En el caso de CE-SSCP, el fragmento 28S LSU D7 proporcionó la mejor resolución para separar nueve especies de dinoflagelados. Para CE-SSCP, la región LSU D7 proporcionó la mejor resolución para separar e identificar nueve especies de dinoflagelados dañinos. Cebadores utilizados en este estudio para los diferentes enfoques metodológicos (AFD, CE‐SSCP, HRM e IES).
ITS 1 y D) ITS 2
INTRODUCCIÓN
Tal es el caso de la diatomea Pseudo‐nitzschia pungens, que se presenta en dos variedades, una tóxica y otra no tóxica: las dos no pueden distinguirse entre sí mediante microscopía óptica (Smith et al. 1990). El formato CE-SSCP se ha utilizado para estudiar la composición microbiana en muestras ambientales, especialmente en la fracción de bacterioplancton (Ghiglione et al. Las sondas de ADN suelen tener de 18 a 25 pb de longitud, es necesario probar su especificidad para evitar falsos positivos ( Diercks et al 2008).
ANTECEDENTES
Estudios realizados en septiembre de 2007 por el Instituto Nacional de Pesca (INAPESCA) a través del Centro Regional de Investigaciones Pesqueras de La Paz (CRIP La Paz) y el Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste S.C. CIBNOR), mostró una disminución del 40% en su abundancia. La lista de referencia taxonómica de microalgas nocivas de la Comisión Oceanográfica Intergubernamental (COI) de la UNESCO incluye 13 especies del género Prorocentrum: Prorocentrum arabianum, P. Como ocurre con otras especies de microalgas nocivas, la identificación a nivel de especie dentro de este género es compleja. y se basa principalmente en la forma del cuerpo, el tamaño, la relación largo-ancho, la forma y posición de la columna parietal, la ornamentación y la densidad de los poros en las válvulas principales; pero algunas señales.
JUSTIFICACIÓN
HIPÓTESIS
OBJETIVOS
MATERIALES Y MÉTODOS
Al alinear las secuencias generadas en este estudio con las secuencias correspondientes a los genomas 18S y 28S disponibles en GenBank y en la base de datos del Proyecto Ribosomal (RDP) usando el programa ARB (Ludwig et. al., 2004) se obtuvieron dos conjuntos de sondas de hibridación. diseñado. Por lo tanto, utilizando las secuencias generadas en este estudio (Tabla II) y las secuencias disponibles en GenBank, se realizó un análisis de alineamiento múltiple para las regiones ribosómicas 18S SSU, ITS 1 ‐5.8S‐ ITS 2, 28S LSU D1‐D2 y Cytb usando Software Clustal X versión 2.0.11. Nuestra base de datos estuvo compuesta por las secuencias de nucleótidos de las regiones: i) ITS 1-5.8S rDNA-ITS 2 y ii) 28S LSU D1-D2, obtenidas mediante amplificación de fragmentos discretos (DFA) (Sección 6.3), así como secuencias de nucleótidos bentónicos. Prorocentrales disponibles en Genbank, se seleccionó el ciliado Toxoplasmas gondii como grupo externo (Apéndice 3).
RESULTADOS
Por otro lado, el perfil HRM del fragmento ITS 1 (Fig. 11 C) generó múltiples picos para algunas de las especies, mientras que el perfil del fragmento ITS 2 (Fig. 11 D) generó picos únicos para las especies. Incluso es posible separar 3 cepas de la especie P. La Tabla V muestra las características generales de los dos lotes de sondas oligonucleotídicas diseñadas con el software ARB, en base a las secuencias completas y parciales de las subunidades ribosómicas pequeñas (18S SSU). ) y grandes (28S LVE) de dinoflagelados disponibles en bases de datos internacionales y los generados en este estudio. La especificidad teórica de las sondas se calculó utilizando la función Match (ARB), para ser aplicada en formato de microarrays (primer lote) y en formato de células completas (WCFISH) a filtros de policarbonato (segundo lote de sondas).
Las Figuras 12 y 13 presentan los resultados obtenidos para la hibridación de microarrays utilizando ARN de la especie P. Un problema recurrente en la metodología WC-FISH es cuando la señal de autofluorescencia de las células es tan fuerte que enmascara la señal de hibridación. Por esta razón, en este estudio se utilizaron filtros de "paso largo", ya que nos permiten distinguir entre la señal de autofluorescencia y la señal verdadera de la sonda.
Al realizar la estandarización de las condiciones de hibridación sobre filtros de policarbonato utilizando la sonda PmacuSSU, se observó que uno de los cuellos de botella es la alta señal de autofluorescencia de P. Control de autofluorescencia (sin sonda) de las células de Prorocentrum maculosum, visualizadas con "paso largo" . "filtros. La banda intercalar (Fig. 24, paneles cyd) es lisa y aparece como una cresta alrededor de la celda.
En cada una de las placas, excepto en la placa "8", se pudo observar la presencia de poroides (tipo poro), pero la forma de estas decoraciones difiere entre las células de un mismo cultivo. Las células presentan un pirenoide situado en la zona central de la célula, y el núcleo se presenta en la parte posterior junto al pirenoide (Fig. 27). Los subclados muestran un gran acuerdo con las regiones de recolección de muestras.
DISCUSIÓN
- CE‐ SSCP
Varios estudios han concluido que a medida que aumenta la longitud de los fragmentos de ADN, disminuye la sensibilidad de la detección de mutaciones CE-SSCP (Ren, 2002). El contenido de GC de la secuencia de ADN también parece tener cierta influencia en la facilidad de detectar mutaciones con CE-SSCP. Además, se permite el uso de fragmentos de ADN como plantilla, reduciendo tanto el efecto de los inhibidores como los errores de la ADN polimerasa (Zinger et al. 2006).
En general, diferentes productos de PCR tienen diferentes temperaturas de disociación, dependiendo de su relación GC/AT, tamaño y composición de la secuencia y temperatura de operación, entre otros (Ririe et al. 1996; Talmi et al. 2010). La falta de especificidad de la sonda puede atribuirse a su diseño inadecuado o a una identificación incorrecta de la especie a partir de la cual se realiza el diseño; Por tanto, sería recomendable rediseñarlo utilizando el software ARB (Ludwing et al. 2004). Debe encontrarse en el medio de la secuencia de la sonda, también se recomienda tener una sonda competidora (oligonucleótido sin marcar) y si es posible la temperatura de disociación (Tm) debe ser inferior a 50 °C (temperaturas más altas pueden dañar las células).
Macmanus y Katz (2009) alientan a los taxónomos a realizar esfuerzos para incorporar información molecular en descripciones formales de especies; del mismo modo que anima a los biólogos moleculares a realizar un estudio más extenso de los organismos de los que se obtienen las secuencias de nucleótidos. Estos valores son similares a los reportados por Edvarsen et al. 2003) quienes, basándose en secuencias LSU, encontraron poca o ninguna variabilidad interespecífica para especies del género Dinophysis aisladas de dos localidades de la costa sur de Noruega en diferentes épocas del año, con valores entre las especies fototróficas Dinophysis acuminata, D. 2007) compararon las secuencias parciales de LSUrDNA para la especie P. Murray (utilizadas en el artículo de Nagahama et al. 2011), se determinaron los valores de distancia genética y número de diferencias de nucleótidos para un fragmento de 537 pb de la especie P. .
Mientras que para el alineamiento agrupado los valores de distancia genética disminuyeron a cero entre las cepas aisladas del área de Florida-Cuba, los valores entre las cepas del área de Belice y Florida-Cuba fueron del 1,0%.
CONCLUSIONES
LITERATURA CITADA
- ANEXOS
A review of molecular evidence for ballast water entry of the toxic dinoflagellates Gymnodinium catenatum and Alexandrium. Morphology and taxonomy of Prorocentrum mexicanum and restoration of Prorocentrum rhatymum (Dinophyceae) J. Red tide in Mexico: a review. of the UNESCO IOC 7th International Conference on Toxic Phytoplankton. Monitoring the activity dynamics of an anaerobic digester bacterial community using 16S rRNA polymerase reaction single-strand conformation polymorphism analysis.
Spatial and temporal scales of variation in bacterioplankton community structure in the NW Mediterranean. Development and application of Fluorescence in situ hybridization (FISH) method for simple and rapid identification of the toxic dinoflagellate Alexandrium tamarense and Alexandrium catenella in culture and natural seawater. Development of specific rRNA probes to distinguish geographic clades of the Alexandrium tamarense species complex.
High-level dinoflagellate diversity in the natural environment revealed by DNA barcoding assessment of mitochondrial cox1 and cob dinoflagellate barcoding. Species boundaries in the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima (Dinophyceae, Prorocentrales), based on morphological and phylogenetic characters. Development and evaluation of a PCR-based assay for the detection of the toxic dinoflagellate, Gymnodinium catenatum (Graham) in ballast water and environmental samples.
Major differences between bacterial diversity and activity inside and outside natural iron-fertilizing phytoplankton blooms in the Southern Ocean.
Anexo 3. Secuencias de Prorocentrales bentónicos utilizados en análisis filogenéticos
Anexo 4. Analisis morfológico de Prorocentrum maculosum
Borde engrosado (brida gruesa): la parte que sobresale de la valva derecha es visible principalmente en el borde de la excavación periflagelar. Es una extensión de la banda intercalar presente en la válvula izquierda a lo largo del margen anterior y rodeando la región periflagelar. Flagelo: Estructura en forma de bandera que emerge de la célula y es responsable de impulsar las células en fluidos líquidos.
Pirenoide: estructura citoplasmática predominantemente proteica incluida en los cloroplastos de la mayoría de los organismos fitoflagelados. Con la excepción de los retrovirus que tienen ARN, el ADN codifica información para la reproducción y función celular y para la replicación de la propia molécula de ADN. Representa el respaldo o almacén de la información genética primaria, que en las células eucariotas está confinada a la bóveda del núcleo.
El ARN suele ser producto de la transcripción a partir de un molde de ADN, aunque en los retrovirus el ARN actúa como molde y el ADN actúa como copia. Cebador: Pequeña cadena de nucleótidos a partir de la cual la ADN polimerasa inicia la síntesis de una nueva molécula de ADN. Distancia genética: Medida de la diferencia de material genético entre diferentes especies o individuos de una misma especie.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): Técnica para copiar una secuencia de ADN hasta obtener una cantidad deseada (normalmente una cantidad que permita estudiarla y caracterizarla).
