, se seleccionaron un total de 29 mutantes cuya marca presentaba una señal disminuida en los 2 conjuntos de salida con respecto al conjunto de entrada.
Este número de mutantes seleccionados representó un 2,3% del total. El ADN cromosómico que flanqueaba el lugar donde se insertó el transposón Tn917, se recuperó en los 29 mutantes seleccionados con crecimiento limitado in vivo y se secuenció. Las secuencias parciales obtenidas se compararon con las presentes en la base de datos GenBank mediante el programa informático Blastx. De los 29 mutantes seleccionados, 20 presentaron la inserción del transposón Tn917 en secuencias de ADN que codificaban proteínas que tenían identidad con otras de función conocida presentes en las bases de datos. Cinco mutantes tenían interrumpidas secuencias cuyos productos de traducción presentaban identidad con proteínas de función desconocida. Por último, las secuencias interrumpidas en cuatro de los mutantes no mostraron ninguna semejanza con secuencias conocidas. Algunos de los resultados obtenidos aparecen recogidos en la Tabla I.
Por otra parte, se consideraron mutantes con virulencia atenuada a aquellos que presentaron un
Sesión Temática: Acuicultura Continental. Paneles IC in vivo (índice de competencia in vivo) inferior a 1. Así, siguiendo este criterio se identificaron como atenuados 12 mutantes entre un total de 13 analizados (92%) (Tabla I). El mutante VII se consideró como un falso positivo (Tabla I).
Discusión
La utilización de la técnica de STM permitió obtener 29 mutantes con crecimiento limitado in vivo. El análisis de las secuencias aminoacídicas deducidas a partir de los genes interrumpidos en estos 29 mutantes, reveló la presencia de identidades con proteínas implicadas en diversos procesos celulares y con otras de función desconocida.
El ambiente nutricional del hospedador puede en algunos casos inducir la síntesis de nuevos aminoácidos, cofactores y nucleótidos. Por ese motivo, es habitual identificar mediante la técnica de STM mutantes auxótrofos. Este podría ser el caso de los mutantes I y VIII (Tabla I), en los que los genes interrumpidos codificaban proteínas con identidad con la asparragina sintetasa A (asnA), que cataliza la conversión de aspartato a asparragina en presencia de amonio y ATP. Por otra parte, es interesante dejar patente que la habilidad para adaptarse al ambiente del hospedador es clave en la patogenicidad. Por este motivo, es lógico que mutantes en genes implicados en rutas metabólicas muestren una virulencia atenuada. Un ejemplo de ello es el mutante IV (Tabla I). La secuencia de aminoácidos deducida del gen interrumpido en dicho mutante, mostró identidad
Cepa Identidad Posible función IC in vivo
I AsnA/Clostridium perfringens Síntesis del aminoácido asparragina ND
II GidC/Lactococcus lactis Regulador translacional 0,3
III ChiA/Lactococcus lactis Posible proteína de unión y
degradación de carbohidratos 0,09
IV Als/Lactococcus lactis Alfa-acetolactato sintasa 0,14
VI MerR/Enterococcus faecium Regulador transcripcional 0,03
VII Xre/Lactococcus lactis Regulador transcripcional 0,95
VIII AsnA/Lactobacillus salivarius Síntesis del aminoácido asparragina 0,2
X YrbI/ Lactococcus lactis Regulador transcripcional ND
XVII XerC/Streptococcus pneumoniae Integrasa-recombinasa 0,34 XVII DltA/ Lactococcus lactis Incorporación de D-alanina al
acido lipoteicoico ND
XIX GlnP/Lactococcus lactis Transporte de glutamina < 0,01 XXI DprA/ Lactococcus lactis Proteína implicada en competencia
natural ND
XXIV Proteína hipotética /
Lactococcus lactis Proteína con un dominio EAL ND XXV Proteína hipotética /
Lactococcus lactis
Hipotética acetiltransferasa posiblemente involucrada en
supervivencia intracelular
0,01 Tabla I. Identidad de las proteínas codificadas por los genes interrumpidos en algunos de los mutantes de L. garvieae seleccionados y valores del IC in vivo (índice de competencia in vivo).
ND: no determinado
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con la alfa-acetolactato sintasa. Este enzima forma parte de la ruta de fermentación butilen glicólica y cataliza la síntesis de alfa-acetolactato a partir de piruvato.
Los sistemas de transporte de nutrientes parecen ser cruciales en la supervivencia de los microorganismos patógenos en el hospedador, puesto que es frecuente el aislamiento de mutantes en genes relacionados con estos sistemas en las diferentes bacterias a las que se ha aplicado la técnica de STM. Así, parece ser de vital importancia para la supervivencia de L. garvieae en el hospedador el transporte de glutamina, como lo demuestra el mutante XIX (Tabla I).
Los genes interrumpidos en los mutantes VI y X de L. garvieae es probable que regulen la expresión de genes esenciales durante el proceso infeccioso, en respuesta a algunas de las condiciones ambientales que se den en el pez. Hay que destacar el mutante XXIV, cuyo estudio en profundidad es de gran interés. Dicho mutante presentó interrumpido un gen que codifica una proteína portadora del dominio EAL. Aunque en general este tipo de proteínas están poco estudiadas, se sabe que juegan un papel importante en la virulencia al regular diversas funciones esenciales durante el proceso de infección.
El hecho de que los genes seleccionados mediante la técnica de STM estén implicados en funciones diversas sugiere que la infección es un proceso multifactorial con la implicación especifica de un gran numero de sistemas bacterianos. Esto es lo que sucede con el producto de los genes interrumpidos en los mutante XVII, XVIII, XXI y XXIV.
Conclusiones
El análisis de los productos de las secuencias interrumpidas por el transposón Tn917 en cada uno de los mutantes seleccionados, mostró el carácter multifactorial del proceso infeccioso de L.
garvieae. En dicho proceso, participan genes implicados en rutas metabólicas, en sistemas de transporte, en regulación y en diversos procesos celulares, además de otros de función desconocida.
Por otra parte, se mostraron algunas de las necesidades de L. garvieae para crecer en el hospedador.
Entre estas necesidades están la síntesis de asparragina, el transporte de glutamina y la activación de la ruta de fermentación butilen glicólica.
Los resultados obtenidos en este trabajo constituyen el primer acercamiento a los mecanismos de patogenicidad específicos de esta bacteria. En la actualidad, se está llevando a cabo el estudio en profundidad de algunos de los mutantes seleccionados.
Bibliografía
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Mei, J.M., F. Nourbakhsh, C.W. Ford y D.W. Holden. 1997. Identification of Staphylococcus aureus virulence genes in a murine model of bacteraemia using signature-tagged mutagenesis. Mol.
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Menéndez, A., B. Mayo y J.A. Guijarro. 2006. Construction of transposition insertion libraries and specific gene inactivation in the pathogen Lactococcus garvieae. Res. Microbiol. 157: 575-81.
Slater, J.D., A.G. Allen, J.P. May, S. Bolitho, H. Lindsay y D.J. Maskell. 2003. Mutagenesis of Streptococcus equi and Streptococcus suis by transposon Tn917. Vet. Microbiol. 93: 197-206.
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