Obtención de las muestras de queso añejo de Zacazonapan

Las piezas de queso se obtuvieron en dos queserías de Zacazonapan, Estado de México, México (codificadas como A y B). La quesería A fue seleccionada por su proceso de elaboración tradicional, y la B por el grado de estandarización durante su proceso tradicional. En cada quesería, a partir de un lote de leche cruda de bovino cuajado en la misma tina se elaboraron piezas de queso (1 kg) y cada pieza se consideró una unidad experimental. Los quesos se trasladaron al Departamento de Ingeniería Agroindustrial de la Universidad Autónoma Chapingo (UACh) y se conservaron a una temperatura de 15 °C y humedad relativa de 85 %. Seis piezas de queso (tres del queso A y tres del queso B) se colectaron y analizaron a los 0, 30, 95 y 180 días de maduración. Las unidades experimentales usadas en las tres repeticiones se elaboraron en días consecutivos.

6.3.3. Extracción de compuestos solubles en agua

La extracción de los compuestos solubles se realizó de acuerdo a la metodología descrita por (Rae, Phillips, & Kailasapathy, 2010), con modificaciones respecto a

131 la homogenización, tiempo de centrifugación y ajuste de pH. 250 g de queso se homogeneizaron con 750 mL de agua destilada durante 5 min en una licuadora (Osterizer, Wisconsin, EE. UU.). La mezcla se agitó a 150 rpm durante 1 h a 40

°C en una incubadora orbital (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU.), después el pH de la mezcla se llevó a 4.5 utilizando HCl 1 M. La mezcla se centrifugó a 8801 g por 10 min a 4 °C (Centrifuga Eppendorff 5810, Hamburgo, Alemania). Enseguida la capa superior de grasa y el sedimento se descartaron, mientras que el extracto soluble en agua se filtró a gravedad por medio de una capa de algodón, y después se filtró bajo condiciones de vacío usando papel Whatman No. 42. Los extractos se almacenaron a -20 °C.

6.3.4. Liofilización de los extractos solubles

Los extractos congelados se colocaron en nitrógeno líquido por 10 min y se liofilizaron en un equipo FreeZone 2.5 (Labconco Corporation, Kansas, EE. UU.) a una presión de 0.015 mbar y una temperatura de -50 °C.

6.3.5. Composición proximal de extractos liofilizados de queso añejo de Zacazonapan

Determinación de humedad y cenizas en extractos liofilizados

La humedad y cenizas se realizaron con el método descrito por Kirk, Sawyer, &

Egan (2002). Las determinaciones se llevaron a cabo por triplicado y los resultados se reportaron en g·100 g^-1 de extracto.

Determinación de carbohidratos en extractos liofilizados

Los carbohidratos se realizaron con el método descrito por Dubois, Giles, Hamilton, Rebers, & Smith (1956). Las determinaciones se realizaron por triplicado y los resultados se expresaron como g·100 g^-1 de extracto liofilizado.

132 Determinación de lípidos en extractos liofilizados

Los lípidos se determinaron por el método de Folch, Lees, & Stanley (1957). Las determinaciones se realizaron por triplicado y los resultados se expresaron en g·100 g^-1 de extracto liofilizado.

Perfil de aminoácidos y aminoácidos libres en extractos liofilizados

La determinación de aminoácidos se llevó a cabo como lo describe (Alaiz, Navarro, Girón, & Vioque (1992). Los extractos liofilizados se sometieron a una hidrólisis ácida colocando 2 mg de cada liofilizado con 8 μL D, L-α- ácido aminobutírico 6.2 mM como estándar interno y 1 mL de HCl 6 N, las mezclas se incubaron en horno a 110°C durante 20 h (EC33, Ríos Rocha S. A., Ciudad de México, México). Después, la disolución se burbujeó con nitrógeno, en un baño maría a 80 °C (J. P. Selecta, Barcelona, España), con el fin de eliminar el HCl(g). Enseguida se derivatizó el residuo sólido adicionando 1 mL de amortiguador borato 1 M a pH 9, más 1 μL de dietil etoximetilenmalonato concentrado (pureza

≥ 98 %). Las muestras se incubaron a 50 °C durante 50 min en un bloque de calentamiento SHT100 (Bibby Stuart Scientifica, Staffordshire, Reino Unido), la disolución se centrifugó a 829 g durante cuatro min (Centrifuga 5415R, Eppendorf, Hamburgo, Alemania). Una curva de cada aminoácido (50-2000 pM) se realizó bajo las mismas condiciones.

Finalmente, las muestras se inyectaron en un HPLC, integrado por un módulo de separación modelo 126, un inyector tipo válvula de reodine, un detector UV-Vis modelo 166 (Beckman-Coulter, EE. UU.) y una columna de fase reversa Nova- Pack C18 (300 x 3.9 mm, 4 mm; Waters, EE. UU.). 15 μL de muestra se inyectaron, el flujo de corrida fue de 0.9 mL·min^-1, en condiciones de gradiente a una temperatura de 18 °C, utilizando una disolución A (25 mM de acetato de sodio y 0.02 % de azida de sodio a pH 6) y una disolución B (acetonitrilo). Las condiciones del gradiente fueron las siguientes: 0 - 3 min, un gradiente lineal partiendo de A - B (91:9) hasta A - B (86:14); 3 - 13 min elución con A - B (86:14);

133 de 13 - 30 min gradiente lineal de A - B (86:14) hasta A - B (69:31); 30 - 35 min elución con A - B (69:31). Mientras que, la determinación del triptófano se llevó a cabo como lo describe Yust et al. (2004) con modificaciones, ya que se incrementó en 10 °C la temperatura de incubación y se anexó un proceso de centrifugación. Una hidrólisis básica se realizó colocando 2 mg de extracto liofilizado y 3 mL de NaOH 4 N en un tubo de ensayo, enseguida la disolución se incubó durante 4 h a 100 °C (EC33, Ríos Rocha S. A., Ciudad de México, México). Después, ésta se centrifugó a 829 g por cuatro min (Centrifuga 5415R, Eppendorf, Hamburgo, Alemania) y 20 µL del centrifugado se inyectaron en un HPLC (Beckman-Coulter, EE. UU.) cuyas características se mencionaron anteriormente. La elución se realizó con un flujo isocrático binario compuesto por acetato de sodio 25 mM, azida de sodio 0.02 % (p/v) a pH 6 (disolución A) y acetonitrilo (disolución B) en una relación 91:9 con un flujo de 0.9 mL·min^-1. Todas las determinaciones se llevaron a cabo por triplicado a una longitud de onda de 280 nm. La adquisición de datos y el procesado de los mismos se realizaron mediante el programa informático 32 Karat versión 7.0 (Beckman-Coulter, EE.

UU.).

La determinación de los aminoácidos libres se realizó con la metodología descrita por Megías et al. (2015), con modificaciones que consistieron en una menor centrifugación después de la extracción, y la sustitución de ácido acético por acetato de sodio en la fase móvil. A 2 mg de extracto liofilizado se adicionaron 24 μL de patrón interno (ácido D-h-α- aminobutírico 6.2 mM) y 1 mL de etanol al 30

% (v/v). Esta mezcla se agitó durante 30 min a 300 rpm en agitador orbital (SSM1, Bibby Sterilin LTD., Staffordshire, Reino Unido) a temperatura ambiente (25 ±1

°C). Después la mezcla se centrifugó a 829 g durante cuatro min (Centrifuga 5415R, Eppendorf, Hamburgo, Alemania). La fase líquida se extrajo y al pellet formado se le adicionó nuevamente 1 mL de etanol al 30 % (v/v), esta mezcla se agitó y se centrifugó bajo las mismas condiciones. Las fases liquidas obtenidos se sometieron a sequedad con nitrógeno en un baño maría a 80 °C (J. P. Selecta, UNIVEA, Barcelona, España). Enseguida se llevó a cabo la derivatización de las

134 muestras adicionando al residuo sólido 3 mL de amortiguador borato de sodio 1 M a pH 9 y 2 μL de dietil etoximetilenmalonato concentrado (pureza ≥ 98 %), la mezcla se incubó a 50 °C durante 50 min en un bloque de calentamiento SHT100 (Bibby Stuart Scientifica, Staffordshire, Reino Unido). Seguidamente, la mezcla se centrifugó a 829 g durante cuatro min (Centrifuga 5415R, Eppendorf, Hamburgo, Alemania) y 20 µL de sobrenadante se inyectaron en un HPLC cuyas características se mencionaron anteriormente. La determinación se realizó a una temperatura de 18 °C, un flujo de 0.9 mL·min^-1, con un gradiente conformado por la disolución A (25 mM de acetato de sodio y 0.02 % de azida de sodio a pH 6) y acetonitrilo como disolución B. Las condiciones del gradiente fueron las mismas que se utilizaron para la determinación del perfil de aminoácidos de la hidrólisis ácida. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado y los resultados se reportaron en g·100 g^-1 de extracto liofilizado. La adquisición y procesamiento de datos se realizó mediante el software 32 Karat 7.0 (Beckman-Coulter, EE. UU.).